总蛋白测定与线性范围试验课件

血清总蛋白（血清总蛋白（TP）测定）测定与线性范围试验与线性范围试验一、血清总蛋白（一、血清总蛋白（TP）测定）测定二、与线性范围试验二、与线性范围试验实验目的：实验目的：v掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理、方法v熟悉熟悉722分光光度计的使用分光光度计的使用v了解了解TP测定的临床意义测定的临床意义一、血清总蛋白（一、血清总蛋白（TP）测定）测定+Cu2+OH-CO(NH2)2+CO(NH2)2 1.实验原理实验原理缩合缩合紫红色化合物紫红色化合物双缩脲反应：双缩脲反应：H2N-OC-NH-CO-NH2 OH-蛋蛋白白质质分分子子中中的的肽肽键键 +铜铜离离子子 紫紫红红色色复复合合物物 （-CO-NH-）Cu2+v紫紫色色复复合合物物在在540nm波波长长有有特特定定的的吸吸收收峰峰，其其颜颜色色的深浅的深浅与蛋白质的与蛋白质的浓度浓度在一定范围内在一定范围内成正比。成正比。v此此反反应应和和2个个尿尿素素分分子子缩缩合合后后生生成成的的双双缩缩脲脲在在碱碱性性溶溶液液中中与与Cu2+作作用用生生成成紫紫红红色色复复合合物物的的反反应应相相似似，故称双缩脲反应。故称双缩脲反应。2.双缩脲法测定总蛋白的原理双缩脲法测定总蛋白的原理 3.实验材料实验材料v试剂：试剂：（1）商品双缩脲试剂；）商品双缩脲试剂；（2）待测血清；）待测血清；（3）总蛋白标准液（）总蛋白标准液（70.0g/L）。）。v器材：器材：试管、加样枪、吸量管试管、加样枪、吸量管、水浴箱、水浴箱、722分光光度计分光光度计4.实验方法实验方法取取 5支试管，按下表操作：支试管，按下表操作：另取另取5支试管，按下表操作：支试管，按下表操作：混混匀匀，37，水水浴浴10min，540nm波波长长，以以空空白白管调管调T 100%、A“0”，测定各管吸光度值，测定各管吸光度值A，记录。，记录。5.实验结果实验结果v参考值：参考值：6082g/L6.注意事项注意事项v样样品品中中TPTP含含量量超超过过100.0g/L100.0g/L则则用用蒸蒸馏馏水水稀稀释释后后测测定定，结果乘以稀释倍数。结果乘以稀释倍数。v黄黄疸疸、溶溶血血标标本本对对本本法法有有干干扰扰，故故用用标标本本空空白白管管来来消除。消除。v取量要准确，操作要规范。取量要准确，操作要规范。7.总蛋白测定的临床意义总蛋白测定的临床意义v血清总蛋白浓度增高见于：血清总蛋白浓度增高见于：（1）蛋白质合成增加（如多发性骨髓瘤）；）蛋白质合成增加（如多发性骨髓瘤）；（2）血浆浓缩（如呕吐、腹泻、高烧）。）血浆浓缩（如呕吐、腹泻、高烧）。v血清总蛋白浓度降低见于：血清总蛋白浓度降低见于：（1）蛋白质合成障碍（如肝严重受损）；）蛋白质合成障碍（如肝严重受损）；（2）蛋白质丢失增加（如严重烧伤、肾病综合征）；）蛋白质丢失增加（如严重烧伤、肾病综合征）；（3）营营养养不不良良或或消消耗耗增增加加（如如低低蛋蛋白白饮饮食食、严严重重结核病、甲亢）；结核病、甲亢）；（4）血液稀释。）血液稀释。8.思考题思考题v（1）氨基酸可以用双缩脲法测定吗？为什）氨基酸可以用双缩脲法测定吗？为什么？么？v（2）蛋白质的呈色反应除双缩脲法外，还）蛋白质的呈色反应除双缩脲法外，还有哪些测定方法？有哪些测定方法？二、线性范围试验1.实验目的：v通过线性范围的测定，选择线性段作为该测定方法的分析范围。v掌握线性范围试验的评价及意义。v熟悉线性范围试验的具体操作过程。v在比色分析中，在符合Lambert-Beer定律的条件下，有色溶液的吸光度A与被测物质浓度C 成正比。v以标准物质浓度C 为横坐标，吸光度A为纵坐标，可在普通方格纸上绘出一条直线，即剂量反应曲线或校正曲线。