克隆基因的表达课件

第7章 克隆基因的原核表达第7章 克隆基因的原核表达第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达basic process of DNA recombination in vitro体外体外DNA重组的基本步骤重组的基本步骤2.2.重组体的制备重组体的制备：将目的基因的将目的基因的DNADNA片断连接到能自我复制并带有选择性标记片断连接到能自我复制并带有选择性标记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上 （DNADNA重组过程，需要各种重组过程，需要各种工具酶工具酶的参的参与）与）3.3.重组体的转化：重组体的转化：将重组体（载体）转入适当将重组体（载体）转入适当的受体细胞的受体细胞中。中。4.4.克隆鉴定克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。*1.1.目的基因的获取目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCRPCR扩增等步扩增等步骤，分离出带有骤，分离出带有目的基因的目的基因的DNADNA片断。片断。25.5.目的基因表达：目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物basic process of DNA recombina第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达原核生物中基因的表达操纵子操纵子多顺反子多顺反子mRNA多肽多肽转录转录翻译翻译原核生物中基因的表达操纵子多顺反子mRNA多肽转录翻译第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达真核生物中基因的表达基因基因前体前体mRNA成熟成熟mRNA（单顺反子）（单顺反子）蛋白质前体蛋白质前体成熟蛋白质成熟蛋白质转录转录转录后加工转录后加工转运，翻译转运，翻译翻译后加工翻译后加工真核生物中基因的表达基因前体mRNA成熟mRNA（单顺反第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达 表达体表达体 载体载体 宿主宿主第一代 原核生物表达体系 质粒、噬菌体 细菌第二代 酵母表达体系 穿梭质粒 酵母第三代 哺乳类细胞表达体系 病毒、脂质体 培养细胞第四代 基因直接导入 DNA本身 生殖细胞、体细胞、个体表达体系的发展 表达体 载体 第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达contents1 外源基因在原核生物外源基因在原核生物(大肠杆菌、枯草芽孢杆大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、农杆菌等菌、农杆菌等)中的表达中的表达2 外源基因在真核生物（酵母、植物、动物）外源基因在真核生物（酵母、植物、动物）中的表达中的表达 contents1 外源基因在原核生物(大肠杆菌、枯草芽孢杆第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达 1 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达1.1原核生物基因表达的特点原核生物基因表达的特点1.2 外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构的结构1.3几种类型的原核表达载体几种类型的原核表达载体1.4提高基因表达效率的途径提高基因表达效率的途径 1 外源基因在原核细胞中的表达1.1原核生物基因表达的特点第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达1.1 原核生物基因表达的特点原核生物基因表达的特点 只有只有一种一种RNA聚合酶聚合酶(真核细胞有三种真核细胞有三种)：催化所有：催化所有RNA的合成。的合成。基因的表达是基因的表达是以操纵子为单位以操纵子为单位的。的。原核生物无核膜，所以原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。的，也是连续进行的。原核基因原核基因一般不含有内含子一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中，在原核细胞中缺乏真核缺乏真核细胞的转录后加工系统细胞的转录后加工系统。原核生物基因的原核生物基因的控制主要在转录水平控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。物的直接控制要慢。mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及同的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及同16S核核糖体糖体RNA 3末端碱基互补的序列，即末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则序列，而真核基因则缺乏此序列。缺乏此序列。