常用分子生物学技术的原理及应用60739-课件

目目 录录第二十二章第二十二章常用分子生物学技术常用分子生物学技术的原理及应用的原理及应用The Popular Technology in Molecular Biology:Principle and Application2020/10/281目目 录录第第 一一 节节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization&Blotting Technology2020/10/282精品资料3目目 录录核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂杂化化双双链链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理2020/10/284目目 录录复性复性RNADNA2020/10/285目目 录录（一）印迹技术（一）印迹技术（二）探针技术（二）探针技术 探针探针(probe)一一小小段段用用同同位位素素、生生物物素素或或荧荧光光染染料料标标标标记记其其末末端端或或全全链链的的已已知知序序列列的的多多聚聚核核苷苷酸酸，与与固固定定在在NC膜膜上上的的核核苷苷酸酸结结合合，判判断断是是否否有有同同源源的的核核酸分子存在。酸分子存在。2020/10/286目目 录录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。2020/10/287目目 录录 其他其他斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)2020/10/288目目 录录三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较2020/10/289分子杂交实验分子杂交实验目目 录录2020/10/2810放放射射自自显显影影照照片片目目 录录2020/10/2811目目 录录DNA点阵点阵目目 录录2020/10/2812目目 录录第第 二二 节节 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain Reaction2020/10/28135 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 录录2020/10/2814Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录2020/10/2815目目 录录n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分2020/10/2816目目 录录三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C2020/10/2817目目 录录（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途2020/10/2818目目 录录三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术2020/10/2819实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目 录录2020/10/2820目目 录录第第 三三 节节 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic Acid Sequence Analysis2020/10/2821目目 录录核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂解法化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法(sanger法法)2020/10/2822目目 录录一、化学裂解法一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)基本原理基本原理基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNADNA链在链在1 1个或个或2 2个碱个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNADNA片段，将这些片段经电泳分离。片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNADNA的的5 5末端，经放射末端，经放射自显影即可在自显影即可在X胶片上读出胶片上读出DNADNA链的序列。链的序列。2020/10/2823目目 录录二、二、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法2020/10/2824目目 录录目目 录录2020/10/2825目目 录录三、三、DNA自动测序自动测序采采用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳）分分离离后后，通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧荧光光信信号号，并并依此确定依此确定DNA碱基的排列顺序。碱基的排列顺序。2020/10/2826目目 录录DNA自动测序结果举例目目 录录2020/10/2827目目 录录基基 因因 文文 库库Gene Library第第 四四 节节2020/10/2828目目 录录基因组基因组DNA文库文库 (genomic DNA library)cDNA文库文库 (cDNA library)基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列的克隆群体。序列的克隆群体。2020/10/2829目目 录录目目 录录2020/10/2830目目 录录第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例2020/10/2831目目 录录疾病相关基因的克隆与鉴定疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes第第 五五 节节2020/10/2832目目 录录克隆疾病相关基因的策略克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆(functional cloning)（二）定位克隆（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略(position-independent candidate gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches)2020/10/2833目目 录录定义定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。克隆该致病基因。（一）功能性克隆（一）功能性克隆应用应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。到部分纯化的遗传性疾病。2020/10/2834目目 录录克隆方式克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；文库；根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选作探针，筛选cDNA文库。文库。功能互补试验功能互补试验 (functional complementation assay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。2020/10/2835目目 录录（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析(确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常(缺失、易位等缺失、易位等)分析、基分析、基因文库的筛选与基因克隆因文库的筛选与基因克隆2020/10/2836目目 录录（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。预测出候选致病基因。2020/10/2837目目 录录（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。致病基因。2020/10/2838目目 录录第第 六六 节节遗传修饰动物模型的建立遗传修饰动物模型的建立及应用及应用The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 2020/10/2839目目 录录转基因技术转基因技术采采用用基基因因转转移移技技术术使使目目的的基基因因整整合合入入受受精精卵卵细细胞胞或或胚胚胎胎干干细细胞胞，然然后后将将细细胞胞导导入动物子宫，使之发育成个体。入动物子宫，使之发育成个体。转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术2020/10/2840目目 录录核转移技术核转移技术 即即动动物物整整体体克克隆隆技技术术，将将动动物物体体细细胞胞核核全全部部导导入入另另一一个个体体的的去去胞胞核核的的受受精精卵卵内内，使使之之发发育育成成个个体，即克隆体，即克隆(clone)。二、核转移技术二、核转移技术2020/10/2841目目 录录2020/10/2842目目 录录基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。因的技术。三、基因剔除技术三、基因剔除技术2020/10/2843目目 录录四、基因转移和基因剔除技术在医四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用学中的应用建立动物模型建立动物模型 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模型 基因剔除基因剔除获得性突变获得性突变(gain-of-function mutation)多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型2020/10/2844目目 录录第第 七七 节节 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术Biological Chip Technology2020/10/2845目目 录录DNA芯片芯片(DNA chip)cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。一、基因芯片一、基因芯片(gene chip)2020/10/2846目目 录录目目 录录2020/10/2847目目 录录是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋蛋白白进进行行定定性性和和定定量量分分析析的的一一种种技术。技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)2020/10/2848目目 录录第第 八八 节节蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术 Research Technology of Interaction of Protein2020/10/2849目目 录录蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNADNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。相互作用。蛋白质之间相互作用研究的重要性蛋白质之间相互作用研究的重要性2020/10/2850目目 录录酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选等等噬菌体显示系统筛选等等常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术2020/10/2851一、酵母双杂交技术的基本原理一、酵母双杂交技术的基本原理目目 录录2020/10/2852