中药中黄曲霉毒素的检测课件

目录目录真菌毒素简介真菌毒素简介黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素检测药典收载情况黄曲霉毒素检测药典收载情况药典检测方法详解药典检测方法详解注意事项及实验室建议注意事项及实验室建议1中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024真菌毒素简介真菌毒素简介真菌毒素真菌毒素：由产毒真菌在适宜的环境条件下产：由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，由真菌菌核产生。生的有毒代谢产物，由真菌菌核产生。Mycotoxin：源于希腊语（：源于希腊语（Mykes）和拉丁语）和拉丁语（Toxicum）2中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024常见真菌毒素分类常见真菌毒素分类真菌种类真菌种类所产毒素所产毒素曲霉属曲霉属黄曲霉毒素、赭曲霉毒素黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A镰刀菌属镰刀菌属玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、呕毒素、呕吐毒素、伏马毒素吐毒素、伏马毒素青霉属青霉属展青霉素、桔青霉素展青霉素、桔青霉素3中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024真菌毒素监控意义真菌毒素监控意义真菌毒素对食品安全的危害真菌毒素对食品安全的危害真菌毒素对种、养殖业的危害真菌毒素对种、养殖业的危害真菌毒素对制药行业的危害（中药）真菌毒素对制药行业的危害（中药）国际贸易中作为技术壁垒国际贸易中作为技术壁垒在国际反恐和战争中，真菌毒素可作为大规模在国际反恐和战争中，真菌毒素可作为大规模杀伤性生化武器杀伤性生化武器4中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素概述黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次生代谢产物次生代谢产物5中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024黄曲霉毒素的发现黄曲霉毒素的发现1960年，在英国东南部一些农场中，有大约年，在英国东南部一些农场中，有大约10万只火鸡不明原由地突然死亡。万只火鸡不明原由地突然死亡。1961年发现火鸡饲料中混有的花生粉能够使大年发现火鸡饲料中混有的花生粉能够使大鼠诱发肝癌。鼠诱发肝癌。1962年，研究发现花生粉中含有一种荧光物质年，研究发现花生粉中含有一种荧光物质是导致。火鸡死亡的病因，这种荧光物质被证是导致。火鸡死亡的病因，这种荧光物质被证实为黄曲霉的代谢产物，故命名为实为黄曲霉的代谢产物，故命名为“黄曲霉毒黄曲霉毒素素(Aflatoxins)”。6中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024存在极其广泛存在极其广泛主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭主要存在于土壤，动植物及各种坚果中。家庭自制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素。自制发酵食品等也经常发现黄曲霉毒素。一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。的检出率比较高。未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生，在未能及时晒干或储藏不当的粮食容易产生，在农作物正常的生长期中也可以形成。农作物正常的生长期中也可以形成。7中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024毒性极强毒性极强1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构（的癌症研究机构（IARC）划定为）划定为类致癌物，类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒毒素，是一种毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒毒素，是目前已知霉菌中毒性最强的。是目前已知霉菌中毒性最强的。急性毒性：比氰化钾大急性毒性：比氰化钾大10倍，比砒霜大倍，比砒霜大68倍倍慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。也有轻度的病变。8中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024中药中容易产生黄曲霉毒素的品种中药中容易产生黄曲霉毒素的品种种子、果实、粮谷类中药材种子、果实、粮谷类中药材发酵类中药材发酵类中药材动物类中药材动物类中药材油性成分多的中药材油性成分多的中药材含上述种类药材的中成药含上述种类药材的中成药9中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024黄曲霉毒素的种类及性质黄曲霉毒素的种类及性质根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不同，分为分为B族族和和G族族两大类及其衍生物两大类及其衍生物G族蓝色荧光蓝色荧光黄绿色荧光黄绿色荧光10中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024化学结构化学结构基本结构：是一组化学结构类似的基本结构：是一组化学结构类似的二呋二呋喃香豆素喃香豆素的衍生化合物的衍生化合物目前发现约目前发现约20余种余种，已分离鉴定出，已分离鉴定出12种：种：B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。和毒醇。