1.1 原核生物基因表达的特点 只有一种RNA聚合酶(真核第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达外源基因在原核细胞中表达的必要条件外源基因在原核细胞中表达的必要条件 通通过过表表达达载载体体将将外外源源基基因因导导入入宿宿主主菌菌，并并指指导导宿宿主主菌菌的的酶系统合成外源蛋白；酶系统合成外源蛋白；外外源源基基因因不不能能带带有有内内含含子子，因因而而必必须须用用cDNA或或全全化化学学合成基因，而不能用基因组合成基因，而不能用基因组DNA；必必须须利利用用原原核核细细胞胞的的强强启启动动子子和和SD序序列列等等调调控控元元件件控控制外源基因的表达；制外源基因的表达；外外源源基基因因与与表表达达载载体体连连接接后后，必必须须形形成成正正确确的的开开放放阅阅读读框框(open reading frame，ORF)；利利用用宿宿主主菌菌的的调调控控系系统统，调调节节外外源源基基因因的的表表达达，防防止止外外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。源基因的表达产物对宿主菌的毒害。外源基因在原核细胞中表达的必要条件 通过表达载体将外源基因第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有全基因组测序，共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物*大肠杆菌是最常用大肠杆菌是最常用的原核表达宿主菌。的原核表达宿主菌。大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素*大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能*第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达理想的大肠杆菌表达载体（1）稳定的遗传）稳定的遗传复制复制、传代能力，在无选择压力下能存、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。在于大肠杆菌细胞内。（2）具有显性的转化）具有显性的转化筛选标记筛选标记。（3）启动子启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。较低。（4）启动子的转录的）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置能够在适当的位置终止终止，转，转录过程不影响表达载体的复制。录过程不影响表达载体的复制。（5）具备适用于外源基因插入的）具备适用于外源基因插入的酶切位点酶切位点。复制起始位点、筛选标志、启动子、转录终止子、核糖体复制起始位点、筛选标志、启动子、转录终止子、核糖体结合位点和多克隆位点是构成表达载体的最基本元件。结合位点和多克隆位点是构成表达载体的最基本元件。理想的大肠杆菌表达载体（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达1.2外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构转录水平转录水平翻译水平翻译水平1.1.启动子启动子2.2.转录终止子转录终止子3.核糖体结合位点核糖体结合位点4.密码子密码子5.质粒拷贝数质粒拷贝数1.2外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构转录水平翻第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达P tac=3 P trp=11 P lac启动子-35 区序列-10 区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lLT T G A C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 1.2.1 原核表达载体常用的启动子启动子强弱取决于启动子强弱取决于-35区和区和-10区区的碱基组成及其间隔序列的碱基组成及其间隔序列 P tac=3 P trp=11 P lac启动子-第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达 Tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5（抗葡萄糖代谢阻遏的突变型大肠杆菌）的 10 序列拼接而成的杂合启动子。调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5启动子（P tac=3 P trp=11 P lac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。启动子-35 区序列-10 区序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T（1）Tac表达系统 Tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 la第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达Lac和Tac表达系统是最早建立并得到广泛应用的表达系统。大肠杆菌 JM109 等菌株常被选用为 Lac、Tac表达系统的宿主菌。lac、tac 启动子的宿主菌lac、tac 启动子的宿主菌第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达IPTG（异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于诱导 lac、tac 启动子的转录，但由于 IPTG 本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG 解决方法1.lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控（使用阻遏蛋白lacI的温度敏感突变株lacI（ts）。