微生物生产抗生素课件

资料收集：PPT制作：PPT演讲：微生物生产抗生素类药目录目录F红霉素红霉素的发酵生产的发酵生产D抗生素的提纯抗生素的提纯B抗生素的生物来源抗生素的生物来源E青霉素的发酵工艺青霉素的发酵工艺C抗生素产生菌的选育抗生素产生菌的选育A抗生素定义抗生素定义一.抗生素定义传传统统的的定定义义：抗抗生生素素（antibioticantibiotic）是是微微生生物物细细胞胞产产生生的的能能以以低低浓浓度度抑抑制制其其他他微微生生物物细细胞胞生生长长的的化化学物质。学物质。现现代代定定义义：抗抗生生素素是是生生物物细细胞胞（包包括括某某些些微微生生物物植植物物和和动动物物）产产生生的的能能以以低低浓浓度度抑抑制制其其他他生生物物细细胞生长或功能的化学物质。胞生长或功能的化学物质。概概 述述 抗抗抗抗生生生生素素素素是是是是某某某某些些些些生生生生物物物物产产生生生生的的的的具具具具有有有有生生生生物物物物活活活活性性性性的的的的物物物物质质，它它不不但但可可以以抑抑制制其其他他微微生生物物的的发育育与与代代谢，有有的的还可可以以抑抑制制癌癌的的发育与代育与代谢，及具有抗血，及具有抗血纤维蛋白溶蛋白溶酶作用。作用。抗抗抗抗生生生生素素素素是是是是人人人人们们使使使使用用用用最最最最多多多多的的的的药药物物物物，也也是是制制药工工业中中利利润最最高高的的产品品。世世界界各各国国由由发酵酵法法生生产的的抗抗生生素素约400种种，广广泛泛应用用的的仅120种种，其其他他主主要要是是毒毒性性大大、成成本本高高，无无商商业应用价用价值。抗抗抗抗生生生生素素素素生生生生产产为为近近近近代代代代微微微微生生生生物物物物技技技技术术中中中中最最最最大大大大产产业业之之之之一一一一，世世界界产量量超超过3500035000吨吨，不不但但在在经济上上占占有有重重要要位位置置，且且为人人类健康作了出巨大健康作了出巨大贡献。献。概概 述述n第二次世界大战期间,英美科学家在早年 Fleming发现青霉素的基础上,共同进行了青霉素的开发,用紫外光照射处理低产菌种,提高其产青霉素的能力,采用玉米浆作为培养基的氮源,从而成功地开始了青霉素的工业生产,并建立了深层发酵技术,这是发酵工业的一次革命,成为抗生素生产的开端。n抗生素的工业化生产主要是利用微生物发酵法，极少数抗生素如磷霉素可用法学法生产。此外还用天然产生的抗生素进行化学结构改造，制造各种衍生物。二、抗生素的生物来源微生物产生抗生素1 1、放线菌产生的抗生素：、放线菌产生的抗生素：链霉菌属：放线菌素、链霉素等。链霉菌属：放线菌素、链霉素等。小小单单抱抱菌菌属属：红红霉霉素素（大大环环内内酯酯类类）、新新霉霉素素（氨氨基基环醇类）环醇类）诺卡氏菌属：肌霉素（氨基环醇类）、诺卡氏菌素诺卡氏菌属：肌霉素（氨基环醇类）、诺卡氏菌素放放线线菌菌中中以以链链霉霉菌菌属属产产生生的的抗抗生生素素最最多多，诺诺卡卡菌菌属属较较少。少。2 2、细菌产生抗生素、细菌产生抗生素芽孢杆菌属：多粘芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌芽孢杆菌属：多粘芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌假单胞菌属：铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）假单胞菌属：铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）杆菌肽、粘杆菌素、多黏菌素等多肽类。