微生物检验技术培训

微生物检验技术微生物检验技术1微生物检验技术一、环境监测一、环境监测二、无菌检查二、无菌检查三、微生物限度检查三、微生物限度检查2一、环境监测无菌检查实验环境的修订无菌检查实验环境的修订修修订订依依据据及及意意义义：20212021版版GMPGMP附附录录一一 无无菌菌药药品品 和和附附录录三三 生生物物制制品品 中中均均规规定定，非非最最终终灭灭菌菌产产品品各各工工序序关关键键操操作作环环境境应应为为B B级级背背景景下下的的A A级级。无无菌菌检检查查的的洁洁净净环环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！境不得低于生产关键区的洁净环境要求！3一、环境监测微生物限度检查实验环境的修订微生物限度检查实验环境的修订4一、环境监测GMP2021年版对洁净度的规定及确认标准5一、环境监测药品洁净实验室监测工程及频次参考 6一、环境监测培养基培养基胰胰酪酪大大豆豆胨胨琼琼脂脂TSATSA 细细菌菌、酵酵母母菌菌和和霉霉菌菌的的生生长长必必要要时时可可参参加加添添加剂消除和减少消毒剂和抗生素的作用。，加剂消除和减少消毒剂和抗生素的作用。，沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂(SDA)(SDA)当当监监测测结结果果有有疑疑似似真真菌菌或或考考虑虑季季节节因因素素影影响响时时培养时间：培养时间：ChP(2021)GB/T 16293-2021 ChP(2021)GB/T 16293-2021 TSA:3-5 TSA:3-5天天 不少于不少于2 2天天 SDA:5-7 SDA:5-7天天 不少于不少于5 5天天7二、无菌检查1.1.总那么：环境、设备、人员总那么：环境、设备、人员2.2.培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查培养基：品种、制备、灭菌、贮存、适用性检查3.3.方法适用性试验：直接接种法、薄膜过滤法方法适用性试验：直接接种法、薄膜过滤法4.4.供供试试品品的的无无菌菌检检查查：供供试试品品的的处处理理、对对照照试试验验、直直接接接接种种法、薄膜过滤法、培养及观察法、薄膜过滤法、培养及观察5.5.结果判断结果判断8二、无菌检查1.1.总那么总那么1 1对象：对象：无无菌菌检检查查法法系系用用于于检检查查药药典典要要求求无无菌菌的的药药品品、生生物物制制品品、医医疗疗器器具具、原原料料、辅辅料料及及其其他他品品种种是是否否无无菌菌的的一一种种方方法法。假假设设供供试试品品符符合合无无菌菌检检查查法法的的规规定定,仅仅说说明明了了供供试试品品在在该该检检验验条条件件下下未未发发现现微微生生物污染。物污染。9二、无菌检查2 2环境：环境：应应在在无无菌菌条条件件下下进进行行，试试验验环环境境必必须须到到达达无无菌菌检检查查的的要要求求，?9203?9203 药药品品微微生生物物实实验验室室质质量量管管理理指指导导原原那那么么?:?:环环境境洁洁净净度度B B 级级背背景景下下的的局局部部A A 级级洁洁净净度度的的单单向向流流空空气气区区域域内内或或隔隔离离系系统统中中进进行行 【1010版版：应应在在环环境境洁洁净净度度1000010000级级下下的的局局部部洁洁净净度度100100级级的的单单向向流流空空气气区区域域内内或或隔隔离离系系统统中中进进行行】，其其全全过过程程应应严严格格遵遵守守无无菌菌操操作作，防防止止微微生生物物污污染染，防防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。A A 级级和和 B B 级级区区域域的的空空气气供供给给应应通通过过终终端端高高效效空空气气过过滤滤器器HEPAHEPA 。10二、无菌检查3 3人员：人员：【1010版版：无无菌菌检检查查人人员员必必须须具具备备微微生生物物专专业业知知识识，并并经过无菌技术的培训。】经过无菌技术的培训。】1515版删除。版删除。11二、无菌检查2 2、培养基、培养基12二、无菌检查2.2.培养基培养基硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基主主要要用用于于厌厌氧氧菌菌的的培培养养，也也可可用用于于需需气气菌培养。菌培养。胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。1 1培养基的制备及培养条件培养基的制备及培养条件配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌制备好的培养基应保存在制备好的培养基应保存在2 22525、避光的环境、避光的环境假假设设保保存存于于非非密密闭闭容容器器中中，一一般般在在3 3周周内内使使用用；假假设设保保存存于于密密闭容器中，一般可在一年内使用。闭容器中，一般可在一年内使用。13二、无菌检查2 2培养基适用性检查培养基适用性检查无无菌菌检检查查用用的的硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基和和胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养养基基等等应应符符合合培培养养基基的的无无菌菌性性检检查查及及灵灵敏敏度检查的要求。度检查的要求。本本检检查查可可在在供供试试品品的的无无菌菌检检查查前前或或与与供供试试品品的的无无菌检查同时进行。菌检查同时进行。14二、无菌检查2 2培养基适用性检查培养基适用性检查无菌性检查无菌性检查:每每批批培培养养基基随随机机取取不不少少于于 5 5 支支瓶瓶 ，置置各各培培养养基规定的温度培养基规定的温度培养 14 14天，应无菌生长。天，应无菌生长。灵敏度检查灵敏度检查 菌种菌种试试验验用用菌菌株株的的传传代代次次数数不不得得超超过过5 5 代代从从菌菌种种保保藏藏中中心心获获得得的的枯枯燥燥菌菌种种为为第第0 0 代代，并并采采用用适适宜宜的的菌菌种种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。菌液：浓度菌液：浓度100cfu/ml100cfu/ml接种：接种：2 2管管+菌液，菌液，1 1管空白管空白结果判断：结果判断：+菌液菌液-生长良好生长良好 空白空白-无菌生长无菌生长15二、无菌检查2 2灵敏度检查灵敏度检查 菌液制备菌液制备:取菌种新鲜培养物接种至相应培养基，培养。