在较低温度（30）时外源基因表达受到抑制，在较高温度（42）时则开放。）2.乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录lac、tac 表达系统存在的问题 IPTG（异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于诱导 la第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达IPTG IPTG 诱导诱导PGEXPGEX系列表达载体的表达系列表达载体的表达原核表达载体原核表达载体PGEXPGEX系列带有系列带有一个一个“tac”tac”强启动子，载强启动子，载体上还携带体上还携带LaclqLaclq基因，编基因，编码码LacLac抑制因子，当无抑制因子，当无IPTGIPTG存在时，存在时，LacLac阻遏蛋白能抑阻遏蛋白能抑PtacPtac转录，保持低水平表达转录，保持低水平表达。加入诱导物。加入诱导物IPTGIPTG时它可与时它可与LacLac阻遏蛋白结合，导致其阻遏蛋白结合，导致其构象变化，起到去阻遏作用构象变化，起到去阻遏作用，起动转录，高效表达。，起动转录，高效表达。GST基因基因IPTG 诱导PGEX系列表达载体的表达原核表达载体PGEX第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达以以噬菌体早期基因转录启动子噬菌体早期基因转录启动子 P PL L、P PR R 为核心构为核心构建的表达系统建的表达系统 PL、PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts)的基因产物来调控 PL、PR 启动子的转录。（2）PL和PR表达系统以噬菌体早期基因转录启动子 PL、PR 为核心构建的表第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达PL 和 PR 表达系统存在的问题由由于于 PL 和和 PR 表表达达系系统统诱诱导导时时不不加加化化学学诱诱导导剂剂，成成本本又又低低廉廉，最最初初几几个个在在大大肠肠杆杆菌菌中中制制备备的的药药用用重重组组蛋蛋白白质质都都采采用用 PL 或或 PR 表达系统。表达系统。但但在在热热脉脉冲冲诱诱导导过过程程中中，大大肠肠杆杆菌菌热热休休克克蛋蛋白白的的表表达达也也会会被被激激活活，其其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在在大大体体积积发发酵酵培培养养菌菌体体时时，通通过过热热平平衡衡交交换换方方式式把把培培养养温温度度从从30提提高高到到 42 需需要要较较长长的的时时间间，这这种种缓缓慢慢的的升升温温方方式式影影响响诱诱导导效效果果，对对重组蛋白表达量有一定的影响。重组蛋白表达量有一定的影响。PL 和 PR 表达系统存在的问题由于 PL 和 PR 表第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达大大肠肠杆杆菌菌 T7 T7 噬噬菌菌体体具具有有一一套套专专一一性性非非常常强强的的转转录录体体系系，利利用用这这一一体体系系中中的的元元件件为为基基础础构构建建的的表表达达系系统统称称为为 T7 T7 表表达系统。达系统。T7T7表表达达系系统统表表达达目目的的基基因因的的水水平平是是目目前前所所有有表表达达系系统统中中最最高的。高的。pET系系列列载载体体是是这这类类表表达达载载体体的的典典型型代代表表。pETpET系系统统是是有有史以来在史以来在E.coliE.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统常常用用宿宿主主细细胞胞为为大大肠肠杆杆菌菌菌菌株株BL21BL21（DE3DE3）（因因为为菌菌株株BL21BL21（DE3DE3）的染色体能表达）的染色体能表达T7 T7 噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶）聚合酶）等。等。（3）T7表达系统大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达T7 T7 噬噬 菌菌 体体 基基 因因 1 1编编 码码 的的 T7 T7 RNARNA聚聚 合合 酶酶 选选 择择 性性 的的 激激 活活 T7T7噬噬 菌菌 体体 启启 动子动子的转录。的转录。T7 T7 RNARNA聚聚合合酶酶活活性性高高，其其合合成成RNARNA的的速速度度比比大大肠肠杆杆菌菌RNARNA聚聚合合酶酶快快5 5倍倍左左右右。并可以转录某些不能被大肠杆菌并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNARNA聚合酶有效转录的序列。聚合酶有效转录的序列。在在细细胞胞中中存存在在T7 T7 RNARNA聚聚合合酶酶和和T7T7噬噬茵茵体体启启动动子子的的情情形形下下，大大肠肠杆杆菌菌宿宿主主本本身身基基因因的的转转录录竞竞争争不不过过T7T7噬噬菌菌体体转转录录体体系系，最最终终受受T7T7噬噬菌菌体体启启动动子子控控制制的的基因的转录达到很高的水平。基因的转录达到很高的水平。常见的有常见的有化学诱导型、温度诱导型化学诱导型、温度诱导型等。等。