2.实验原理：v在此情况下，待测物浓度与吸光度的比值为一常数，直线上任何一点的斜率tan都相等，即tan=A1/C1=A2/C2=A3/C3=An/Cn=K此处K即为校正常数。v在实际工作中并不存在理想的反应曲线，当被测物浓度过高、仪器处于非理想状态时，都可导致对Lambert-Beer定律的偏离，出现正偏离和负偏离现象。v因此，新建立的分析方法，其线性范围尚未确定时，为较准确地测出该方法符合Lambert-Beer定律的浓度范围，我们需要进行线性范围的测定。v线性范围的确定 要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释、重测的机会。3.实验材料v试剂：商品双缩脲试剂、TP标准液、质控血清液（用蒸馏水稀释，浓度为120g/L）。vC1*V1=C2*V2v器材：试管、加样枪、722分光光度计。v取试管32支，除空白管、标准管外，110号管各做3个平行管，一共有10个浓度。按表三加样：4.实验方法5.实验结果v所得数据如实填入表四：6.注意事项v1.标本的加量必须十分准确，应用准确度很高的加样枪进行加样。v2.稀释时，应使标准管系列成为精确的浓度等差系列。v3.同一浓度应采用三管平行操作，初步判断测出的吸光度值，若相差超过0.100，应去掉其中的异常数值后再算平均值。v4.标准溶液和样品溶液的蛋白质浓度均应超过10mg/mL。7.数据处理与分析v用Excel软件制作出浓度C 对吸光度值A的 标准曲线图，求出线性范围。v采用SPSS13.0软件对线性范围内的浓度C 与对应吸光度值A作直线回归分析，求出回归方程=a+bx，并求出线性系数（r）和决定系数（r2）。v在两个具有相关关系的变量的一组数据（X与Y）间，通过散点图我们可观察出所有数据点都分布在一条直线附近，这样的直线可以画出许多条，而我们希望其中的一条能最好地反映X与Y之间的关系，即我们要找出一条直线，使这条直线“最贴近”已知的数据点。v这里在y的上方加记号“”，是为了区分y的实测值y，表示当x取值xi=（1，2，n）时，y相应的预测值为yi，直线上对应于xi的纵坐标是yi。v=a+bx叫做Y对X的回归直线方程，相应的直线叫做回归直线，b叫做回归系数。v要确定回归直线方程，只要确定截距a与回归系数b。v线性回归，指的是用直线方程表达X（自变量）和Y（因变量）之间的数量关系。va：是回归直线在Y轴上的截距，即X=0时Y的预测值。vb：是回归直线的斜率，又称为回归系数。表示自变量X对因变量Y影响大小的参数，即当X改变一个单位时，Y的预测值平均改变|b|个单位。v回归直线的求法 v最小二乘法：各实测点到直线的纵向距离的平方和最小。v直线相关的定义：如果两个随机变量中，一个变量由小到大变化时，另一个变量也相应地由小到大(或由大到小)地变化，并且测得两个变量组成的坐标点在直角坐标系中呈直线趋势，就称这两个变量存在直线相关关系。用相关系数r表示。v相关系数r 是说明有直线关系的两个变量间相关关系的密切程度和相关方向的统计指标。v相关系数没有单位，其值-1r1。v当两变量呈同向变化时，0r1，为正相关；r=1为完全正相关。v当两变量呈反向变化时，-1r0，为负相关；r=-1为完全负相关。vr0为零相关，表示无直线相关关系。v|r|越大，两变量的关系越密切。v决定系数r：反映了回归平方和占总平方和的比例，其越接近于1，回归直线拟和的效果越好。v拟合度越大，自变量X对因变量Y的解释程度越高，自变量引起的变动占总变动的百分比高，观察点在回归直线附近越密集。v相关表达两个变量之间相互关系的密切程度和方向。v回归表达两个变量之间的数量关系，已知X值可以预测Y值。8.思考与讨论v结合实验数据分析的结果进行讨论，最后得出本次实验的结论。v线性范围试验在方法学评价中有何作用？