B1：最常见、毒性及致癌性最强：最常见、毒性及致癌性最强11中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024化学结构式化学结构式12中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024理化性质理化性质黄曲霉毒素相对分子量黄曲霉毒素相对分子量312346难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚在中性及酸性溶液中较稳定，但在在中性及酸性溶液中较稳定，但在pH为为13的强的强酸性溶液中稍有分解，在酸性溶液中稍有分解，在pH为为910的的碱性溶液中碱性溶液中分解迅速分解迅速13中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024纯品为无色结晶纯品为无色结晶耐高温，黄曲霉毒素耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为的分解温度为268紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性14中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024黄曲霉毒素现有检测方法介绍黄曲霉毒素现有检测方法介绍薄层层析法：灵敏度低，定量困难薄层层析法：灵敏度低，定量困难HPLC-紫外检测法：不衍生，灵敏度低，采用紫外检测法：不衍生，灵敏度低，采用UPLC可以增强灵敏度可以增强灵敏度HPLC-荧光检测法：需衍生，灵敏度高荧光检测法：需衍生，灵敏度高高效液相色谱高效液相色谱-串联质谱法：不需衍生，灵敏度串联质谱法：不需衍生，灵敏度高，假阳性少，成本高高，假阳性少，成本高15中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024免疫化学分析方法免疫化学分析方法 酶联免疫吸附法：酶联免疫吸附法：快速、简便、单一毒素、假快速、简便、单一毒素、假阳多阳多 免疫亲和柱免疫亲和柱-荧光分光光度法荧光分光光度法：高效、无毒、假：高效、无毒、假阳多阳多 微柱筛选法微柱筛选法：半定量，测总量：半定量，测总量 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法：快速、现：快速、现场大批量初筛场大批量初筛16中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024黄曲霉毒素检测药典收载情况黄曲霉毒素检测药典收载情况2005年增补本附录年增补本附录 第一次增加了黄曲霉毒素测定法第一次增加了黄曲霉毒素测定法2010年版一部年版一部 正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品种项下增加了黄曲霉毒素残留量检查种项下增加了黄曲霉毒素残留量检查 附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法17中药中黄曲霉毒素的检测5/22/20242010年版一部第二增补本年版一部第二增补本修订了附录方法修订了附录方法 删除了流速规定删除了流速规定 增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法增订了另一种衍生方法：即光化学衍生法 取消了免疫亲和柱的品牌规定取消了免疫亲和柱的品牌规定2015年版四部通则年版四部通则2351黄曲霉毒素测定法黄曲霉毒素测定法 增加了第二法：高效液相色谱增加了第二法：高效液相色谱-串联质谱法串联质谱法 增加附注：增加附注：“当测定结果超出限度时，采用第二当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认法进行确认”18中药中黄曲霉毒素的检测5/22/20242015年版四部通则增加年版四部通则增加中药中真菌毒素测定指导中药中真菌毒素测定指导原则原则 基本原则（中药中真菌毒素的分类、监控品种、基本原则（中药中真菌毒素的分类、监控品种、测定方法、限值拟定）测定方法、限值拟定）基本内容（高效液相色谱法、高效液相色谱基本内容（高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱质谱联用法）联用法）19中药中黄曲霉毒素的检测5/22/20242015年版四部通则年版四部通则9302 中药有害残留物限量制中药有害残留物限量制定指导原则定指导原则中关于黄曲霉毒素的规定中关于黄曲霉毒素的规定 “由于黄曲霉毒素毒性强，目前国际上由于黄曲霉毒素毒性强，目前国际上不建议设不建议设定黄曲霉毒素的安全耐受量和无毒作用剂量定黄曲霉毒素的安全耐受量和无毒作用剂量，也无最大限量理论值计算公式，限量越低越好也无最大限量理论值计算公式，限量越低越好”。20中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024中国药典中国药典20152015年版正文收载品种年版正文收载品种根及根茎类：远志根及根茎类：远志果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟郎、酸枣仁、薏苡仁郎、酸枣仁、薏苡仁动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣共共19种种，较，较2010年版药典年版药典增加增加14种种21中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024黄曲霉毒素药典检测方法详解黄曲霉毒素药典检测方法详解液相条件：液相条件：C18，甲醇，甲醇-乙腈乙腈-水（水（40:18:42）衍生方式：衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化学衍生柱后碘衍生、柱后光化学衍生混合对照品溶液的制备：混合对照品溶液的制备：液体标液液体标液（B1B2G1G2=10.310.3 ug/ml）梯度稀释）梯度稀释500倍倍22中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：15g粉末，粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫亲和柱纯化甲醇提取，免疫亲和柱纯化测定：测定：吸取混合对照品溶液吸取混合对照品溶液5l、10l、15l、20l、25l，注入色谱仪，绘制标准曲线。，注入色谱仪，绘制标准曲线。