杆菌肽、粘杆菌素、多黏菌素等多肽类。3 3、真菌产生抗生素、真菌产生抗生素青霉属：青霉素、灰黄霉素。青霉属：青霉素、灰黄霉素。头孢菌属：头孢菌属：头孢霉素头孢霉素其他生物（动植物）产生抗生素n植物产生的抗生素，如地衣和藻类植物产生的地衣酸和绿藻酸，从被子植物如蒜和番茄等植物的组织或果实中制得的蒜素和番茄素，裸子植物如银杏、红杉等也能产生抗生物质。n动物的多种组织能产生溶菌酶或一些抗生素，如从动物的心、肺、脾、肾、眼泪、涎水中可提取出色素，有抗菌及抗病毒等作用。三、抗生素产生菌的选育三、抗生素产生菌的选育 1 1、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离 2 2、抗菌性试验、抗菌性试验 3 3、抗生素产生菌的改良、抗生素产生菌的改良 1)1)人工诱变人工诱变 2)2)原生质体融合原生质体融合 3)3)体外体外DNADNA重组重组体外体外DNA重组重组 四、抗生素的提纯 微微生生物物在在发发酵酵过过程程中中会会产产生生多多种种代代谢谢产产物物，包包括括各各种种初初级级代代谢谢产产物物和和次次级级代代谢谢产产物物以以及及培培养养基基的的固固有有成成分分，这这些些成成分分的的存存在在影影响响抗抗生生素素的的使使用用效效果果，本身具有毒副作用，造成储存困难，必须经过精制。本身具有毒副作用，造成储存困难，必须经过精制。抗生素提纯的基本步骤和原则抗生素提纯的基本步骤和原则3个基本步骤：个基本步骤：发酵液过滤和预处理、粗纯化、精制发酵液过滤和预处理、粗纯化、精制4个个原原则则：时时间间尽尽量量短短；采采用用适适当当较较低低浓浓度度；条条件件适适宜，宜，pH适度，温度适宜；防止杂菌污染。适度，温度适宜；防止杂菌污染。提取方法：提取方法：吸吸附附、萃萃取取、离离子子交交换换、沉沉淀淀、色色谱谱分分离离、分分子子筛筛过滤、透析等。过滤、透析等。抗生素的提纯抗生素的提纯五、青霉素的发酵工艺1、青霉素的作用机制、抗菌谱及稳定性n作作用用机机制制：抑抑制制细细菌菌的的转转肽肽酶酶，阻阻止止细细胞胞壁壁合合成成中中的的交交叉叉连连接接步步骤骤，使使处处于于繁繁殖殖分分裂裂期期的的细细菌菌细细胞胞壁壁的的合合成成发发生生障障碍碍，导导致致菌菌体体细细胞胞壁壁损损坏坏，使使细细胞胞内内因因渗渗透透压压等等原原因因发发生生溶解而死亡。溶解而死亡。n抗抗菌菌谱谱：作作用用于于大大多多数数革革兰兰氏氏阳阳性性细细菌菌及及部部分分革革兰兰氏氏阴阴性性细菌。细菌。n稳稳定定性性：弱弱酸酸性性的的有有机机化化合合物物，干干燥燥纯纯净净的的青青霉霉素素盐盐很很稳稳定，定，pH5-7pH5-7，6 6最稳定。最稳定。2、菌种n青青霉霉素素作作为为第第一一个个具具有有临临床床应应用用价价值值的的抗抗生生素素，19281928年年被被发发现现，19431943年年在在美美国国被被首首次次实实现现工工业业生生产。产。n最最早早发现的的产生生青青霉霉素素的的原原始始菌菌种种是是点点青青霉霉菌菌，生生产能能力力很很低低，发发酵酵单单位位2U/mL2U/mL，不不能能满足足工工业生生产要要求求，所所以以被被淘淘汰汰。