取菌种新鲜培养物接种至相应培养基，培养。上述培养物用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu的菌悬液。16二、无菌检查2 2培养基灵敏度检查培养基灵敏度检查培培养养基基接接种种:取取每每管管装装量量为为12ml12ml的的硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基7 7支支，每每管管装装量量为为9ml9ml的的胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养养基基7 7支支,分分别别接接种种相相应应菌菌液液。逐逐日日观观察察结结果。果。结果判定结果判定:空白对照管应无菌生长，假设加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵空白对照管应无菌生长，假设加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。敏度检查符合规定。17二、无菌检查3.3.方法适用性试验方法验证试验方法适用性试验方法验证试验当当进进行行产产品品无无菌菌检检查查法法时时，应应进进行行方方法法适适用用性性试试验验，以以确确认认所所采采用用的的方方法法适适合合于于该该产产品品的的无无菌菌检检查查。假假设设检检验验程程序序或或产产品品发发生生变变化化可可能能影影响响检检验验结结果果时时，应重新进行方法适用性试验。应重新进行方法适用性试验。验验证证时时，按按“供供试试品品的的无无菌菌检检查查的的规规定定及及以以下下要要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。方方法法适适用用性性试试验验也也可可与与供供试试品品的的无无菌菌检检查查同同时时进进行行 。18二、无菌检查4.4.供试品的无菌检查供试品的无菌检查无菌检查法包括无菌检查法包括薄膜过滤法薄膜过滤法直接接种法直接接种法只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。供供试试品品无无菌菌检检查查所所采采用用的的检检查查方方法法和和检检验验条条件件应应与与方法适用性试验确认的方法相同。方法适用性试验确认的方法相同。无无菌菌试试验验过过程程中中，假假设设需需使使用用外外表表活活性性剂剂、灭灭活活剂剂、中中和和剂剂等等试试剂剂，应应证证明明其其有有效效性性，且且对对微微生生物物无无毒毒性。性。19二、无菌检查4.4.供试品的无菌检查供试品的无菌检查阳性对照阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对照菌：应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100CFU，供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养4872 小时应生长良好。阴阴性性对对照照供供试试品品无无菌菌检检查查时时，应应取取相相应应溶溶剂剂和和稀稀释释液液、冲冲洗洗液液同同法法操操作作，作作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。20二、无菌检查4.4.供试品的无菌检查供试品的无菌检查1.1.薄膜过滤法薄膜过滤法 薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。【10版删除：可用一般薄膜过滤器】。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45m。直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。【10版删除：抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。】使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。21二、无菌检查4.4.供试品的无菌检查供试品的无菌检查1.1.薄膜过滤法薄膜过滤法水水溶溶性性供供试试液液过过滤滤前前应应先先将将少少量量的的冲冲洗洗液液过过滤滤以以润润湿湿滤滤膜膜。油油类类供供试试品品，其其滤滤膜膜和和过过滤滤器器在在使使用用前前应应充充分分枯枯燥燥。为为发发挥挥滤滤膜膜的的最最大大过过滤滤效效率率，应应注注意意保保持持供供试试品品溶溶液液及及冲冲洗洗液液覆盖整个滤膜外表。覆盖整个滤膜外表。供供试试液液经经薄薄膜膜过过滤滤后后，假假设设需需要要用用冲冲洗洗液液冲冲洗洗滤滤膜膜，每每张张滤滤膜膜每每次次冲冲洗洗量量一一般般为为100ml100ml，且且总总冲冲洗洗量量不不得得超超过过1000ml1000ml，以防止滤膜上的微生物受损伤。，以防止滤膜上的微生物受损伤。22二、无菌检查2.2.直接接种法直接接种法 直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支/瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。23二、无菌检查4.4.供试品的无菌检查供试品的无菌检查培养及观察培养及观察将将上上述述接接种种供供试试品品后后的的培培养养基基容容器器分分别别按按各各培培养养基基规规定定的的温温度度培培养养1414天天；接接种种生生物物制制品品供供试试品品的的硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基的的容容器器应应分分成成两两等等份份，一一份份置置30303535培培养养，一一份份置置20202525培养。培养。培培养养期期间间应应逐逐日日观观察察并并记记录录是是否否有有菌菌生生长长。如如在在参参加加供供试试品品后后或或在在培培养养过过程程中中，培培养养基基出出现现浑浑浊浊，培培养养14 14 天天后后，不不能能从从外外观观上上判判断断有有无无微微生生物物生生长长，可可取取该该培培养养液液适适量量转转种种至至同同种种新新鲜鲜培培养养基基中中，培培养养3 3 天天，观观察察接接种种的的同同种种新新鲜鲜培培养养基基是是否否再再出出现现浑浑浊浊；或或取取培培养养液液涂涂片片，染染色色，镜镜检检，判判断断是是否否有有菌。