吸取供试品溶液吸取供试品溶液20-25l，测定，测定23中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024方法来源：方法来源：中国药典中国药典2015年版四部通则年版四部通则2351黄曲霉毒素测定法黄曲霉毒素测定法基本步骤基本步骤 提取提取 净化（活化、上样、洗杂、洗脱）净化（活化、上样、洗杂、洗脱）测定测定 随行质量控制（质控样、随行加样回收）随行质量控制（质控样、随行加样回收）24中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024泵流操作架泵流操作架免疫亲和柱免疫亲和柱HPLC-荧光检测器荧光检测器光化学衍生器光化学衍生器自动固相萃取仪自动固相萃取仪25中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024净化步骤净化步骤取取15ml（离心后的提取液），加水至（离心后的提取液），加水至50ml滤过，取滤过，取20ml，通过免疫亲和柱，通过免疫亲和柱，流速流速3ml/min加水洗涤两次，每次加水洗涤两次，每次10ml过空气过空气10秒，将水挤出柱子秒，将水挤出柱子分次加甲醇分次加甲醇1.5ml，自然洗脱，过空气，定容至，自然洗脱，过空气，定容至2ml26中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024免疫亲和柱的原理免疫亲和柱的原理利用利用抗原抗体免疫反抗原抗体免疫反应应的原理，使用大剂量的原理，使用大剂量的单克隆抗体，选择性的单克隆抗体，选择性的将样品提取液中的黄的将样品提取液中的黄曲霉毒素吸附，用水将曲霉毒素吸附，用水将杂质洗脱除去，再用甲杂质洗脱除去，再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗醇定量将黄曲霉毒素洗脱，达到分离净化目的脱，达到分离净化目的黄曲霉毒素黄曲霉毒素单克隆抗体单克隆抗体杂质杂质27中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024黄曲霉毒素的衍生化黄曲霉毒素的衍生化衍生原因衍生原因 黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1、G1荧光遇水要淬灭荧光遇水要淬灭，检测前需要，检测前需要衍生化衍生化28中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024药典附录收载的两种衍生方法药典附录收载的两种衍生方法 碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有要求，试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗求，试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗 光化学衍生法：紫外光灯（光化学衍生法：紫外光灯（254nm）照射，）照射，操作简单，对衍生温度无要求，不需要其他操作简单，对衍生温度无要求，不需要其他衍生剂，无需冲洗衍生剂，无需冲洗 对黄曲霉毒素对黄曲霉毒素B1和和G1进行衍生进行衍生，黄曲霉毒素，黄曲霉毒素B2和和G2不受该衍生步骤的影响不受该衍生步骤的影响29中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024AFB1AFG1黄曲霉毒素的衍生化黄曲霉毒素的衍生化30中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024黄曲霉毒素的衍生化黄曲霉毒素的衍生化31中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024结果报告结果报告低低于于检检测测限限（标标出出检检测测限限）报报告告具具体体值值未检出未检出限度内限度内限度外限度外报报告告具具体体值值32中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024方法难点方法难点痕量分析痕量分析ppb级，要求高灵敏度级，要求高灵敏度毒性强，具有一定的风险性毒性强，具有一定的风险性安全防护措施安全防护措施基质复杂基质复杂33中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024注意事项注意事项取样的代表性取样的代表性 黄曲霉毒素在样品中分布不均匀黄曲霉毒素在样品中分布不均匀免疫亲和柱的使用免疫亲和柱的使用 储存、使用温度（使用说明书）储存、使用温度（使用说明书）安全防护安全防护 操作人员专门培训，全程穿工作服佩戴手套操作人员专门培训，全程穿工作服佩戴手套注意事项及实验室建议注意事项及实验室建议34中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024对照品的使用对照品的使用 使用黄曲霉毒素混合对照品使用黄曲霉毒素混合对照品，不使用黄曲霉毒，不使用黄曲霉毒素固体纯品自行配置素固体纯品自行配置 对照品贮备液避光、低温、密闭保存，对照品贮备液避光、低温、密闭保存，工作液工作液现配现用现配现用35中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024试验废弃物处理试验废弃物处理 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应泡在专用贮存容器（含应泡在专用贮存容器（含10%次氯酸钠溶液内，次氯酸钠溶液内，浸泡浸泡24小时小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净）净）流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常流动相单独收集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理规处理36中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024实验室的建议实验室的建议专门的仪器设备和场所专门的仪器设备和场所安全措施安全措施废弃物废弃物37中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024谢谢！谢谢！38中药中黄曲霉毒素的检测5/22/2024