现在在主主要要采采用用的的是是产黄黄青青霉霉菌菌，目目前前国国际际上上青青霉霉素素生生产产最最高高发发酵酵单单位位80000-90000U/mL.80000-90000U/mL.2、菌种n生生产产菌菌种种按按其其在在深深层层培培养养中中菌菌丝丝形形态态分分为为：丝丝状状菌菌和和球球状状菌菌；根根据据丝丝状状菌菌产产生生孢孢子子的的颜颜色色又又分分为为黄黄孢孢子子丝丝状状菌菌和和绿绿孢孢子子丝丝状状菌菌。常常用用菌菌种种为为绿绿孢孢子子丝丝状菌，如产黄青霉菌状菌，如产黄青霉菌。n为了提高了提高产黄青霉菌的青霉素黄青霉菌的青霉素产量，使用量，使用诱变剂如：二如：二环氧丁氧丁烷、甲磺酸乙、甲磺酸乙酯、乙、乙烯亚胺、胺、亚硝酸、硝酸、X射射线等。等。3、当前青霉素的生产工艺流程 一一般般而而言言，青青霉霉素素的的生生产工工艺流流程程需需要要有有四四个个环节。第第一一个个环节是是通通过培培养养基基配配制制、蒸蒸汽汽灭菌菌等等工工艺手手段段将将原原料料加加工工为一一级种种子子罐罐。与与此此同同时，还要要将将青青霉霉素素菌菌、斜斜面面母母瓶瓶、米米孢子子等等经过相相应处理理后后加加入入到到一一级种种子子罐罐中中。第第二二个个环节是是利利用用培培养养基基配配制制和和蒸蒸汽汽灭菌菌等等处理理手手段段将将原原料料培培养养成成二二级种种子子罐罐。第第三三个个环节是是在在第第二二个个环节的的基基础上上加加上上发酵酵罐罐的的处理理，形形成成发酵酵液液。最最后后一一个个环节则是是将将上上述述所所获得得的的发酵酵液液放放在在带放放罐罐中中，获得得最最终的的发酵酵液液，完成青霉素的，完成青霉素的发酵制酵制备。青霉素青霉素发酵工酵工艺流程及流程及发酵控制酵控制冷冻管冷冻管孢子培养孢子培养25,7天天斜面母瓶斜面母瓶孢子培养孢子培养25,7天天大米孢子大米孢子种子培养种子培养27,50h1:3vvm一级一级种子培养液种子培养液种子培养种子培养25,14h1:(11.5)vvm二级二级种子培养液种子培养液变温发酵变温发酵26-24200h1:(0.71.8)vvm发酵液发酵液（1）孢子制备 先先将将保保存存在在砂砂土土中中的的菌菌种种孢子子取取出出，在在由由甘甘油油、葡葡萄萄糖糖以以及及蛋蛋白白胨所所制制备而而成成的的培培养养基基中中进行行斜斜面面培培养养，经传代代和和活活化化。培培养养温温度度控控制制在在26左左右右（最最利利于于菌菌种种孢子子传代代活活化化的的适适宜宜温温度度）。培培养养7d左左右右，得得到到单菌菌落落之之后后，再再传斜斜面面，以以同同样的的方方式式培培养养7d。然然后后就就可可以以将将所所获得得的的斜斜面面孢子子移移植植到到优质小小米米或或大大米米固固体体培培养养基基上上，25，相相对湿湿度度45%-50%，培培养养7d，得得到到最最终的的生生产孢子子。所所获得得的的生生产孢子子应该经过摇瓶瓶试验后后，确确定定其其效效价价与与杂菌菌情情况况均均符符合合相相关关规定定后后方方可可用用于于下下一一环节生生产。可在可在孢子成熟后子成熟后进行真空干燥，低温保存行真空干燥，低温保存备用。用。一级种子发酵：一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝发芽罐，孢子萌发，形成菌丝培养基：培养基：葡萄糖、玉米浆、碳酸钙、玉米油、葡萄糖、玉米浆、碳酸钙、玉米油、消沫剂等。消沫剂等。