菌。24二、无菌检查4.4.供试品的无菌检查供试品的无菌检查结果判断结果判断阳阳性性对对照照管管应应生生长长良良好好，阴阴性性对对照照管管不不得得有有菌菌生生长长。否否那那么么，试验无效。试验无效。假假设设供供试试品品管管均均澄澄清清，或或虽虽显显浑浑浊浊但但经经确确证证无无菌菌生生长长，判判供供试试品品符符合合规规定定；假假设设供供试试品品管管中中任任何何一一管管显显浑浑浊浊并并确确证证有有菌菌生生长长，判判供供试试品品不不符符合合规规定定，除除非非能能充充分分证证明明试试验验结结果果无无效效，即生长的微生物非供试品所含。即生长的微生物非供试品所含。25二、无菌检查4.4.供试品的无菌检查供试品的无菌检查结果判断结果判断当符合以下至少一个条件时方可判试验结果无效：当符合以下至少一个条件时方可判试验结果无效：1 1无无菌菌检检查查试试验验所所用用的的设设备备及及环环境境的的微微生生物物监监控控结果不符合无菌检查法的要求。结果不符合无菌检查法的要求。2 2回回忆忆无无菌菌试试验验过过程程，发发现现有有可可能能引引起起微微生生物物污污染的因素。染的因素。3 3供供试试品品管管中中生生长长的的微微生生物物经经鉴鉴定定后后，确确证证是是因因无无菌菌试试验验中中所所使使用用的的物物品品和和或或无无菌菌操操作作技技术术不不当引起的。当引起的。试试验验假假设设经经确确认认无无效效，应应重重试试。重重试试时时，重重新新取取同同量量供供试试品品，依依法法检检查查，假假设设无无菌菌生生长长，判判供供试试品品符符合规定；假设有菌生长，判供试品不符合规定。合规定；假设有菌生长，判供试品不符合规定。26三、微生物限度检查微生物计数法1 1 总那么：环境、要求总那么：环境、要求2 2 计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数法计数方法：平皿法、薄膜过滤法、最可能数法MPNMPN法法3 3 计计数数培培养养基基适适用用性性检检查查和和供供试试品品计计数数方方法法适适用用性性试试验验：菌菌种及菌液制备、培养基适用性检查、计数方法适用性试验、种及菌液制备、培养基适用性检查、计数方法适用性试验、4 4 供试品检查：检验量、供试品检查供试品检查：检验量、供试品检查5 5 结果判断结果判断27三、微生物限度检查微生物计数法1 1 总那么：总那么：微微生生物物计计数数法法系系用用于于能能在在有有氧氧条条件件下下生生长长的的嗜嗜温温细细菌菌和和真真菌菌的计数。的计数。当当本本法法用用于于检检查查非非无无菌菌制制剂剂及及其其原原、辅辅料料等等是是否否符符合合规规定定的的微微生生物物限限度度标标准准时时，应应按按规规定定进进行行检检验验，包包括括样样品品的的取取样样量量和和结结果果的的判判断断等等。除除另另有有规规定定外外，本本法法不不适适用用于于活活菌菌制制剂剂的的检查。检查。本本检检查查法法可可采采用用替替代代的的微微生生物物检检查查法法，包包括括自自动动检检测测方方法法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。28三、微生物限度检查微生物计数法1 1 总那么：总那么：环境：环境：微微生生物物计计数数试试验验环环境境应应符符合合微微生生物物限限度度检检查查的的要要求求。(在在不不低低于于GMP GMP 现现行行版版要要求求的的D D 级级洁洁净净环环境境、局局部部洁洁净净度度不不低低于于B B 级级的的单单向向流流空空气气区区域域内内进进行行)【1010版版：在在环环境境洁洁净净度度1000010000级级下下的局部洁净度的局部洁净度100100级的单向流空气区域内】。级的单向流空气区域内】。检检验验全全过过程程必必须须严严格格遵遵守守无无菌菌操操作作，防防止止再再污污染染，防防止止污污染染的措施不得影响供试品中微生物的检出。的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。29三、微生物限度检查微生物计数法1 1 总那么：总那么：如如供供试试品品有有抗抗菌菌活活性性，应应尽尽可可能能去去除除或或中中和和。供供试试品品检检查查时时,假假设设使使用用了了中中和和剂剂或或灭灭活活剂剂，应应确确认认其其有有效效性性及及对对微微生生物物无无毒毒性。性。供供试试液液制制备备时时如如果果使使用用了了外外表表活活性性剂剂，应应确确认认其其对对微微生生物物无无毒毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。30三、微生物限度检查微生物计数法2 2计数方法：计数方法：平皿法平皿法薄膜过滤法薄膜过滤法最可能数法最可能数法Most-Probable-NumberMethodMost-Probable-NumberMethod，简称，简称MPN MPN 法。法。MPN MPN 法法用用于于微微生生物物计计数数时时精精确确度度较较差差，但但对对于于某某些些微微生生物物污污染量很小的供试品，染量很小的供试品，MPN MPN 法可能是更适合的方法。法可能是更适合的方法。供供试试品品检检查查时时,应应根根据据供供试试品品理理化化特特性性和和微微生生物物限限度度标标准准等等因因素素选选择择计计数数方方法法，所所选选的的方方法法必必须须具具备备检检测测充充足足样样品品量量的的能能力力，以以保保证证所所获获得得的的试试验验结结果果能能够够判判断断供供试试品品是是否否符符合合规规定。所选方法的适用性须经确认。定。所选方法的适用性须经确认。31三、微生物限度检查微生物计数法3 3 计计数数培培养养基基适适用用性性检检查查和和供供试试品品计计数数方方法法适适用用性性试试验验供供试试品品微微生生物物计计数数中中所所使使用用的的培培养养基基应应进进行行适适用用性性检检查。查。供供试试品品的的微微生生物物计计数数方方法法应应进进行行方方法法适适用用性性试试验验【1010版版：方方法法验验证证】，以以确确认认所所采采用用的的方方法法适适合合于于该该产产品的微生物计数。品的微生物计数。假假设设检检验验程程序序或或产产品品发发生生变变化化可可能能影影响响检检验验结结果果时时，计数方法应重新进行适用性试验。计数方法应重新进行适用性试验。