分子生物学导论ppt课件

分子生物学分子生物学分子生物学1课程内容w细胞与大分子w蛋白质结构w核酸的性质w原核与真核生物的染色体结构wDNA复制wDNA损伤、修复与重组w基因操作课程内容细胞与大分子2w克隆载体w基因文库与筛选w克隆DNA的分析与应用w原核生物的转录w原核生物的转录调控w真核生物的转录w真核生物的转录调控克隆载体3wRNA加工与核糖核蛋白复合体w遗传密码与tRNAw蛋白质合成w噬菌体与真核生物病毒w肿瘤病毒与癌基因RNA加工与核糖核蛋白复合体4第一章第一章 绪绪 论论第一节第一节 分子生物学发展的基础分子生物学发展的基础（一）（一）创世说和进化论创世说和进化论三个与生命现象相关的基本问题三个与生命现象相关的基本问题w生命是怎样起源的？生命是怎样起源的？w为什么为什么“有其父必有其子有其父必有其子”？w动、植物个体是怎样从一个受精卵发育而来的？动、植物个体是怎样从一个受精卵发育而来的？n创世说创世说w上帝创造了世间万物，包括人类。上帝创造了世间万物，包括人类。第一章 绪 论第一节 分子生物学发展的基础5什么是生命？生命如何定义？w从生物学角度的定义w从物理学角度的定义w从生物物理学角度的定义w“生命”的完整的、系统的定义什么是生命？生命如何定义？从生物学角度的定义6w从生物学角度“生命”被定义为：由核酸和蛋白质等物质组成的多分子体系，它具有不断自我更新、繁殖后代以及对外界产生反应的能力。从生物学角度7w从物理学角度的定义:“生命”=“负熵”热力学第二定律指出，任何自发过程总是朝着使体系越来越混乱、越来越无序的方向，即朝着熵增加的方向变化。生命的演化过程总是朝着熵减少的方向进行，一旦负熵的增加趋近于零，生命将趋向终结，走向死亡。从物理学角度的定义:“生命”=“负熵”8w从生物物理学角度的定义生命有三要素：物质、能量、信息在生物体的整个运动过程中，贯穿了物质、能量、信息三者的变化、协调和统一。从生物物理学角度的定义生命有三要素：物质、能量、信息9其他说法w生理学的定义：生命体是具有进食、代谢、排泄、呼吸、运动、生长、生殖和反应性功能的系统；w新陈代谢的定义：生命系统具有界面，与外界经常交换物质、但不改变自其身性质；w生物化学的定义：生命系统包含着储藏遗传信息的核酸和调节代谢的酶蛋白；w遗传学的定义：生命系统是通过基因复制、突变和自然选择而进化的系统；w热力学的定义：生命系统是一个开放系统，它通过能量流动和物质循环而不断增加内部秩序。其他说法生理学的定义：生命体是具有进食、代谢、排泄、呼吸、运10（二）（二）达尔文学说达尔文学说w1859年达尔文发表了著名的物种起源年达尔文发表了著名的物种起源一书，提出了进化论学说。其进化论思一书，提出了进化论学说。其进化论思想的精髓可概括为想的精髓可概括为“物竞天择，适者生存物竞天择，适者生存”几个字。他认为世界上的一切生物都是几个字。他认为世界上的一切生物都是可变的，物种的变异是由于大自然的环境可变的，物种的变异是由于大自然的环境和生物群体的生存竞争造成的。和生物群体的生存竞争造成的。（二）达尔文学说11（三）（三）细胞学说的建立细胞学说的建立w十七世纪末十八世纪初，荷兰的十七世纪末十八世纪初，荷兰的Leeuwenhoek制作了世界上第一台显微制作了世界上第一台显微镜，并观察了诸多生物样本。镜，并观察了诸多生物样本。w大约与其同时代的大约与其同时代的Hooke第一个提出第一个提出“细细胞胞”一词。一词。（三）细胞学说的建立十七世纪末十八世纪初，荷兰的Leeuwe12w十九世纪，德国植物学家十九世纪，德国植物学家Schleiden和动物学和动物学家家Schwann建立了细胞学说。他们认为：所有建立了细胞学说。他们认为：所有组织的最基本单元是形状非常相似而又高度分组织的最基本单元是形状非常相似而又高度分化的细胞。细胞的发生和形成是生物界普遍和化的细胞。细胞的发生和形成是生物界普遍和永久的规律。永久的规律。十九世纪，德国植物学家Schleiden和动物学家Schwa13（四）（四）经典的生物化学和遗传学经典的生物化学和遗传学n进化论和细胞学说的结合，产生了现代生物进化论和细胞学说的结合，产生了现代生物学。