接种量：接种量：200200亿孢子亿孢子/吨培养基吨培养基空气流量：空气流量：1 1：3 3 （m m3 3/m/m3 3minmin）搅拌转速：搅拌转速：300-350 r/min300-350 r/minpHpH：自然：自然温度：温度：271271时间：时间：40h40h（2）种子罐培养工艺（2）种子罐培养工艺二二级种子罐：种子罐：繁殖罐，大量繁殖繁殖罐，大量繁殖培养基：培养基：葡萄糖、玉米葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫，玉米油，消沫剂等等接种量：接种量：10%空气流量：空气流量：1：1-1.5 （m m3 3/m/m3 3minmin）搅拌转速：搅拌转速：250-280 r/min250-280 r/minpHpH：自然自然温度：温度：251251 时间：时间：10-14h（3）生产罐培养工艺三三级罐罐：发酵罐酵罐培养基：培养基：花花生生饼粉粉、葡葡萄萄糖糖、尿尿素素、硝硝酸酸铵、硫硫代代硫硫酸酸钠、苯苯乙乙酰胺胺、碳酸、碳酸钙、玉米油、硅油、玉米油、硅油温度控制：温度控制：变温控制，不同温控制，不同阶段不同温度段不同温度 较高高温温度度（26），缩短短生生长时间；降降低低温温度度（22），利于青霉素合成。利于青霉素合成。pH：6.4-6.6左右左右 根据根据pH补糖（糖（补糖可是糖可是pH上升）上升）空气流量空气流量:1:0.8-1.5 （m m3 3/m/m3 3minmin）搅拌速度：拌速度：150-200r/min发酵罐示意图搅拌器搅拌器搅拌器搅拌器冷却水进口冷却水进口冷却水进口冷却水进口放料口放料口放料口放料口无菌空气无菌空气无菌空气无菌空气培养液培养液培养液培养液冷却水出口冷却水出口冷却水出口冷却水出口排气口排气口排气口排气口pHpH检测及检测及检测及检测及控制装置控制装置控制装置控制装置电动机电动机电动机电动机加料口加料口加料口加料口菌丝生长速度与形态、浓度 发酵酵稳定定期期，湿湿菌菌浓度度可可达达15%-20%，丝状状菌菌干干重重约3%，球球状状菌菌干干重重在在5%左左右右。在在发酵酵中中后后期期一一般般每每天天放放液液一一次次，每每次次放放掉掉总发酵酵液液的的10%左右。左右。消沫天然油脂：天然油脂：玉米油玉米油；化学消沫；化学消沫剂：泡泡敌前期：前期：主主间歇歇搅拌，少加油拌，少加油中中期期：搅拌拌、加加油油、稍稍微微降降低低通通气气量量（必必要要时，少少量多次量多次)后期：后期：尽量少加消沫尽量少加消沫剂 青青霉霉素素的的发酵酵过程程控控制制十十分分精精密密，一一般般2小小时取取样一一次次，测定定发酵酵液液的的pH、菌菌浓、残残糖糖、青青霉霉素素效效价价等等指指标，同同样取取样做做无无菌菌检测，发现染染菌菌立立即即结束束发酵酵，视情情况况过滤提提取取，因因为染染菌菌后后pH波波动大大，青青霉霉素素在在几几小小时内内就就会会被被全全部部破破环。(4)青霉素的提取工艺1.1.青霉素不青霉素不稳定，遇酸、碱、定，遇酸、碱、热分解失活分解失活2.2.水溶液中不水溶液中不稳定，非极性溶定，非极性溶剂中中稳定定3.3.易溶于有机溶易溶于有机溶剂，水中溶解度很小，水中溶解度很小4.4.青霉素青霉素盐很很稳定；降解定；降解产物具有致敏性物具有致敏性5.5.防止降解，条件温和、快速防止降解，条件温和、快速青霉素的提取工艺发发酵酵液液预预处处理理萃萃取取脱脱色色反反萃萃取取过过滤滤洗洗涤涤干燥干燥（发酵液中，青霉素浓度较低（发酵液中，青霉素浓度较低 10-30kg/m10-30kg/m3 3）发发酵酵液液预预处处理理：浓浓缩缩目目的的产产物物，去去除除大大部部分分杂杂志志，改改变变发发酵酵液液的的流流变变学学特特征征，利利于于后后续续的的分分离离纯纯化化过程过程 a a.