32三、微生物限度检查微生物计数法3 3 计数培养基适用性检查和计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品计数方法适用性试验3.13.1菌液制备及使用菌液制备及使用3.23.2计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查3.33.3计数方法适用性试验计数方法适用性试验33三、微生物限度检查微生物计数法 3 3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验3.13.1菌液制备及使用菌液制备及使用菌种菌种试试验验用用菌菌株株的的传传代代次次数数不不得得超超过过5 5 代代从从菌菌种种保保藏藏中中心心获获得得的的枯枯燥燥菌菌种种为为第第0 0 代代，并并采采用用适适宜宜的的菌菌种种保保藏藏技技术术进进行行保保存存，以以保保证证试试验验菌菌株株的的生生物物学学特特性。性。34三、微生物限度检查微生物计数法3.13.1菌液制备及使用菌液制备及使用35三、微生物限度检查微生物计数法3.23.2计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查【1515版版】36三、微生物限度检查微生物计数法3.23.2计数培养基适用性检查【计数培养基适用性检查【1515版】版】每一试验菌株平行制备每一试验菌株平行制备2 2 管或管或2 2 个平皿；接种个平皿；接种量不大于量不大于100cfu 100cfu；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试行上述试结果判定：结果判定：被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在上的菌落平均数的比值应在0.5-2 0.5-2 范围内，且范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。菌应生长良好。37三、微生物限度检查微生物计数法3.33.3计数方法适用性试验计数方法适用性试验供试液制备供试液制备接种和稀释接种和稀释抗菌活性的去除与灭活抗菌活性的去除与灭活供试品中微生物的回收供试品中微生物的回收平皿法平皿法薄膜过滤法薄膜过滤法最可能数法最可能数法MPN MPN 法法结果判断结果判断38三、微生物限度检查微生物计数法4 4 供试品检查供试品检查4.14.1检验量检验量检验量即一次试验所用的供试品量检验量即一次试验所用的供试品量g g、ml ml 或或cm cm。除除另另有有规规定定外外,一一般般供供试试品品的的检检验验量量为为10g 10g 或或10ml10ml；膜膜剂剂为为100cm 100cm；贵贵重重药药品品、微微量量包包装装药药品品的的检检验验量量可可以以酌酌减减。检检验验时时,应应从从2 2 个个以以上上最最小小包包装装单单位位中中抽抽取取供供试试品品,大大蜜蜜丸丸还还不不得少于得少于4 4 丸丸,膜剂还不得少于膜剂还不得少于4 4 片。片。一一般般应应随随机机抽抽取取供供试试品品，取取规规定定容容器器数数，混混合合，取取规规定定量量供供试品进行检验。试品进行检验。39三、微生物限度检查微生物计数法4.24.2供试品检查供试品检查按按计计数数方方法法适适用用性性试试验验确确认认的的计计数数方方法法进进行行供供试试品品中中需需氧氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。胰胰酪酪大大豆豆胨胨琼琼脂脂培培养养基基或或胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养养基基用用于于测测定定需氧菌总数；需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。阴性对照试验阴性对照试验 以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。40三、微生物限度检查微生物计数法4.24.2供试品检查供试品检查供试液制备供试液制备根根据据供供试试品品的的理理化化特特性性与与生生物物学学特特性性,采采取取适适宜宜的的方方法法制制备备供供试试液液。供供试试液液制制备备假假设设需需加加温温时时,应应均均匀匀加加热热,且且温温度度不不应应超超过过 4545。供试液从制备至参加检验用培养基。供试液从制备至参加检验用培养基,不得超过不得超过 1 1小时。小时。常常用用的的供供试试液液制制备备方方法法如如下下。如如果果以以下下供供试试液液制制备备方方法法经经确确认认均不适用，应建立其他适宜的方法。均不适用，应建立其他适宜的方法。41三、微生物限度检查微生物计数法4.24.2供试品检查供试品检查供试液制备供试液制备 水溶性供试品水溶性供试品 取取供供试试品品，用用 pH7.0 pH7.0 无无菌菌氯氯化化钠钠-蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲液液，或或pH7.2 pH7.2 磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液，或或胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养养基基溶溶解解或或稀稀释释制制成成 1:10 1:10 供供试试液液。假假设设需需要要，调调节节供供试试液液 pH pH 值值至至 6 68 8。必必要要时时，用用同同一一稀稀释释液液将将供供试试液液进进一一步步 1010倍倍系系列列稀稀释释。水水溶溶性性液液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。42三、微生物限度检查微生物计数法供试液制备供试液制备 水不溶性非油脂类供试品水不溶性非油脂类供试品 取取供供试试品品，用用 pH7.0 pH7.0 无无菌菌氯氯化化钠钠-蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲液液，或或 pH7.2 pH7.2 磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液，或或胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养养基基制制备备成成 1:10 1:10 供供试试液液。分分散散力力较较差差的的供供试试品品，可可在在稀稀释释液液中中参参加加外外表表活活性性剂剂如如 0.1%0.1%的的聚聚山山梨梨酯酯 8080，使使供供试试品品分分散散均均匀匀。