荧光免疫技术课件

荧光免疫技术荧光免疫技术 彭彭 晓晓 东东荧光免疫技术 彭 晓 东1概概 念念荧光免疫技术荧光免疫技术（fluoroimmunoassay）将免疫学反应的特异性与荧光技术将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法。的敏感性结合起来的一种方法。荧光抗体技术荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）以荧光物质标记抗体进行抗原定位的技术以荧光物质标记抗体进行抗原定位的技术。概 念荧光免疫技术（fluoroimmunoassay）2特特 点点 直观直观 定位性定位性 快速、敏感快速、敏感特 点3传统荧光抗体技术的基本原理传统荧光抗体技术的基本原理 光源光源荧光素荧光素-Ab+Ag 荧光素荧光素-Ab-Ag 荧光显微镜观察荧光显微镜观察 传统荧光抗体技术的基本原理 4 荧光的基础知识荧光的基础知识 荧光抗体的制备荧光抗体的制备 免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术 在医学检验中的应用在医学检验中的应用主主 要要 内内 容容 主 要 内 容5荧光的基础知识荧光的基础知识 荧光荧光 某些物质受到一定波长光激发后，在极某些物质受到一定波长光激发后，在极短时间内发射出波长大于激发光波长的光。短时间内发射出波长大于激发光波长的光。荧光产生机制荧光产生机制 吸收并储存能量吸收并储存能量一些化学物质一些化学物质 基态基态 激发态激发态 发光发光 荧光的基础知识 荧光 6发射光谱发射光谱 指固定激发光波长，在不同波长指固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的强度。下所记录到的样品发射荧光的强度。激发光谱激发光谱 指固定检测波长，用不同波长指固定检测波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。的荧光发射强度。发射光谱 7荧光效率荧光效率 发射荧光的光量子数发射荧光的光量子数(荧光强度荧光强度)荧光效率荧光效率=吸收光的光量子数吸收光的光量子数(激发光强度激发光强度)荧光寿命荧光寿命 指荧光物质被一瞬时光脉冲激发指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。度时所用的时间。荧光效率 8荧光的猝灭荧光的猝灭 指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象。光较长时间的照射后会发生减弱的现象。荧光偏振荧光偏振 FH-FL P=FH+FL P=0说明完全不偏振，说明完全不偏振，-1P1为部分偏振为部分偏振 荧光的猝灭9荧光物质荧光物质名名 称称最大吸收最大吸收波长波长(nm)最大发射最大发射波长波长(nm)荧光颜色荧光颜色应应 用用异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素(FITC)490495520530亮黄绿色亮黄绿色 最广泛最广泛四乙基罗丹四乙基罗丹明明(RB200)570595600桔红色桔红色常用于双重标记或常用于双重标记或对比染色对比染色四甲基异硫四甲基异硫氰酸罗丹明氰酸罗丹明(TRITC)550 620橙红色橙红色衬染或单独染色衬染或单独染色,荧光猝灭速度慢荧光猝灭速度慢藻红蛋白藻红蛋白(R-RE)565 578藻红色藻红色与与FITC一起用于一起用于双色免疫荧光染色双色免疫荧光染色,共用共用488nm波长波长荧光物质名 称最大吸收波长(nm)最大发射波长(nm)荧光10其他荧光物质其他荧光物质 镧系螯合物镧系螯合物 如如 Eu3+等等 酶作用后产生荧光的物质酶作用后产生荧光的物质 如如:4甲基伞酮甲基伞酮-D半乳糖苷半乳糖苷 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 4甲基伞酮甲基伞酮其他荧光物质 镧系螯合物 如 Eu3+等11荧光免疫分析常用的仪器和设备荧光免疫分析常用的仪器和设备 荧光显微镜荧光显微镜 荧光分光光度计荧光分光光度计 流式细胞仪流式细胞仪 荧光免疫分析常用的仪器和设备 荧光显微镜12荧光显微镜荧光显微镜 光光 源源 高压汞灯、氙灯或卤素灯高压汞灯、氙灯或卤素灯 紫外光（紫外光（UV系统，系统，UG）兰紫光（兰紫光（BV系统，系统，BG）透射光透射光 落射光落射光光光 路路激发光类型激发光类型荧光显微镜 光 源 高压汞灯、氙灯或卤素灯光 路激13 滤滤 板板隔热滤板：隔热滤板：能阻断红外线的透过而隔热。能阻断红外线的透过而隔热。激发滤板：激发滤板：提供合适的激发光谱。