而以研究动、植物遗传变异规律为目标学。而以研究动、植物遗传变异规律为目标的遗传学和以分离纯化、鉴定细胞内含物质的遗传学和以分离纯化、鉴定细胞内含物质为目标的生物化学则是这一学科的两大支柱。为目标的生物化学则是这一学科的两大支柱。（四）经典的生物化学和遗传学14n经典的生物化学的成就经典的生物化学的成就w十九世纪，人们就已经发现了蛋白质。十九世纪，人们就已经发现了蛋白质。到二十世纪初，组成蛋白质的到二十世纪初，组成蛋白质的2020种氨种氨基酸被相继发现。基酸被相继发现。FisherFisher还论证了连还论证了连接相邻氨基酸的接相邻氨基酸的“肽键肽键”的形成。细的形成。细胞的其他成分，如脂类、糖类和核酸胞的其他成分，如脂类、糖类和核酸也相继被认识和部分纯化。也相继被认识和部分纯化。经典的生物化学的成就15w1869年年，Misescher首次从莱茵河鲑鱼首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到精子中分离到DNA。w1910年，德国科学家年，德国科学家Kossel首先分离得首先分离得到了腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸。到了腺嘌呤、胸腺嘧啶和组氨酸。1869年，Misescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到D16n经典遗传学的建立和发展经典遗传学的建立和发展w1865年，年，奥地利科学家孟德尔奥地利科学家孟德尔（Gregor Mendel）发表了发表了植物杂交植物杂交试验试验一书，提出了遗传学的两条基本一书，提出了遗传学的两条基本规律：统一律和分离律。他认为：生物规律：统一律和分离律。他认为：生物的每一种性状都是由遗传因子控制的，的每一种性状都是由遗传因子控制的，这些因子可以从亲代到子代，代代相传。这些因子可以从亲代到子代，代代相传。经典遗传学的建立和发展17n1909年，丹麦遗传学家年，丹麦遗传学家W.Johannsen首先使用首先使用“基因基因”一词。一词。1909年，丹麦遗传学家W.Johannsen首先使用“基18w二十世纪初，美国遗传学家二十世纪初，美国遗传学家Morgan提出提出了基因学说。他指出：了基因学说。他指出：种质必须由独立种质必须由独立的要素组成，我们把这些要素称为遗传的要素组成，我们把这些要素称为遗传因子，或者简单地称为基因。因子，或者简单地称为基因。二十世纪初，美国遗传学家Morgan提出了基因学说。他指出：19nMorgan及其助手发现了及其助手发现了连锁遗传连锁遗传规律规律，并且第一次将代表某一性，并且第一次将代表某一性状的基因，同某一特定的染色体状的基因，同某一特定的染色体联系起来。联系起来。Morgan及其助手发现了连锁遗传规律，并且第一次将代表某一20第二节第二节 分子生物学发展简史分子生物学发展简史 分子生物学的定义分子生物学的定义：是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。和相互关系的科学。第二节 分子生物学发展简史 分子生物学的定义：21w1928年英国科学家年英国科学家Griffith等人发现肺等人发现肺炎链球菌可以引起肺炎，导致小鼠死亡炎链球菌可以引起肺炎，导致小鼠死亡。w1944年美国微生物学家年美国微生物学家Avery通过肺炎通过肺炎链球菌对小鼠的感染实验，证明链球菌对小鼠的感染实验，证明DNA是是遗传信息的载体遗传信息的载体。1928年英国科学家Griffith等人发现肺炎链球菌可以引22w1953年年Watson和和Crick提出提出DNA右手右手双螺旋模型，于双螺旋模型，于1962年和年和Wilkins共享共享诺贝尔生理医学奖。诺贝尔生理医学奖。w同年，同年，Sanger首次阐明了胰岛素的一级首次阐明了胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河，结构，开创了蛋白质序列分析的先河，他于他于1958年获诺贝尔化学奖年获诺贝尔化学奖。