假假设设需需要要，调调节节供供试试液液 pHpH值值至至 6 68 8。必必要要时时，用用同同一一稀稀释液将供试液进一步释液将供试液进一步 10 10倍系列稀释。倍系列稀释。43三、微生物限度检查微生物计数法供试液制备供试液制备油脂类供试品油脂类供试品 取取供供试试品品，参参加加无无菌菌十十四四烷烷酸酸异异丙丙酯酯使使溶溶解解，或或与与最最少少量量并并能能使使供供试试品品乳乳化化的的无无菌菌聚聚山山梨梨酯酯 8080或或其其他他无无抑抑菌菌性性的的无无菌菌外外表表活活性性剂剂充充分分混混匀匀。外外表表活活性性剂剂的的温温度度一一般般不不超超过过 4040特特殊殊情情况况下下，最最多多不不超超过过 4545，小小心心混混合合，假假设设需需要要可可在在水水浴浴中中进进行行，然然后后参参加加预预热热的的稀稀释释液液使使成成 110110供供试试液液，保保温温，混混合合，并并在在最最短短时时间间内内形形成成乳乳状状液液。必必要要时时，用用稀稀释释液液或或含含上上述述外外表表活活性性剂剂的的稀稀释释液液进进一一步步 1010倍系列稀释。倍系列稀释。44三、微生物限度检查微生物计数法 4.2 4.2供试品检查供试品检查平皿法平皿法平皿法包括倾注法和涂布法。平皿法包括倾注法和涂布法。除除另另有有规规定定外外，取取规规定定量量供供试试品品，按按方方法法适适用用性性试试验验确确认认的的方方法法进进行行供供试试液液制制备备和和菌菌数数测测定定，每每稀稀释释级级每每种种培培养养基基至至少少制备制备2 2个平皿。个平皿。培培养养和和计计数数 除除另另有有规规定定外外，胰胰酪酪大大豆豆胨胨琼琼脂脂培培养养基基平平板板在在30303535培培养养3 3天天，沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基平平板板在在20202525培培养养5 5 天天，观观察察菌菌落落生生长长情情况况,点点计计平平板板上上生生长长的的所所有有菌菌落落数数，必必要要时时可可适适当当延延长长培培养养时时间间至至7 7 天天进进行行菌菌落落计计数数并并报报告告。菌菌落落蔓蔓延延生生长长成成片片的的平平皿皿不不宜宜计计数数。点点计计菌菌落落数数后后，计计算算各各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规那么报告菌数。稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规那么报告菌数。假假设设同同稀稀释释级级两两个个平平皿皿的的菌菌落落数数平平均均值值不不小小于于1515，那那么么两两个个平皿的菌落数不能相差平皿的菌落数不能相差1 1 倍或以上。倍或以上。45三、微生物限度检查微生物计数法菌数报告规那么菌数报告规那么 需需氧氧菌菌总总数数测测定定宜宜选选取取平平均均菌菌落落数数小小于于 300cfu 300cfu 的的稀稀释释级级、霉霉菌菌和和酵酵母母菌菌总总数数测测定定宜宜选选取取平平均均菌菌落落数数小小于于100cfu 100cfu 的的稀稀释释级级，作作为为菌菌数数报报告告取取两两位位有有效效数数字字的的依依据据。取取最最高高的的平平均均菌菌落落数数，计计算算1g1g、1ml 1ml 或或10 cm 10 cm 供试品中所含的微生物数。供试品中所含的微生物数。如如各各稀稀释释级级的的平平皿皿均均无无菌菌落落生生长长，或或仅仅最最低低稀稀释释级级的的平平板板有有菌菌落落生生长长，但但平平均均菌菌落落数数小小于于1 1 时时，以以1 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。乘以最低稀释倍数的值报告菌数。46三、微生物限度检查微生物计数法薄膜过滤法薄膜过滤法除除另另有有规规定定外外，按按计计数数方方法法适适用用性性试试验验确确认认的的方方法法进进行行供供试试液液制制备备。取取相相当当于于1g1g、1ml 1ml 或或10 10 cm cm 供供试试品品的的供供试试液液，假假设设供供试试品品所所含含的的菌菌数数较较多多时时，可可取取适适宜宜稀稀释释级级的的供供试试液液，照照方方法法适适用用性性试试验验确确认认的的方方法法加加至至适适量量稀稀释释液液中中，立立即即过过滤滤，冲冲洗洗，冲冲洗洗后后取取出出滤滤膜膜，菌菌面面朝朝上上贴贴于于胰胰酪酪大大豆豆胨胨琼琼脂脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。培培养养和和计计数数 培培养养条条件件和和计计数数方方法法同同平平皿皿计计数数法法，每张滤膜上的菌落数应不超过每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu100cfu。47三、微生物限度检查微生物计数法菌数报告规那么菌数报告规那么 以以相相当当于于 1g1g、1ml 1ml 或或10cm210cm2供供试试品品的的菌菌落落数数报报告告菌菌数数；假假设设滤滤膜膜上上无无菌菌落落生生长长，以以1 1 报报告告菌菌数数每每张张滤滤膜膜过过滤滤1g1g、1ml 1ml 或或10cm210cm2供供试试品品,或或1 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。乘以最低稀释倍数的值报告菌数。48三、微生物限度检查微生物计数法MPN MPN 法法 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和供试品接种，所有试验管在3035培养35 天，如果需要确认是否有微生物生长，按方法适应性试验确定的方法进行。记录每一稀释级微生物生长的管数，从表3查对每1g 或1ml 供试品中需氧菌总数的最可能数。49三、微生物限度检查微生物计数法5 5结果判断结果判断需需氧氧菌菌总总数数是是指指胰胰酪酪大大豆豆胨胨琼琼脂脂培培养养基基上上生生长长的的总总菌菌落落数数包括真菌菌落数；包括真菌菌落数；霉霉菌菌和和酵酵母母菌菌总总数数是是指指沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基上上生生长长的的总总菌菌落数包括细菌菌落数。落数包括细菌菌落数。