提供合适的激发光谱。BG只只 允许允许325 500nm波段通过，波段通过，最大透光度在最大透光度在410nm。吸收滤板：吸收滤板：滤除激发光而只允许荧光通过。滤除激发光而只允许荧光通过。透光范围透光范围410650nm，有，有OG (橙黄色橙黄色)和和GG(淡绿黄色淡绿黄色)两种。两种。滤 板14荧光抗体的制备荧光抗体的制备 荧光抗体荧光抗体 荧光素与特异性荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。抗体以化学共价键的方式结合而成。荧光抗体的制备 荧光抗体 荧光15荧光抗体的制备荧光抗体的制备一、抗体与荧光素的结合一、抗体与荧光素的结合二、标记抗体的纯化二、标记抗体的纯化三、荧光抗体的鉴定三、荧光抗体的鉴定荧光抗体的制备一、抗体与荧光素的结合16一、抗体与荧光素的结合一、抗体与荧光素的结合 对抗体的要求：对抗体的要求：1 用于标记的抗体，是高特异性和高用于标记的抗体，是高特异性和高 亲和力的；亲和力的；2 所用抗血清中不应含有针对标本中所用抗血清中不应含有针对标本中 正常组织的抗体；正常组织的抗体；3 一般需经纯化提取一般需经纯化提取IgG后再作标记。后再作标记。一、抗体与荧光素的结合 对抗体的要求：17作为标记的荧光素应符合以下要求作为标记的荧光素应符合以下要求 1 具有能与蛋白质分子形成共价键的具有能与蛋白质分子形成共价键的 化学基团，与蛋白质结合后不易解化学基团，与蛋白质结合后不易解 离，而未结合的色素及其降解产物离，而未结合的色素及其降解产物 易于清除。易于清除。2 荧光效率高，与蛋白质结合后，仍荧光效率高，与蛋白质结合后，仍 能保持高的荧光效率。能保持高的荧光效率。作为标记的荧光素应符合以下要求 1 具有能与蛋白质分子形成183 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。4 与与蛋蛋白白质质结结合合后后不不影影响响蛋蛋白白质质原原有有的的生生化化与与免免疫疫学学性性质质，与与蛋蛋白白质质的的结结合合物稳定，易于保存。物稳定，易于保存。5 标记方法简单、安全无毒。标记方法简单、安全无毒。3 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。19抗体标记荧光素常用方法抗体标记荧光素常用方法 1.搅拌法搅拌法 待标记蛋白待标记蛋白 缓慢滴加荧光素缓慢滴加荧光素 室温持续搅拌室温持续搅拌46小时小时 离心离心 上清即为标记物上清即为标记物抗体标记荧光素常用方法 1.搅拌法20 该法适用于标记体积较大，蛋白该法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液。含量较高的抗体溶液。优点：优点：标记时间短，荧光素用量少。标记时间短，荧光素用量少。缺缺点点：本本法法的的影影响响因因素素多多，若若操操作作不不当会引起较强的非特异性荧光染色。当会引起较强的非特异性荧光染色。该法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗212.透析法透析法 适用于标记量少，蛋白含量低的抗体溶液适用于标记量少，蛋白含量低的抗体溶液。特点特点:标记较均匀，非特异性染色也较低。标记较均匀，非特异性染色也较低。蛋白质蛋白质荧光素缓冲液荧光素缓冲液荧光素标记蛋白质荧光素标记蛋白质PBS2.透析法 蛋白质荧光素缓冲液荧光素标记蛋白质PBS22影响荧光素与抗体结合的因素影响荧光素与抗体结合的因素 1 PH值：常用值：常用PH7.4 8磷酸缓冲液及磷酸缓冲液及 PH9 9.5碳酸盐缓冲液。碳酸盐缓冲液。2 温温 度：常用度：常用2025，大于，大于25有有 猝灭作用。猝灭作用。3 荧光素与蛋白的浓度比例：荧光素与蛋白的浓度比例：最适为最适为1:1001:150 4 猝灭剂的影响猝灭剂的影响影响荧光素与抗体结合的因素 1 PH值：常用PH7.423二、标记抗体的纯化二、标记抗体的纯化目的目的 去除未结合的游离荧光素去除未结合的游离荧光素去除过度标记的蛋白去除过度标记的蛋白去除非特异反应抗体去除非特异反应抗体二、标记抗体的纯化目的 24 方法方法透析法透析法 将标记物置于透析袋中透析；适将标记物置于透析袋中透析；适用于蛋白含量低的标记物用于蛋白含量低的标记物凝胶过滤法凝胶过滤法 常用常用Sephadex G50凝胶，洗脱第凝胶，洗脱第一峰为结合蛋白峰，第二峰为荧光素峰。一峰为结合蛋白峰，第二峰为荧光素峰。方法25离子交换层析法离子交换层析法 依次洗脱下来的成分是未结合荧依次洗脱下来的成分是未结合荧光素的抗体、荧光标记合适的抗体、光素的抗体、荧光标记合适的抗体、过量结合荧光素的抗体。过量结合荧光素的抗体。