1953年Watson和Crick提出DNA右手双螺旋模型，23w1954年年Crick提出遗传信息传递的提出遗传信息传递的中心法则。中心法则。w1958年年，Meselson和和Stahl提出了提出了DNA的半保留复制的半保留复制。1954年Crick提出遗传信息传递的中心法则。24w1961年，法国科学家年，法国科学家Jacob和和Monod提提出了调节基因表达的操纵元出了调节基因表达的操纵元（operon）模型模型，1965年获得诺贝尔生理医学奖。年获得诺贝尔生理医学奖。他们还首次提出了信使核糖酸他们还首次提出了信使核糖酸（mRNA）的存在及作用的存在及作用。w同年，同年，Nirenberg等人应用合成的等人应用合成的mRNA分子分子poly(U)破译出第一批遗传破译出第一批遗传密码。密码。1961年，法国科学家Jacob和Monod提出了调节基因表25w1966年，年，美国科学家美国科学家Nirenberg等人破等人破译了全部的译了全部的DNA遗传密码遗传密码，1969年与年与Holley和和Khorana分享了诺贝尔生理医分享了诺贝尔生理医学奖。学奖。w1967年发现了可将年发现了可将DNA连接起来的连接起来的DNA连接酶连接酶。1966年，美国科学家Nirenberg等人破译了全部的DN26w1970年年Smith、Qilcox及及Kelley分离到分离到第一种可以在第一种可以在DNA特定位点将特定位点将DNA分子分子切开的限制性核酸内切酶。同年，美国切开的限制性核酸内切酶。同年，美国的的Temin和和Baltimore发现发现RNA肿瘤病肿瘤病毒中存在逆转录酶，他们于毒中存在逆转录酶，他们于1975年共享年共享诺贝尔生理学奖。诺贝尔生理学奖。1970年Smith、Qilcox及Kelley分离到第一种27w1972年年，Berg、Boyer等人第一次成功等人第一次成功地完成了地完成了DNA重组实验重组实验。w1974年，首次实现了异源真核生物的基年，首次实现了异源真核生物的基因在大肠杆菌中的表达。因在大肠杆菌中的表达。1972年，Berg、Boyer等人第一次成功地完成了DNA28w19751977年，美国人年，美国人Sanger和和Gilbert发明了快速发明了快速DNA序列测定技术序列测定技术，并于并于1977年完成了噬菌体年完成了噬菌体X174基因基因组组（5386bp）的序列测定的序列测定。1980年年Sanger和和Gilbert与与Berg分享了诺贝尔分享了诺贝尔化学奖。化学奖。19751977年，美国人Sanger和Gilbert发明29w1982年年Prusiner提出提出“感染性蛋白质颗感染性蛋白质颗粒粒”的存在；次年将这种蛋白颗粒命名的存在；次年将这种蛋白颗粒命名为朊病毒蛋白为朊病毒蛋白（prion protein,PrP）。）。1997年，年，Prusiner因为发现朊病毒而获因为发现朊病毒而获得诺贝尔生理医学奖。得诺贝尔生理医学奖。1982年Prusiner提出“感染性蛋白质颗粒”的存在；次30w1984年，德国人年，德国人Kohler、美国人美国人Milstein和丹麦科学家和丹麦科学家Jern由于发由于发展了单克隆抗体技术而分享了诺贝展了单克隆抗体技术而分享了诺贝尔生理医学奖。尔生理医学奖。1984年，德国人Kohler、美国人Milstein和丹麦31w1986年年，Mullis发明了发明了PCR技技术。术。1993年年Mullis与第一个设与第一个设计定点突变的计定点突变的Smith共享了诺贝共享了诺贝尔化学奖。尔化学奖。1986年，Mullis发明了PCR技术。1993年Mull32w1988年年Waston出任出任“人类基人类基因组计划因组计划”首席科学家，举世瞩首席科学家，举世瞩目的人类基因组测序工作开始启目的人类基因组测序工作开始启动动。1988年Waston出任“人类基因组计划”首席科学家，举世33w1993年，美国科学家年，美国科学家Roberts和和Sharp由于在不连续基因方面的由于在不连续基因方面的工作而获得诺贝尔生理医学奖。工作而获得诺贝尔生理医学奖。