假假设设因因沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基上上生生长长的的细细菌菌使使霉霉菌菌和和酵酵母母菌菌的的计计数数结结果果不不符符合合微微生生物物限限度度要要求求，可可使使用用含含抗抗生生素素如如氯氯霉霉素素、庆庆大大霉霉素素的的沙沙氏氏葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基或或其其他他选选择择性性培培养基如玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数测定。养基如玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数测定。使使用用选选择择性性培培养养基基时时，应应进进行行培培养养基基适适用用性性检检查查。假假设设采采用用MPN MPN 法，测定结果为需氧菌总数。法，测定结果为需氧菌总数。50三、微生物限度检查微生物计数法5 5结果判断结果判断各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：101cfu101cfu：可接受的最大菌数为可接受的最大菌数为2020；102cfu102cfu：可接受的最大菌数为可接受的最大菌数为200200；103cfu103cfu：可接受的最大菌数为可接受的最大菌数为20002000：依此类推。：依此类推。假假设设供供试试品品的的需需氧氧菌菌总总数数、霉霉菌菌和和酵酵母母菌菌总总数数的的检检查查结结果果均均符符合合该该品品种种项项下下的的规规定定，判判供供试试品品符符合合规规定定；假假设设其其中中任任何何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。51三、微生物限度检查控制菌检查法2.2.非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法2.1 2.1 总那么：环境、要求总那么：环境、要求2.2 2.2 培培养养基基适适用用性性检检查查和和控控制制菌菌检检查查方方法法适适用用性性试试验验：菌菌种种及及菌菌液液制制备备、培培养养基基适适用用性性检检查查、控控制制菌菌检查方法适用性试验、检查方法适用性试验、2.3 2.3 供供试试品品检检查查：阴阴性性对对照照试试验验、阳阳性性对对照照试试验验、耐耐胆胆盐盐革革兰兰阴阴性性菌菌、大大肠肠埃埃希希菌菌、沙沙门门菌菌、铜铜绿绿假假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色念珠菌52三、微生物限度检查控制菌检查法2.12.1总那么总那么控控制制菌菌检检查查法法系系用用于于在在规规定定的的试试验验条条件件下下，检检查查供供试品中是否存在特定的微生物。试品中是否存在特定的微生物。当当本本法法用用于于检检查查非非无无菌菌制制剂剂及及其其原原、辅辅料料是是否否符符合合相相应应的的微微生生物物限限度度标标准准时时，应应按按以以下下规规定定进进行行检检验验，包括样品取样量和结果判断等。包括样品取样量和结果判断等。本本检检查查法法可可采采用用替替代代的的微微生生物物检检查查法法，包包括括自自动动检检测测方方法法，但但必必须须证证明明替替代代方方法法等等效效于于药药典典规规定定的的检检查方法。查方法。供供试试液液制制备备及及实实验验环环境境要要求求同同“非非无无菌菌产产品品微微生生物物限度检查：微生物计数法通那么限度检查：微生物计数法通那么11051105。如如果果供供试试品品具具有有抗抗菌菌活活性性，应应尽尽可可能能去去除除或或中中和和。供供试试品品检检查查时时,假假设设使使用用了了中中和和剂剂或或灭灭活活剂剂，应应确确认有效性及对微生物无毒性。认有效性及对微生物无毒性。供供试试液液制制备备时时如如果果使使用用了了外外表表活活性性剂剂，应应确确认认其其对对微微生生物物无无毒毒性性以以及及与与所所使使用用中中和和剂剂或或灭灭活活剂剂的的相相容容性。性。53三、微生物限度检查控制菌检查法2.2 2.2 培养基适用性检查和控制菌检查培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验方法适用性试验菌液制备菌液制备培养基的适用性检查培养基的适用性检查2.2.22.2.2控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查方法适用性试验控制菌检查方法适用性试验54三、微生物限度检查控制菌检查法菌液制备菌液制备55三、微生物限度检查控制菌检查法菌菌液液制制备备后后假假设设在在室室温温下下放放置置，应应在在2 2 小小时时内内使使用用；假假设设保保存存在在2 288，可可在在2424小小时时内内使使用用。生生孢孢梭梭菌菌孢孢子子悬悬液液可可替替代代新新鲜鲜的的菌菌悬悬液液，稳稳定定的的孢孢子子悬悬液液可可保保存存在在2 288，在在验证过的贮存期内使用。验证过的贮存期内使用。56三、微生物限度检查控制菌检查法2.2.22.2.2控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查，检查工程包括控制菌检查用培养基的适用性检查，检查工程包括促生长能力促生长能力抑制能力抑制能力指示能力指示能力各培养基的检测工程及所用菌株见表各培养基的检测工程及所用菌株见表1 1。57三、微生物限度检查控制菌检查法2.2.22.2.2控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查表表1 1控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示特性控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示特性58三、微生物限度检查控制菌检查法液体培养基促生长能力检查液体培养基促生长能力检查分分别别接接种种不不大大于于100cfu 100cfu 的的试试验验菌菌于于被被检检培培养养基基和和对对照照培培养养基基中中，在在相相应应控控制制菌菌检检查查规规定定的的培培养养温温度度及及不不长长于于规规定定的的最最短短培培养养时时间间下下培培养养，与与对对照照培培养养基基管管比比较较，被被检检培培养养基管试验菌应生长良好。基管试验菌应生长良好。固体培养基促生长能力检查固体培养基促生长能力检查用用涂涂布布法法分分别别接接种种不不大大于于100cfu 100cfu【1010版版：50100cfu50100cfu】的的试试验验菌菌于于被被检检培培养养基基和和对对照照培培养养基基平平板板上上，在在相相应应控控制制菌菌检检查查规规定定的的培培养养温温度度及及不不长长于于规规定定的的最最短短培培养养时时间间下下培培养养，被被检检培培养养基基与与对对照照培培养养基基上上生生长长的的菌菌落落大大小小、形形态态特特征征应应一致。