肝粉吸收法肝粉吸收法 用于去除交叉反应抗体或非期用于去除交叉反应抗体或非期望抗体等非特异反应抗体。望抗体等非特异反应抗体。离子交换层析法26三、荧光抗体的鉴定三、荧光抗体的鉴定 1.抗体效价抗体效价 抗体效价可用琼脂双扩法进抗体效价可用琼脂双扩法进行滴定，效价大于行滴定，效价大于1:16较为理想。较为理想。三、荧光抗体的鉴定 1.抗体效价272.2.荧光素与蛋白质的结合比率荧光素与蛋白质的结合比率（F/PF/P）将制备的荧光抗体稀释至将制备的荧光抗体稀释至A280 1.0，分别测读，分别测读A280（蛋白质特异性吸收峰蛋白质特异性吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算。计算。2.荧光素与蛋白质的结合比率（F/P）28 F/P值越高，说明抗体分子上结合的值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之越少。一般用于固定标荧光素越多，反之越少。一般用于固定标本的荧光抗体以本的荧光抗体以F/P=1.5为宜，用于活细为宜，用于活细胞染色的以胞染色的以F/P=2.4为宜。为宜。（FITC）F/P=2.87A495 A280-0.35A495（RB200）F/P=A515A280 F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光29免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术 基本原理：基本原理：荧光抗体荧光抗体-抗原（组织或细胞）抗原（组织或细胞）荧光显微镜观察荧光显微镜观察免疫荧光显微技术 基本原理：30一、标本的制作一、标本的制作 常见临床标本：组织、细胞、细菌常见临床标本：组织、细胞、细菌 制作成的标本：切片、涂片、印片制作成的标本：切片、涂片、印片 一、标本的制作 常见临床标本：组织、细胞、细菌31 要求：要求：保持抗原的完整性；保持抗原的完整性；保持抗原的定位性；保持抗原的定位性；标本切片尽量薄，以利于抗原抗体标本切片尽量薄，以利于抗原抗体 充分接触以及镜检；充分接触以及镜检；尽量除去影响抗原抗体反应的物质。尽量除去影响抗原抗体反应的物质。要求：保持抗原的完整性；32标本的固定标本的固定目的目的 （1）防止细胞或切片从玻片上脱落；防止细胞或切片从玻片上脱落；（2）除去组织中妨碍抗原抗体结合除去组织中妨碍抗原抗体结合 的类脂质；的类脂质；（3）易于保存。）易于保存。试剂试剂 95%乙乙醇醇、甲甲醇醇、丙丙酮酮、10%福福尔马林等。尔马林等。标本的固定目的33二、荧光抗体染色二、荧光抗体染色目目的的：使使荧荧光光抗抗体体与与待待观观察察的的抗抗原原结合，达到示踪效果。结合，达到示踪效果。步骤：步骤：于已固定的标本上滴加经适于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体，当稀释的荧光抗体，2537湿盒反湿盒反应应30分钟，用分钟，用PBS洗涤，缓冲甘油洗涤，缓冲甘油封片。封片。二、荧光抗体染色目的：使荧光抗体与待观察的抗原结合，达到示踪34直接法直接法 抗原抗原荧光标记抗体荧光标记抗体直接法 抗原荧光标记抗体35间接法间接法 抗原抗原荧光标记抗体荧光标记抗体特异抗体特异抗体间接法 抗原荧光标记抗体特异抗体36三、荧光显微镜检查三、荧光显微镜检查 选择好光源和滤光片选择好光源和滤光片 FITC可选用激发滤光片BG12与吸收滤光片OG4或GG9。RB200可选用BG12与OG5配合。三、荧光显微镜检查 选择好光源和滤光片37荧光染色法结果判断荧光染色法结果判断阴性阴性可疑可疑弱阳性弱阳性阳性阳性较强阳性较强阳性强阳性强阳性无荧光无荧光 有弱荧光，有弱荧光，但不能辨但不能辨别型别别型别清楚可见清楚可见荧光图形荧光图形较明亮较明亮荧光荧光明亮荧光明亮荧光明亮刺眼明亮刺眼荧光荧光1:100或或1:3201:10001:32001:10000荧光染色法结果判断阴性可疑弱阳性阳性38免疫荧光技术在医学检验中的应用免疫荧光技术在医学检验中的应用细菌鉴定：细菌鉴定：如脑膜炎双球菌、痢疾杆菌、如脑膜炎双球菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌等霍乱弧菌、炭疽杆菌等病毒检测：病毒检测：人乳头状病毒人乳头状病毒寄生虫检测寄生虫检测：疟疾、阿米巴虫疟疾、阿米巴虫细胞（及亚群）鉴定：细胞（及亚群）鉴定：B、T及及NK细胞等细胞等多种自身抗体检测：多种自身抗体检测：如抗核抗体如抗核抗体组织中成分的检测：组织中成分的检测：如如Ig、补体等、补体等免疫荧光技术在医学检验中的应用细菌鉴定：如脑膜炎双球菌、痢疾39谢谢 谢谢！谢 谢！40