1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在不连续34w1996年，酵母基因组年，酵母基因组DNA的全的全部序列测定工作完成。部序列测定工作完成。w2000年年6月月26日，人类基因组日，人类基因组工作框架图绘制完成工作框架图绘制完成1996年，酵母基因组DNA的全部序列测定工作完成。35第三节 分子生物学的研究内容DNA重组技术重组技术（基因工程）（基因工程）n（一）（一）DNA重组技术的含义重组技术的含义：指在指在体外体外将核酸分子插入病毒、质将核酸分子插入病毒、质粒或其他粒或其他载体载体分子，构成遗传物质分子，构成遗传物质的新组合，并将之的新组合，并将之导入导入到原先没有到原先没有这类分子的这类分子的寄主寄主细胞内，从而使接细胞内，从而使接受者产生受者产生新的遗传性状新的遗传性状的技术。的技术。第三节 分子生物学的研究内容DNA重组技术（基因工程）36（二）（二）DNA重组技术的建立重组技术的建立n关键技术：关键技术：限制性内切酶限制性内切酶、DNA连接酶连接酶及其他及其他工具酶工具酶的发的发现和应用。现和应用。（二）DNA重组技术的建立37（三）（三）DNA重组技术的应用重组技术的应用w可用于大量可用于大量生产生产某些在正常细胞代谢某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽；中产量很低的多肽；w可用于定向可用于定向改造改造某些生物基因组结构某些生物基因组结构w可用于基础可用于基础研究研究（三）DNA重组技术的应用38基因表达调控研究基因表达调控研究w 生物个体在生长发育过程中，基因表达生物个体在生长发育过程中，基因表达是按一定的时序发生变化（是按一定的时序发生变化（时序调节时序调节），），并随着内外环境的变化而不断加以修正并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控环境调控）的。基因表达调控研究的主）的。基因表达调控研究的主要方面有：要方面有：基因表达调控研究39（一）信号转导（一）信号转导（singnal transduction)信号转导信号转导：指外部信号通过细胞膜上的受：指外部信号通过细胞膜上的受体传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、体传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其他细胞功能方面的应答过程。细胞形状或其他细胞功能方面的应答过程。（一）信号转导（singnal transduction)40（二）（二）转录因子研究转录因子研究w转录因子转录因子：是指一群能与基因：是指一群能与基因55端端上游特定序列专一结合，从而保证上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。间与空间表达的蛋白质分子。（三）（三）RNA剪接研究剪接研究（二）转录因子研究41生物大分子结构功能研究生物大分子结构功能研究（又称结构（又称结构分子生物学）分子生物学）（一）概念：（一）概念：w是研究生物大分子特定的是研究生物大分子特定的空间结构空间结构及结构的及结构的运动变化运动变化与其生物学与其生物学功能功能关系的科学。关系的科学。生物大分子结构功能研究（又称结构分子生物学）42（二）结构分子生物学的研究方向：（二）结构分子生物学的研究方向：w结构测定；结构测定；w结构运动变化规律；结构运动变化规律；w结构与功能关系的建立。结构与功能关系的建立。