一致。59三、微生物限度检查控制菌检查法培养基抑制能力检查培养基抑制能力检查接接种种不不少少于于100cfu 100cfu 的的试试验验菌菌于于被被检检培培养养基基和和对对照照培培养养基基中中，在在相相应应控控制制菌菌检检查查规规定定的的培培养养温温度度及及不不短短于于规规定定的的最最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。长培养时间下培养，试验菌应不得生长。培养基指示特性检查培养基指示特性检查用用涂涂布布法法分分别别接接种种不不大大于于100cfu 100cfu 的的试试验验菌菌于于被被检检培培养养基基和和对对照照培培养养基基平平板板上上，在在相相应应控控制制菌菌检检查查规规定定的的培培养养温温度度及及不不长长于于规规定定的的最最短短培培养养时时间间下下培培养养，被被检检培培养养基基上上试试验验菌菌生生长长的的菌菌落落大大小小、形形态态特特征征、指指示示剂剂反反响响情情况况等等应应与与对对照培养基一致。照培养基一致。60三、微生物限度检查控制菌检查法控制菌检查方法适用性试验控制菌检查方法适用性试验 试验菌试验菌根根据据各各品品种种项项下下微微生生物物限限度度标标准准中中规规定定检检查查的的控控制制菌菌选选择择相相应应试试验验菌菌株株，确确认认耐耐胆胆盐盐革革兰兰阴阴性性菌菌检检查查方方法法时时,采采用用大大肠肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。结果判断结果判断上上述述试试验验假假设设检检出出试试验验菌菌，按按此此供供试试液液制制备备法法和和控控制制菌菌检检查查方方法法进进行行供供试试品品检检查查；假假设设未未检检出出试试验验菌菌，应应消消除除供供试试品品的的抑菌活性，并重新进行方法适用性试验。抑菌活性，并重新进行方法适用性试验。如如果果经经过过试试验验确确证证供供试试品品对对试试验验菌菌的的抗抗菌菌作作用用无无法法消消除除，可可认认为为受受抑抑制制的的微微生生物物不不可可能能存存在在于于该该供供试试品品中中，选选择择抑抑菌菌成成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。61三、微生物限度检查控制菌检查法2.32.3供试品检查供试品检查供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。供试品检出控制菌或其他致病菌时供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准按一次检出结果为准,不再复试。不再复试。阳性对照试验阳性对照试验 阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌的加量应不大于100cfu。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验阴性对照试验 以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。62三、微生物限度检查控制菌检查法2.32.3供试品检查供试品检查控制菌检查过程：控制菌检查过程：使使用用无无选选择择性性增增菌菌培培养养基基胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养养基基培养，使受损的细菌得到修复，提高检出率。培养，使受损的细菌得到修复，提高检出率。增菌培养增菌培养-选择性增菌选择性增菌-选择性琼脂选择性琼脂63三、微生物限度检查控制菌检查法2.32.3供试品检查供试品检查耐胆盐革兰阴性菌耐胆盐革兰阴性菌【1010版：大肠菌群版：大肠菌群】大肠埃希菌大肠埃希菌沙门菌沙门菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌梭菌梭菌白色念珠菌白色念珠菌64三、微生物限度检查控制菌检查法耐胆盐革兰阴性菌【耐胆盐革兰阴性菌【1515版新增】版新增】供试液制备和预培养供试液制备和预培养取取供供试试品品，用用胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体作作为为稀稀释释剂剂照照“非非无无菌菌产产品品微微生生物物限限度度检检查查：微微生生物物计计数数法法 通通那那么么11051105制制成成1 1：10 10 供供试试液液，混混匀匀，在在20202525培培养养，培培养养时时间间应应使使供供试试品品中中的的细菌充分恢复但不增殖约细菌充分恢复但不增殖约2 2 小时。小时。定性试验定性试验除除另另有有规规定定外外，取取相相当当于于1g 1g 或或1mL 1mL 供供试试品品的的上上述述预预培培养养物物接接种种至至肠肠道道菌菌增增菌菌液液体体培培养养基基中中，30303535培培养养242448 48 小小时时后后，划划线线接接种种于于紫紫红红胆胆盐盐葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基平平板板上上，30303535培培养养181824 24 小小时时。如如果果平平板板上上无无菌菌落落生生长长，判判供供试试品品未检出耐胆盐革兰阴性菌。未检出耐胆盐革兰阴性菌。65三、微生物限度检查控制菌检查法耐胆盐革兰阴性菌【耐胆盐革兰阴性菌【1515版新增】版新增】定量试验定量试验选选择择和和别别离离培培养养 取取相相当当于于0.1g0.1g、0.01g 0.01g 和和0.001g0.001g或或0.1mL0.1mL、0.01mL 0.01mL 和和0.001mL0.001mL供供试试品品的的预预培培养养物物或或其其稀稀释释液液分分别别接接种种至至肠肠道道菌菌增增菌菌液液体体培培养养基基中中，30303535培培养养242448 48 小小时时。上上述述每每一一培培养养物物分分别别划划线线接接种种于于紫紫红红胆胆盐盐葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基平板上，平板上，30303535培养培养181824 24 小时。小时。