T7 表达系统T7 噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达克隆基因的表达课件第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达克隆基因的表达课件第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达（4）其他表达系统营养调控型、糖原调控型、营养调控型、糖原调控型、pH调控型等调控型等（4）其他表达系统营养调控型、糖原调控型、pH调控型等第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 RNA 混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。1.2.2 转录终止子目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上的操纵子上的 rrnT1T2 以及以及 T7 噬菌体噬菌体 DNA 上的上的 Tf f。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联二聚体终止子串联的特的特殊结构，以增强其转录终止作用殊结构，以增强其转录终止作用外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 R第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动转录启动的频率的频率，而且在很大程度上还与，而且在很大程度上还与 mRNA mRNA 的的翻译起始效率翻译起始效率密切密切相关。相关。mRNA mRNA 翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其 55端的结构序列所决定，端的结构序列所决定，称为称为核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBSRBS）通常在通常在AUGAUG上游上游3-11bp3-11bp，长约，长约3-9bp,3-9bp,5 UAAGGAGG 31.2.3 核糖体结合位点（RBS）外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达一般来说，一般来说，mRNA mRNA 与核糖体的结合程度与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于率就越高，而这种结合程度主要取决于 SDSD（UAAUAAGGAGGGAGG G）序）序列与列与16S rRNA16S rRNA的碱基互补性，其中以的碱基互补性，其中以 GGAGGGAG 四个碱基序列尤四个碱基序列尤为重要。为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C C或或T T，均会，均会导致翻译效率大幅度降低导致翻译效率大幅度降低mRNA 与核糖体的结合程度一般来说，mRNA 与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达SD SD 序序列列下下游游的的碱碱基基若若为为AAAAAAAA或或UUUUUUUU，翻翻译译效效率率最最高高；而而CCCCCCCC或或GGGGGGGG的的翻翻译效率则分别是最高值的译效率则分别是最高值的50%50%和和25%25%。紧邻紧邻 AUG AUG 的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。如如：对对于于大大肠肠杆杆菌菌b-b-半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的mRNAmRNA而而言言，在在这这个个位位置置上上最最佳佳的的碱碱基基组组合是合是UAUUAU或或CUUCUU，如果用，如果用UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG取代之，则酶的表达水平低取代之，则酶的表达水平低20 20 倍倍SD 序列与起始密码子之间序列的影响SD 序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达SDSD序序列列与与起起始始密密码码子子 AUGAUG之之间间的的精精确确距距离离保保证证了了mRNAmRNA在在核核糖糖体体上上定定位位后后，翻翻译译起起始始密密码码子子AUGAUG正正好好处处于于核核糖糖体体复复合合物物结构中的结构中的P P位位，这是翻译启动的前提条件。，这是翻译启动的前提条件。在在很很多多情情况况下下，SDSD序序列列位位于于AUGAUG之之前前大大约约7 7个个碱碱基基处处，在在此此间间隔隔中中少少一一个个碱碱基基或或多多一一个个碱碱基基，均均会会导导致致翻翻译译起起始始效效率率不同程度的降低不同程度的降低SD 序列与起始密码子之间距离的影响SD序列与起始密码子 AUG之间的精确距离保证了mRNA在核第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达大肠杆菌中的起始 tRNA 分子可以同时识别 AUG、GUG 和 UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常 GUG 为 AUG 的50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。除此之外，从 AUG 开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与 mRNA 的 5 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰 mRNA 在核糖体上的准确定位。