（二）结构分子生物学的研究方向：43（三）结构分子生物学的研究手段（三）结构分子生物学的研究手段w物理和化学手段物理和化学手段：射线衍射的晶：射线衍射的晶体学（蛋白质晶体学）；二维和多体学（蛋白质晶体学）；二维和多维核磁共振；电镜三维重组、电子维核磁共振；电镜三维重组、电子衍射、中子衍射和各种频谱学方法；衍射、中子衍射和各种频谱学方法；化学合成；化学合成；w分子生物学手段分子生物学手段（三）结构分子生物学的研究手段44人类基因组计划简介 Human Genome Project，HGPw问题的提出问题的提出w7070年代对人类基因组的研究已具有年代对人类基因组的研究已具有一定的雏形；一定的雏形；w 1986 1986年著名遗传学家年著名遗传学家Mckusick V提出从整个基因组的层次研究遗传提出从整个基因组的层次研究遗传学的科学称学的科学称“基因组学基因组学”；人类基因组计划简介 Human Genome Projec45n同年，诺贝尔奖获得者同年，诺贝尔奖获得者Dulbecco R在在Science杂志上发表了题为杂志上发表了题为“癌症研究癌症研究的转折点的转折点人类基因组的全序列分人类基因组的全序列分析析”，得到了世界范围的响应；，得到了世界范围的响应；n19861986年美国能源部宣布实施这一草案年美国能源部宣布实施这一草案；同年，诺贝尔奖获得者Dulbecco R在Science杂志46n19871987年美国能源部（年美国能源部（DOE）和国）和国家健康研究院（家健康研究院（NIH）为）为HGP下下拔了经费拔了经费1.661.66亿美元，开始筹建亿美元，开始筹建HGP实验室；实验室；1987年美国能源部（DOE）和国家健康研究院（NIH）为H47w19881988美国成立了美国成立了“国家人国家人类基因组研究中心类基因组研究中心”由诺由诺贝尔奖获得者贝尔奖获得者Watson J出出任第一任主任。任第一任主任。1988美国成立了“国家人类基因组研究中心”由诺贝尔奖获得者48w世界的行动世界的行动w19871987年，意大利的国家研究委员年，意大利的国家研究委员会（会（NRC）组织了）组织了1515个（后来发个（后来发展到展到3030个）实验室，开始个）实验室，开始HGP的研究；的研究；w19891989年年2 2月，英国的月，英国的HGP开始启开始启动动;世界的行动49w19901990年年6 6月，法国的国家月，法国的国家HGP开始启开始启动；动；w同月，欧共体通过了同月，欧共体通过了“欧洲欧洲HGP研研究计划究计划”，主要资助，主要资助2323个实验室；个实验室；w19901990年年1010月月1 1日日 美国国会正式批准美国国会正式批准美国的美国的“HGP”启动，计划在启动，计划在1515年内年内投入至少投入至少3030亿美元进行人类全基因亿美元进行人类全基因组的分析；组的分析；1990年6月，法国的国家HGP开始启动；50w19941994年初，在吴旻、强伯勤、陈竺年初，在吴旻、强伯勤、陈竺院士和杨焕明教授的倡导下，中国院士和杨焕明教授的倡导下，中国的的HGP开始启动；开始启动；w19981998国家科技部在上海成立了中国国家科技部在上海成立了中国南方基因中心，由陈竺院士挂帅；南方基因中心，由陈竺院士挂帅；w19981998年年19991999年成立了中国科学院北年成立了中国科学院北京人类基因组中心和北方人类基因京人类基因组中心和北方人类基因组中心，由中科院遗传所的杨焕明组中心，由中科院遗传所的杨焕明教授，强伯勤院士等人牵头；教授，强伯勤院士等人牵头；1994年初，在吴旻、强伯勤、陈竺院士和杨焕明教授的倡导下，51w19951995年年6 6月，德国正式开始月，德国正式开始HGP。1995年6月，德国正式开始HGP。52w任务与进展任务与进展n遗传图谱遗传图谱（genetic map)：n定义定义w又称连锁图谱（又称连锁图谱（linkage map)或遗传连锁或遗传连锁图谱（图谱（genetic linkage map)，是指人类，是指人类基因组内基因以及专一的多态性基因组内基因以及专一的多态性DNA标记标记(marker)相对位置的图谱，其研究经历了相对位置的图谱，其研究经历了从经典的遗传图谱到现代遗传图谱的过程。从经典的遗传图谱到现代遗传图谱的过程。任务与进展53n经典的遗传图谱（以基因表型为经典的遗传图谱（以基因表型为标记）标记）n现代遗传图谱（以现代遗传图谱（以DNA为标记）为标记）w第一代多态性标记：限制性片段长第一代多态性标记：限制性片段长度多态性（度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP)，位，位点数目可达点数目可达10105 5以上。