加加絮凝剂使蛋白质沉淀絮凝剂使蛋白质沉淀 b.b.过滤（鼓式真空过滤机）过滤（鼓式真空过滤机）活性炭萃取萃取工艺过程：二级逆流萃取工艺过程：二级逆流萃取A A、萃取原理：萃取原理：分分配配定定律律，青青霉霉素素在在水水中中溶溶解解度度小小，易易溶溶于于醋醋酸酸丁丁酯酯、醇醇等等有有机机溶溶剂剂中中，青青霉霉素素盐盐易易溶溶于于水水，不溶于有机溶剂。不溶于有机溶剂。青青霉霉素素在在滤滤液液中中以以盐盐存存在在，加加入入酸酸和和醋醋酸酸丁丁酯酯，溶溶于于有有机机相相中中，在在醋醋酸酸丁丁酯酯中中加加入入碳碳酸酸钾钾，6.8-7.46.8-7.4，形成盐转入水相中，实现反萃取。形成盐转入水相中，实现反萃取。B B、影响萃取因素、影响萃取因素a)a)pHpH：反反复复调调节节pHpH，青青霉霉素素不不稳稳定定，易易发发生生降降解解、异异构化、重排，构化、重排，-内酰胺环是功能性。内酰胺环是功能性。b)b)温度：加热会加快其降解反应温度：加热会加快其降解反应c)c)工工艺艺过过程程及及浓浓缩缩倍倍数数，级级数数越越高高、纯纯度度越越高高但但收收率率越低。越低。d)d)微生物污染：杂菌：微生物污染：杂菌：-内酰胺酶和青霉素酰胺酶内酰胺酶和青霉素酰胺酶e)e)萃取时间：青霉素在水中的半衰期萃取时间：青霉素在水中的半衰期18.5min18.5min。(5)(5)青霉素的精制青霉素的精制 制制成成碱碱金金属属盐盐：碱碱金金属属盐盐稳稳定定性性大大；青青霉霉素素在在水中的稳定性差，水解快。水中的稳定性差，水解快。1)1)结晶工艺：结晶工艺：A A、醋醋酸酸丁丁酯酯中中直直接接结结晶晶：加加入入醋醋酸酸钾钾-乙乙醇醇-碳碳酸酸钾钾、丁醇丁醇-水真空共沸蒸馏。水真空共沸蒸馏。B B、丁丁醇醇-水水共共沸沸结结晶晶：青青霉霉素素的的碱碱金金属属盐盐溶溶于于水水，在在丁丁醇醇中中不不溶溶解解，稳稳定定，丁丁醇醇和和水水形形成成二二元元共共沸沸物物蒸蒸出出，丁丁醇醇带带出水分，不断加入丁醇，可使水分不断减少，结晶析出。出水分，不断加入丁醇，可使水分不断减少，结晶析出。2)2)过滤、洗涤、干燥过滤、洗涤、干燥 结结晶晶后后用用真真空空抽抽滤滤来来处处理理母母液液，并并用用丁丁醇醇洗洗涤涤。干干燥燥采用真空双锥旋转干燥器采用真空双锥旋转干燥器(6(6)溶媒回收溶媒回收 采用立式传质塔蒸馏回收。采用立式传质塔蒸馏回收。一、斜面培养一、斜面培养：淀淀粉粉1 1，硫硫酸酸铵铵0.30.3、玉玉米米粉粉0.60.61.01.0、氯氯化化钠钠0.30.3、蛋蛋白白胨胨0.20.2、琼琼脂脂2 2、pH7.0pH7.07.27.23737培养培养7 710d10d，成熟的孢子灰色略带微红色。，成熟的孢子灰色略带微红色。一级种子培养：一级种子培养：豆豆饼饼粉粉2.52.5、葡葡萄萄糖糖3 3、淀淀粉粉4 4、蛋蛋白白胨胨0.50.5、酵酵母母粉粉0.50.5、硫硫酸酸铵铵0.50.5、玉玉米米粉粉0.20.2、氯氯化化钠钠0.30.3、磷磷酸酸氢氢二二钾钾0.060.06、硫酸镁硫酸镁0.0250.025、豆油、豆油0.30.335 35 培养培养72h72h，菌丝密集，菌丝密集六、红霉素的发酵生产二级种子：二级种子：豆豆饼饼粉粉2.22.2、葡葡萄萄糖糖3 