目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与与 启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。起始密码子及其后续若干密码子的影响大肠杆菌中的起始 tRNA 分子可以同时识别 AUG、GUG第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达不不同同的的生生物物，甚甚至至同同种种生生物物不不同同的的蛋蛋白白质质编编码码基基因因，对对简简并并密密码码子子使使用用频频率率并并不不相相同同，具具有有一一定定的的偏偏爱爱性性。因因此此对对外源基因表达而言，需选择宿主细胞偏爱的密码子。外源基因表达而言，需选择宿主细胞偏爱的密码子。1.2.4 密码子不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达质粒的扩增质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是正是细菌生理代谢细菌生理代谢最旺盛的阶段。最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。基因宏观表达水平的下降。1.2.5 质粒拷贝数质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达1.3 几种类型的原核表达载体几种类型的原核表达载体1.3 几种类型的原核表达载体第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达一种典型的大肠杆菌表达载体示意图一种典型的大肠杆菌表达载体示意图第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达TTGACA。TATAAT-3517-10PTAAGGAGG（N）8ATG（91%）GTG（8%）TTG（1%）编码序列序列TAATGATAGTTtetrOriRBS大肠杆菌表达载体的基本成分大肠杆菌表达载体的基本成分核糖体结合位点核糖体结合位点（与翻译有关）（与翻译有关）转录终止子转录终止子TTGACA。TATAAT-3517-10PTAAG第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达表达载体类型非融合型表达载体：非融合型表达载体：-所表达的蛋白是天然完整蛋白（所表达的蛋白是天然完整蛋白（具具有非常接近于真核细胞体内蛋白质的有非常接近于真核细胞体内蛋白质的结构结构，因此表达产物，因此表达产物的生物学的生物学功能功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。但也也就更接近于生物体内天然蛋白质。但也易易被细菌蛋白酶破坏被细菌蛋白酶破坏）融合型表达载体：融合型表达载体：-所表达的蛋白是所表达的蛋白是融合蛋白（融合蛋白（稳定性稳定性大大增加，不易被细菌蛋白酶降解；也易于分离纯化大大增加，不易被细菌蛋白酶降解；也易于分离纯化）分泌型表达载体：分泌型表达载体：-产物可跨膜分泌至胞周间隙产物可跨膜分泌至胞周间隙 表达载体类型非融合型表达载体：-所表达的蛋白是天然完整蛋第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达1.3.1 非融合型表达载体 为了在原核生物细胞中表达出非融合蛋白，可将为了在原核生物细胞中表达出非融合蛋白，可将带有起始密码带有起始密码ATG的真核基因插入到原核启动子的真核基因插入到原核启动子和和SD序列的下游，组成一个杂合的核糖体结合区，序列的下游，组成一个杂合的核糖体结合区，经转录翻译，得到非融合蛋白。经转录翻译，得到非融合蛋白。*1.3.1 非融合型表达载体 为了在原核生物细胞中表达出非融第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达PSDForeign DNA非融合型表达载体非融合型表达载体非融合基因非融合基因主要元件：强启动子主要元件：强启动子 SD：ATG：第一个密码子：第一个密码子PSDForeign DNA非融合型表达载体非融合基因主要元第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达非融合型表达载体pKK223-3 Brosius等在哈佛大学的等在哈佛大学的Gilbert实验室组建的实验室组建的 在大肠杆菌细胞中，它能极有效地高水平表达外源在大肠杆菌细胞中，它能极有效地高水平表达外源基因基因 它具有一个强的它具有一个强的tac(trp-lac)启动子。这个启动子是启动子。这个启动子是由由trp启动子的启动子的35区、区、lacUV5启动子的启动子的10区、操区、操纵基因及纵基因及S-D序列组成序列组成 非融合型表达载体pKK223-3 Brosius等在哈佛大第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达tac启动子之后是一个取自启动子之后是一个取自pUC8的多克隆位点（的多克隆位点（MCSMCS）定位）定位在启动子和在启动子和S-D序列后序列后 在在MCSMCS下游的一段下游的一段DNA序列中，序列中，还包含一个很强的核糖体还包含一个很强的核糖体RNA的的转录终止子，目的是为了稳定载转录终止子，目的是为了稳定载体系统体系统载体的其余部分由载体的其余部分由pBR322组组成。成。