以上。经典的遗传图谱（以基因表型为标记）54w第二代多态性标记：小卫星第二代多态性标记：小卫星/可变数可变数量串联重复（量串联重复（minisatellite/variable number tandem repeat,VNTR)及微卫星及微卫星/简短串联重复简短串联重复（microsatellite/simple tandem repeat,STR)。个数在。个数在60006000个以上。个以上。其中其中STRSTR具高度多态性，具高度多态性，有的可形成几十种等位片段，是目有的可形成几十种等位片段，是目前在基因定位的研究中应用最多的前在基因定位的研究中应用最多的标记系统。标记系统。第二代多态性标记：小卫星/可变数量串联重复（minisate55w第三代多态性标记：单核苷酸多第三代多态性标记：单核苷酸多态性（态性（single nucleotide polymorphism,SNP)。这种标。这种标记在人类基因组中多达记在人类基因组中多达300300万个。万个。第三代多态性标记：单核苷酸多态性（single nucleo56n构建遗传图谱的基本原理：构建遗传图谱的基本原理：w真核生物在减数分裂过程中染色体真核生物在减数分裂过程中染色体进行重组和交换，染色体上任意两进行重组和交换，染色体上任意两点之间发生重组和交换的概率随着点之间发生重组和交换的概率随着两点之间相对距离的远近而发生变两点之间相对距离的远近而发生变化。化。构建遗传图谱的基本原理：57n构建遗传图谱的意义：构建遗传图谱的意义：w通过连锁分析，可以找到某一致通过连锁分析，可以找到某一致病基因或表型的基因与某一标记病基因或表型的基因与某一标记邻近（即紧密连锁）的证据，从邻近（即紧密连锁）的证据，从而可把这一基因定位于染色体的而可把这一基因定位于染色体的特定区域，再对基因进行分离和特定区域，再对基因进行分离和研究。研究。构建遗传图谱的意义：58n物理图谱物理图谱（physical map):：n定义定义w用物理学方法构建的由不同的用物理学方法构建的由不同的DNADNA结结构按其在染色体上的原始顺序和实构按其在染色体上的原始顺序和实际距离排列的图谱。际距离排列的图谱。物理图谱（physical map):：59n内容内容w基因组的细胞遗传学图基因组的细胞遗传学图（cytogenetic map，即染色体的，即染色体的区、带、亚带）；区、带、亚带）；w序列标签位点序列标签位点(sequence-tagged site,STS)图谱；图谱；内容60wDNA“重叠群重叠群(contig)”)”图谱：图谱：把基把基因组文库中含有相同因组文库中含有相同STS序列的序列的DNA克隆按照其在原始基因组上线克隆按照其在原始基因组上线形顺序进行排列，连接成相互重叠形顺序进行排列，连接成相互重叠的的“片段重叠群片段重叠群(contig)”)”。是构。是构建物理图谱的主要任务；建物理图谱的主要任务；DNA“重叠群(contig)”图谱：把基因组文库中含有相同61w大片段限制性内切酶切点图；大片段限制性内切酶切点图；wcDNA/EST图谱；图谱；w基因组中广泛存在的特征性序列基因组中广泛存在的特征性序列（如（如CpG序列、序列、Alu序列等）的标记序列等）的标记图等。图等。大片段限制性内切酶切点图；62n序列图谱：序列图谱：w20032003年之前完成。年之前完成。n基因图谱：基因图谱：w目标：在人类基因组中鉴别出全部目标：在人类基因组中鉴别出全部基因的位置、结构和功能；基因的位置、结构和功能；序列图谱：63w定位方法：定位方法：cDNA/EST的染色的染色体定位（实验手段，电子杂交）；体定位（实验手段，电子杂交）；w完成时间：完成时间：200200？年完成。？年完成。定位方法：cDNA/EST的染色体定位（实验手段，电子杂64n模式生物基因组：模式生物基因组：w酵母酵母19961996年年w大肠肝菌大肠肝菌19971997年年w线虫线虫19991999年年w果蝇果蝇20002000年年w拟南芥菜拟南芥菜20002000年年w小鼠小鼠20052005年之前完成年之前完成模式生物基因组：65