结果判断结果判断假假设设紫紫红红胆胆盐盐葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基基平平板板上上有有菌菌落落生生长长，那那么么对对应应培培养养管管为为阳阳性性，否否那那么么为为阴阴性性。根根据据各各培培养养管管检检查查结结果果，从从表表2 2 查查对对1g 1g 或或1ml 1ml 供供试试品品中中含含有有耐耐胆胆盐盐革革兰兰阴阴性性菌菌的的最最大可能数。大可能数。66三、微生物限度检查控制菌检查法2.3.12.3.1大肠埃希菌【大肠埃希菌【1010版】版】取取供供试试液液10ml10ml相相当当于于供供试试品品lglg、lmllml、10cm)10cm)，直直接接或或处处理理后后接接种种至至适适量量不不少少于于100ml100ml的的胆胆盐盐乳乳糖糖培培养养基基中中，培培养养18182424小时，必要时可延长至小时，必要时可延长至4848小时。小时。取取上上述述培培养养物物0.2ml0.2ml，接接种种至至含含5ml 5ml MUGMUG培培养养基基的的试试管管内内，培培养养，于于5 5小小时时、2424小小时时在在366nm366nm紫紫外外光光下下观观察察，同同时时用用未未接接种种的的MUGMUG培培养养基基作作本本底底对对照照。假假设设管管内内培培养养物物呈呈现现荧荧光光，为为MUGMUG阳阳性性；不不呈呈现现荧荧光光，为为MUGMUG阴阴性性。观观察察后后，沿沿培培养养管管的的管管壁壁加加人人数数滴滴靛靛基基质质试试液液，液液面面呈呈玫玫瑰瑰红红色色，为为靛靛基基质质阳阳性性；呈呈试试剂剂本本色色，为为靛靛基基质质阴阴性性。本本底底对对照照应应为为MUGMUG阴阴性性和和靛靛基基质质阴性。阴性。67三、微生物限度检查控制菌检查法2.3.12.3.1大肠埃希菌【大肠埃希菌【1010版】版】如如MUGMUG阳阳性性、靛靛基基质质阳阳性性，判判供供试试品品检检出出大大肠肠埃埃希希菌菌；如如MUGMUG阴阴性性、靛靛基基质质阴阴性性，判判供供试试品品未未检检出出大大肠肠埃埃希希菌菌；如如MUGMUG阳阳性性、靛靛基基质质阴阴性性，或或MUGMUG阴阴性性、靛靛基基质质阳阳性性，那那么么应应取取胆胆盐盐乳乳糖糖培培养养基基的的培培养养物物划划线线接接种种于于曙曙红红亚亚甲甲蓝蓝琼琼脂脂培培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18182424小时。小时。假假设设平平板板上上无无菌菌落落生生长长或或生生长长的的菌菌落落与与表表3 3所所列列的的菌菌落落形形态态特特征征不不符符，判判供供试试品品未未检检出出大大肠肠埃埃希希菌菌。假假设设平平板板上上生生长长的的菌菌落落与与表表3 3所所列列的的菌菌落落形形态态特特征征相相符符或或疑疑似似，应应进进行行别别离离、纯纯化化、染染色色镜镜检检和和适适宜宜的的鉴鉴定定试试验验，确确认认是是否否为为大大肠埃希菌。肠埃希菌。68三、微生物限度检查控制菌检查法大肠埃希菌【大肠埃希菌【1515版】版】供试液制备和增菌培养供试液制备和增菌培养 取取供供试试品品，照照“非非无无菌菌产产品品微微生生物物限限度度检检查查：微微生生物物计计数数法法 通通那那么么11051105制制成成1 1：10 10 供供试试液液。取取相相当当于于1g 1g 或或1mL 1mL 供供试试品品的的供供试试液液，接接种种至至适适宜宜体体积积经经方方法法适适用用性性试试验验确确定定的的的的胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养养基基中中，混混匀匀，30303535培培养养181824 24 小时。小时。选择和别离培养选择和别离培养取取上上述述预预培培养养物物1mL 1mL 接接种种至至100mL 100mL 麦麦康康凯凯液液体体培培养养基基中中，42424444培培养养242448 48 小小时时。取取麦麦康康凯凯液液体体培培养养物物划划线线接接种种于于麦康凯琼脂培养基平板上，麦康凯琼脂培养基平板上，30303535培养培养181872 72 小时。小时。结果判断结果判断假假设设麦麦康康凯凯琼琼脂脂培培养养基基平平板板上上有有菌菌落落生生长长，应应进进行行别别离离、纯纯化化及及适适宜宜的的鉴鉴定定试试验验,确确证证是是否否为为大大肠肠埃埃希希菌菌；假假设设麦麦康康凯凯琼琼脂脂培培养养基基平平板板上上没没有有菌菌落落生生长长，或或虽虽有有菌菌落落生生长长但但鉴鉴定定结结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。69三、微生物限度检查控制菌检查法沙门菌沙门菌含含药药材材原原粉粉化化学学药药和和中中药药制制剂剂及及脏脏器器提提取取物物的的口口服服制制剂剂【1010版版：含含动动物物组组织织及及动动物物类类原原药药材材粉粉的的口口服服制剂】每制剂】每10g10g或或10ml10ml不得检出沙门菌不得检出沙门菌供试液制备和增菌培养供试液制备和增菌培养取取10g 10g 或或10mL 10mL 供供试试品品直直接接或或处处理理后后接接种种至至适适宜宜体体积积经经方方法法适适用用性性试试验验确确定定的的的的胰胰酪酪大大豆豆胨胨液液体体培培养基中，混匀，养基中，混匀，30303535培养培养181824 24 小时。小时。选择和别离培养选择和别离培养取取上上述述预预培培养养物物0.1mL 0.1mL 接接种种至至10mL 10mL RV RV 沙沙门门增增菌菌液液体体培培养养基基中中，30303535培培养养181824 24 小小时时。取取少少量量RV RV 沙沙门门菌菌增增菌菌液液体体培培养养物物划划线线接接种种于于木木糖糖赖赖氨氨酸酸脱脱氧氧胆胆酸酸盐盐琼琼脂脂培培养养基基平平板板上上，30303535培培养养181848 48 小小时。时。沙沙门门菌菌在在木木糖糖赖赖氨氨酸酸脱脱氧氧胆胆酸酸盐盐琼琼脂脂培培养养基基平平板板上上生生长长良良好好，菌菌落落为为淡淡红红色色或或无无色色、透透明明或或半半透透明明、中中心心有有或或无无黑黑色色。用用接接种种针针挑挑选选疑疑似似菌菌落落于于三三糖糖铁铁琼琼脂脂培培养养基基高高层层斜斜面面上上进进行行斜斜面面和和高高层层穿穿刺刺接接种种，培养培养181824 24 小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。小时，或采用其它适宜方法进一步鉴定。70三、微生物限度检查控制菌检查法沙门菌沙门菌结果判断结果判断假假设设木木糖糖赖赖氨氨酸酸