常见的染色简介【检验科】--课件

常见的染色简介常见的染色简介检验科Y生物分类Y生物的基本分类层次：界、门、纲、目、科、属、种。Y生物的详细分类层次：域、界、门、亚门、总纲、纲、亚纲、总目、目、亚目、总科、科、亚科、总属、属、亚属、总种、种、亚种。种是最小的生物单位。生物的相同科、目越多，共同点也越多。域是生物分类法中最高的类别。作为比界高的分类系统，称作“域”(Domain)或者“总界”(Superkingdom)。目前这三域分别命名为细菌域(Bacteria)古菌域(Archaea)和真核域(Eukarya)。Y生物由原核生物、真核生物及非细胞生物组成，包括动物、植物、细菌、真菌、病毒等.Y原核细胞和真核细胞是细胞的两大基本类型，它们反映细胞进化的两个阶段。把具有细胞形态的生物划分为原核生物和真核生物，是现代生物学的一大进展。原核细胞的主要特征是没有线粒体、质体等膜细胞器，染色体只是一个环状的DNA分子，不含组蛋白及其他蛋白质，没有核膜。原核生物包括细菌和蓝菌，它们都是单生的或群体的单细胞生物。Y和原核细胞相比，真核细胞是结构更为复杂的细胞。它有线粒体等各种膜细胞器，有围以双层膜的细胞核，把位于核内的遗传物质与细胞质分开。DNA为长链分子，与组蛋白以及其他蛋白结合而成染色体。真核细胞的分裂为有丝分裂和减数分裂，分裂的结果使复制的染色体均等地分配到子细胞中去。Y病原微生物分类：细菌、真菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体、病毒等 未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色 抗酸染色 墨汁染色 瑞氏染色 革兰氏染色:革兰氏染色是用来鉴别细菌的一种方法，利用细菌细胞壁上的主要成份不同，这种染色法，可将细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌。这种染色法是由一位丹麦医生汉斯克里斯蒂安革兰（Hans Christian Gram，1853年1938年）于1884年所发明，最初用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。原理:通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物.革兰氏阳性菌:由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色.革兰氏阴性菌:因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。试剂：龙胆紫、碘液、酒精、沙黄.革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤.初染：初染：碱性染料，草酸胺结晶紫液 媒染：媒染：碘液，其作用的是增强染料与菌体的亲和力，加强染料与细胞的结合。脱色剂Y乙醇将染料溶解，使被染色的细胞脱色，利用不同细菌对染料的脱色程度不同，帮助染料从被染色的细胞中脱色。而将细菌加以区分。革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。Y复染液Y也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。具体操作方法是：1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。2、涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不 烫手为宜）。固定的目的Y 杀死微生物，固定其细胞结构；Y 保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉；Y 改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。5、染色：将固定过的涂片放架子上，滴加龙胆紫染液，染1min。6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。9、复染：滴加沙黄复红复染1min，水洗。至此，革兰氏染色结束。革兰氏染色龙胆紫碘液酒精沙黄水冲水冲水冲染色结果 革兰氏阳性菌都呈蓝紫色，革兰氏阴性菌都呈粉红色。临床意义 其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌 2.选择药物 3.与致病性有关：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素；而内毒素主要是指革兰氏阴性菌胞壁成分中的脂多糖，两者的致病作用不同。注意事项Y1.革兰氏染色成败是脱色时间，如脱色过度阳性菌会被误认为为阴性菌；相反，时间过短，阴性菌又会被误认为阳性菌。所以一定要严格把握时间。Y2.选用18-24小时的菌龄的细菌为宜。若菌体过老，由于菌体死亡或自溶常使阳性菌转为阴性菌。瑞氏染色:瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Methvlem blue）和酸性染料黄色伊红（Eostm Y）合称伊红美蓝染料即瑞氏（美蓝伊红Y）染料。观察内容Y红细胞Y白细胞Y血小板原理Y 瑞氏试剂中之酸性伊红和碱性美篮混合经化学作用后，变成中性之伊红化美蓝，久置后，经氧化而含有天青。此三种染料分别和细胞核及浆中的NH3+和COO-等结合，使细胞核及胞浆着色成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，。由于系中性染料，又有缓冲液调节酸碱度，所以细胞受染后，蓝红等颜色都较适中，核染质、胞浆及其中之颗粒显色较为清楚。Y 各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质 中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质,例如：原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。具体操作方法是：1、取标本推片、自然干燥 2、滴加瑞氏染液染1分钟,使标本被其中甲醛所固定;3、加等量PH6.4的磷酸盐缓冲液(或等量超纯水)轻轻晃动玻片,均匀静置15分钟;缓冲液作用：染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察 pH 值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。缓冲液须保持一定的 pH 使染色稳定，PBS 的 pH 一般在 6.4-6.8，偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使 pH 恒定。4、水洗、吸干、镜检。5、细菌染成蓝色，组织细胞胞浆红色，细胞核蓝色。染色结果:胞核和颗粒是蓝紫色、胞浆为淡蓝色、成熟红细胞为粉色等.临床意义 1.有助于血细胞形态和比例的区分.2.辅助诊断疾病如血液病等.抗酸染色原理原理:分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。抗酸染色一般步骤:Y1）初染:用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，5分钟后用水冲洗.2）脱色:3%盐酸酒精脱色30秒-1分钟；用水冲洗。3）复染:用亚甲基兰溶液复染2分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。酸性酒精亚甲基兰石碳酸复红水洗水洗染色结果:1.抗酸杆菌阳性为粉红色,常堆积成团,排列无序,偶成分枝状生长.2.背景及阴性为蓝色.报告方式:涂片未见抗酸杆菌/涂片见细长、红色抗酸杆菌 阴性:全视野未找到抗酸杆菌 ：全视野发现39个抗酸杆菌 2:全视野发现1099个抗酸杆菌 3:每视野发现19个抗酸杆菌 4:每视野发现10个以上抗酸杆菌 （全视野发现12个抗酸杆菌时，报告抗酸杆菌个数）临床意义:结核分枝杆菌不产生内毒素和外毒素，其毒力主要是在机体中细胞内、外生长与大量繁殖的能力，细菌成分与其代谢产物引起免疫反应（型）导致一系列组织学上的意义。墨汁染色:通常用于检查脑脊液或分泌物涂片中的隐球菌,具有方便、快速、节约成本等优点,是涂片中检查隐球菌感染的首选方法。隐球菌:显微镜暗视野(负染)下找隐球菌，可见圆形菌体，外轴有一圈透明的肥厚荚膜，内有反光孢子，但无菌丝。反复多次查找阳性率高，脑脊液应离心后取沉淀涂片。隐球菌墨汁染色阳性，需进一步作真菌培养 方法:脑脊液一滴,墨汁一小滴,涂匀,湿片在镜下观察.临床意义:新型隐球菌脑膜炎,是由新型隐球菌感染引起的脑膜炎，是中枢神经系统最常见的真菌感染，病情重、死亡率高。悲剧啊悲剧啊!