tac启动子之后是一个取自pUC8的多克隆位点（MCS）定位第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达1.3.2 融合型表达载体将外源基因与载体自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并将外源基因与载体自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作作为一个开放型阅读框为一个开放型阅读框进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为白质称为融合蛋白。融合蛋白。表达融合型蛋白应非常注意其阅读框架表达融合型蛋白应非常注意其阅读框架，其阅读框应与融合，其阅读框应与融合的的DNA片段的阅读框一致，翻译时才不至于产生移码突变。片段的阅读框一致，翻译时才不至于产生移码突变。在这种结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于在这种结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋端，异源蛋白位于白位于C端。端。通过在通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合分子中释放并剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合分子中释放并回收异源蛋白回收异源蛋白*1.3.2 融合型表达载体将外源基因与载体自身的蛋白质编码基第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达融合蛋白表达载体的构建最关键的一点：两个蛋白编码序列最关键的一点：两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读应保持一致的翻译阅读框架框架受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，为目的蛋两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，为目的蛋白分离回收创造条件白分离回收创造条件外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺量过于接近，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺融合蛋白表达载体的构建最关键的一点：两个蛋白编码序列应保持一第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达PSDForeign DNA融合型表达载体融合型表达载体融合基因融合基因PSDForeign DNA融合型表达载体融合基因第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达常见的用于构建融合蛋白的受体蛋白谷胱甘肽转移酶（谷胱甘肽转移酶（GST）：维持良好空间构象：维持良好空间构象硫氧化还原蛋白（硫氧化还原蛋白（TrxA）：维持良好空间构象：维持良好空间构象麦芽糖结合蛋白（麦芽糖结合蛋白（MBP）：促进分泌）：促进分泌金黄色葡萄球菌蛋白金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）：免疫亲和层析）：免疫亲和层析外膜蛋白（外膜蛋白（OmpF）：促进分泌）：促进分泌-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZ）：免疫亲和层析）：免疫亲和层析泛素蛋白（泛素蛋白（Ubi）：维持良好空间构象）：维持良好空间构象常见的用于构建融合蛋白的受体蛋白谷胱甘肽转移酶（GST）：第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达融合型蛋白表达载体融合型蛋白表达载体pGEX系统系统由由Pharmacia公司构建（已被公司构建（已被GE公司收购）公司收购）由由3种载体种载体pGEX-lXT，pGEX-2T和和pGEX-3X以及以及一种用于纯化表达蛋白的亲和层析介质一种用于纯化表达蛋白的亲和层析介质Glutathione Sepharose 4B组成。组成。含有启动子含有启动子tac及及lac操纵基因、操纵基因、SD序列、序列、lacI阻遏阻遏蛋白基因等。蛋白基因等。与其他表达载体不同之处在于与其他表达载体不同之处在于S-D序列下游是序列下游是谷胱谷胱甘肽巯基转移酶甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。甘肽巯基转移酶基因相连。融合型蛋白表达载体pGEX系统由Pharmacia公司构建（第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达P Ptactac：适合：适合IPTGIPTG诱导诱导GSTGST融合蛋白融合蛋白方便纯化方便纯化产物切割方便：产物切割方便：pGEX-1pGEX-1 TT凝血酶凝血酶pGEX-2T-pGEX-2T-凝血酶凝血酶pGEX-3T-XpGEX-3T-X因子因子融合型载体融合型载体-pGEX系列系列Ptac：适合IPTG诱导融合型载体-pGEX系列第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达1.3.3 分泌型表达载体分泌型表达载体主要元件：主要元件：启动子和启动子和SD序列序列信信号号肽肽序序列列 ：通通常常位位于于SD序序列列下下游游，编编码码信信号号肽肽，可引导蛋白跨膜可引导蛋白跨膜1.3.3 