3、淀淀粉粉4 4、蛋蛋白白胨胨0.50.5、酵酵母母粉粉0.50.5、硫硫酸酸铵铵0.10.1、玉玉米米粉粉0.80.8、氯氯化化钠钠0.30.3、碳酸钙、碳酸钙0.60.6、豆油、豆油0.30.33535，24h24h，接种量，接种量1010二、发酵罐培养二、发酵罐培养发酵培养基：发酵培养基：豆豆饼饼粉粉2.42.4、葡葡萄萄糖糖3 3、3.53.5、蛋蛋白白胨胨0.50.5、酵酵母母粉粉0.50.5、硫硫酸酸铵铵0.10.1、玉玉米米粉粉0.80.8、氯氯化化钠钠0.30.3、碳碳酸酸钙钙0.60.6、豆豆油油0.150.15，丙丙酸酸0.60.6（分分次加入）次加入）60h60h前前3535，60h60h后后33 33 菌丝繁殖期：菌丝繁殖期：接接种种45h45h后后，菌菌丝丝生生长长快快，繁繁殖殖旺旺盛盛，迅迅速速利利用用N N、C C，菌丝体密集成网状。，菌丝体密集成网状。红霉素分泌期：红霉素分泌期：45h45h150h150h，菌菌丝丝体体生生长长减减弱弱，并并达达到到平平衡衡，pHpH在在7.27.2左右，左右，c c源利用较快，红霉素持续分泌。源利用较快，红霉素持续分泌。菌丝自溶期：菌丝自溶期：菌菌体体衰衰老老，发发酵酵液液颜颜色色较较深深，菌菌丝丝短短，粘粘稠稠度度较较大大，pHpH上升上升7.57.5，氨基氮上升。，氨基氮上升。三、红霉素的提取和精制 红霉霉素素是是一一种种有有机机碱碱化化物物，在在碱碱性性条条件件下下溶溶于于有有机机溶溶剂中中，在在酸酸性性条条件件下下溶溶于于水中。水中。提取工艺发酵液酵液 过滤 滤液液 酸化液酸化液 加甲醛、硫酸锌加甲醛、硫酸锌pH8.28.8(26000 r/ml)加氢氧化钠静止加氢氧化钠静止 碱化碱化调节调节pH10pH1010.510.5分层、离心醋酸调节醋酸调节pH5pH55.55.5 静止分层静止分层 酸化液酸化液5 5加丙酮加丙酮 冷冻结晶冷冻结晶结晶结晶洗涤洗涤干燥干燥成品成品1、发酵液预处理、发酵液预处理0.10.2甲醛：杀菌使蛋白凝集变性甲醛：杀菌使蛋白凝集变性46硫酸锌：去除酸性蛋白，助滤硫酸锌：去除酸性蛋白，助滤并用碱液调节并用碱液调节pH8.28.8，稳定红霉素，稳定红霉素2、滤液处理、滤液处理计算添加醋酸丁酯添加量，用碱液调节计算添加醋酸丁酯添加量，用碱液调节pH1010.5，3033左右，红霉素溶解于有机溶剂中。左右，红霉素溶解于有机溶剂中。气流干燥 80-90C3 3、醋酸丁酯液处理：、醋酸丁酯液处理：1010醋醋酸酸调调节节pH5pH55.55.5，分分层层，去去除除醋醋酸酸丁丁酯酯液液，在在 酸酸 性性 环环 境境 下下 溶溶 于于 水水 溶溶 液液 中中分层过滤分层过滤酸液处理酸液处理用用1010氢氢氧氧化化钠钠调调节节pH7pH78 8，再再加加适适量量的的醋醋酸酸丁酯，二次萃取。丁酯，二次萃取。静止分层最终得到溶解于水中的红霉素静止分层最终得到溶解于水中的红霉素再经过冷冻结晶，真空干燥得纯品。再经过冷冻结晶，真空干燥得纯品。结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End感谢聆听不足之处请大家批评指导Please Criticize And Guide The Shortcomings演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日