分泌型表达载体主要元件：第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达分泌型表达蛋白优点：优点：目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高：高重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，：高重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳定性大约是在细胞质中的其稳定性大约是在细胞质中的1100倍倍目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整：目的蛋白末端完整：相当多的真核生物成熟蛋白相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去去*分泌型表达蛋白优点：*第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达缺点：缺点：相对其它生物细胞而言，相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。菌尽管有，但并不普遍。缺点：第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达分泌型表达载体分泌型表达载体pin系统系统以以pBR322为基础构建的为基础构建的它带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即它带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即Ipp(脂脂蛋白基因蛋白基因)启动子启动子 在启动子的下游装有在启动子的下游装有lacUV5的启动子及其操纵基的启动子及其操纵基因因 lac阻遏子的基因阻遏子的基因(1 1ac I)也克隆在这个质粒上也克隆在这个质粒上 分泌型表达载体pin系统以pBR322为基础构建的第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达作为分泌克隆表达作为分泌克隆表达载体中关键的编码载体中关键的编码信号肽的序列，是信号肽的序列，是取自于大肠杆菌中取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因分泌蛋白的基因ompa(外膜蛋白基外膜蛋白基因因)。SS为信号肽序列为信号肽序列作为分泌克隆表达载体中关键的编码信号肽的序列，是取自于大肠杆第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达1.4 1.4 提高基因表达效率的途径提高基因表达效率的途径 1、选择合适载体，提高翻译水平、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子强启动子-提高转录水平提高转录水平核糖体结合位点（核糖体结合位点（ATG-SDATG-SD）避避免免产产物物降降解解 ：分分泌泌/融融合合表表达达（提提高高其其稳稳定定性）性）*1.4 提高基因表达效率的途径 1、选择合适载体，提高翻译水第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达2、选择合适宿主、选择合适宿主 Lac 启动子启动子-LacI菌菌 PL/PR -CI857 溶源菌溶源菌 3、诱导表达、诱导表达（可（可减轻细胞的代谢负荷减轻细胞的代谢负荷）温度诱导温度诱导-PLPR/IPTG的化学诱导的化学诱导-Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解解2、选择合适宿主 第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达2 2 外源基因在真核生物中表达外源基因在真核生物中表达宿主：酵母菌、植物细胞、动物细胞等。宿主：酵母菌、植物细胞、动物细胞等。MCS真核或病毒的启动子真核或病毒的启动子Poly（A）信号）信号终止子终止子外源基因外源基因2 外源基因在真核生物中表达宿主：酵母菌、植物细胞、动物细胞第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达2.1 2.1 外源基因在植物中的表达外源基因在植物中的表达见第八章见第八章2.1 外源基因在植物中的表达见第八章第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达2.22.2外源基因在动物中的表达外源基因在动物中的表达重组的外源基因重组的外源基因动物细胞动物细胞体外培养的动物细胞体外培养的动物细胞卵细胞卵细胞药物、疫苗等药物、疫苗等转基因动物个体转基因动物个体人体细胞人体细胞基因治疗基因治疗转染转染动物遗传性状改良动物遗传性状改良药物筛选评价模型药物筛选评价模型胚胎发育胚胎发育见第九章见第九章2.2外源基因在动物中的表达重组的外源基因动物细胞体外培养的第第7 7章章 克隆基因的原核表达克隆基因的原核表达summaryPTac、PLac、PTrp、PL、PR 、PT7启动子、转录终启动子、转录终止子、止子、SD序列、偏爱密码、融合蛋白、非融合蛋序列、偏爱密码、融合蛋白、非融合蛋白、分泌型蛋白、白、分泌型蛋白、GST、大肠杆菌表达外源基因的优势和劣势？提高基因大肠杆菌表达外源基因的优势和劣势？提高基因表达效率的途径？表达效率的途径？表达形式：融合表达、非融合表达、分泌型表达、表达形式：融合表达、非融合表达、分泌型表达、诱导表达、诱导表达、pET系列表达载体、系列表达载体、pGEX系列表达载系列表达载体体Tac表达体系（表达体系（pGEX）、）、T7表达体系（表达体系（pET）summaryPTac、PLac、PTrp、PL、PR、P