蛋白质的分离

课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离主要内容：主要内容：一、基础知识一、基础知识二、实验操作二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂）粗分离：透析除去分子较小的杂质。质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。电泳鉴定。二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理 凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2 2、概念：、概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法有效方法3 3、原理：、原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。1 1 1 1、概念：、概念：、概念：、概念：2 2 2 2、原理：、原理：、原理：、原理：又称分配色谱法，是根据相对分予质量又称分配色谱法，是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。的大小分离蛋白质的有效方法。3 3 3 3、凝胶、凝胶、凝胶、凝胶性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通道；的通道；化学本质：多糖类化合物；化学本质：多糖类化合物；实例：葡聚糖、琼脂糖等。实例：葡聚糖、琼脂糖等。一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理 凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）4 4 4 4、具体过程、具体过程、具体过程、具体过程 当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），移动速度（），而（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（）移动，路程（），移动），移动速度（速度（），相对分子质量不同的蛋白质），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢4 4、具体过程、具体过程一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理分子量分子量大大小小直径大小直径大小大于大于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡在颗粒的外面在颗粒的外面小于小于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部运动方式运动方式垂直向下移动垂直向下移动垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进入无规则扩散进入颗粒内部颗粒内部运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路径运动路径较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从先从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来后从后从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理1 1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外来少在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PHPH发发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2 2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）对溶液）对溶液（）的影响，维持）的影响，维持PHPH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱pHpH值值3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水中）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（就可以制得（）使用的缓冲液。使用的缓冲液。1 12 2使用比例使用比例在不同在不同PHPH范围内范围内思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。NaH2PO4/Na2HPO4 H2CO3/NaHCO3磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察功能，便于观察(红色红色)和科学研究其和科学研究其(活性活性)4、在本课题中使用的缓冲液？、在本课题中使用的缓冲液？（三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这下，这些基团会带上正电或负电。些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。各种分子的分离。3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由单体丙烯酰胺和交联剂由单体丙烯酰胺和交联剂由单体丙烯酰胺和交联剂由单体丙烯酰胺和交联剂由单体丙烯酰胺和交联剂由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-N,N-N,N-N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。应用应用:聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶:蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。电荷的多少以及分子的大小等因素。电荷的多少以及分子的大小等因素。电荷的多少以及分子的大小等因素。电荷的多少以及分子的大小等因素。电荷的多少以及分子的大小等因素。原理原理:4 4 4 4、实例、实例、实例、实例 SDSSDS作用机理作用机理 SDSSDS作用作用为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDSSDSSDSSDSSDSSDS。SDS SDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几由几条肽链组成的条肽链组成的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用的作用下会下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定的结果只，因此测定的结果只是是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白能与各种蛋白质形成质形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDSSDS所带负电所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量原有电荷量。因而掩盖了因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。使电泳迁移率完全取决于分子的大小。蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂）粗分离：透析除去分子较小的杂质。质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。电泳鉴定。二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分其他物质：其他物质：其他物质：其他物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团1.血液有哪些成分？血液有哪些成分？2.2.你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？哪种血液来提取血红蛋白？为什么？二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定知识回顾知识回顾用滤纸过滤，用滤纸过滤，除去脂溶性沉除去脂溶性沉淀层，于分液淀层，于分液漏斗中静置片漏斗中静置片刻后，刻后，分出下分出下层的红色透明层的红色透明液体液体。（一）样品处理（一）样品处理1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：血液柠檬酸钠血液柠檬酸钠低速短时离心低速短时离心吸出上层血浆吸出上层血浆红细胞红细胞5倍体积生倍体积生理盐水理盐水 缓慢搅拌缓慢搅拌10min低速短时离低速短时离心心吸出上清液吸出上清液反复洗涤直至上清反复洗涤直至上清液无黄色液无黄色二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定红细胞的洗涤红细胞的洗涤速度越高和时间越长会使其它血细胞等同沉淀达不到分离的速度越高和时间越长会使其它血细胞等同沉淀达不到分离的效果。效果。1 1、洗涤操作过程中，、洗涤操作过程中，为什么要为什么要低速短时间低速短时间离心？离心？重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。干净。2 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？3 3、用质量分数为、用质量分数为0.90.9的氯化钠溶液洗涤，能否用蒸馏水或浓的氯化钠溶液洗涤，能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？度高的氯化钠溶液？为什么？2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放蒸馏水和甲苯的作用是什么？蒸馏水和甲苯的作用是什么？3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：红细胞破碎混合液红细胞破碎混合液中速长时离心中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂滤纸过滤除去脂质质分液漏斗分离出血红蛋白，分液漏斗分离出血红蛋白，得到红得到红色透明液体。色透明液体。第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固体第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶液层 （）的液体）的液体 第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色透析过程动画演示透析过程动画演示4 4、透析、透析:装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析。）透析。透析过程及透析目的？透析过程及透析目的？(2)(2)凝胶色谱操作凝胶色谱操作凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作打孔打孔打孔打孔-挖穴挖穴挖穴挖穴-安管安管安管安管-覆网覆网覆网覆网-插管插管插管插管凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填选择交联葡聚糖凝胶（选择交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）“G G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围,75,75表示凝胶的得水值，表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水即每克凝胶膨胀时吸水7.57.5克。克。固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡3 3、注意点、注意点1 1、凝胶的选择材料、凝胶的选择材料?G?G代表意义代表意义?2 2、简单步骤、简单步骤?凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；装填凝胶柱时不得装填凝胶柱时不得气泡存在。气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的高的操作压下，用操作压下，用300mL300mL的的20mmol/L20mmol/L的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡）充分洗涤平衡12h12h。4 4、洗涤平衡的溶液是什么？要注意、洗涤平衡的溶液是什么？要注意什么？什么？1 1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果；大分子物质的分离效果；2 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。现象。样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱1)1)调节缓冲液面调节缓冲液面2)2)滴加透析样品滴加透析样品 吸管吸吸管吸1mL1mL样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。加样前，打开色谱柱加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出到与凝胶面平齐，关闭出口。口。3)3)样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。全进入凝胶层后，关闭下端出口。5)5)收集收集 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml5ml一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）。的移动，说明色谱柱制作成功）。正确的加样操作要注意的问题正确的加样操作要注意的问题a a、不要触及破坏凝胶面、不要触及破坏凝胶面b b、贴壁加样、贴壁加样c c、使吸管管口沿管壁环绕移动、使吸管管口沿管壁环绕移动4)4)洗脱洗脱 小心加入物质的量浓度为小心加入物质的量浓度为20 20 mmolmmolL L的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液(pH(pH为为7.0)7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。七、课后思考题七、课后思考题 凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。蛋白质的方法之一。蛋白质的方法之一。蛋白质的方法之一。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。较长，移动速度较慢。较长，移动速度较慢。较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。种现象又叫分子筛现象。种现象又叫分子筛现象。种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。1 1 1 1、凝胶色谱法分离蛋白质的原、凝胶色谱法分离蛋白质的原、凝胶色谱法分离蛋白质的原、凝胶色谱法分离蛋白质的原理是怎样的理是怎样的理是怎样的理是怎样的?让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。3 3 3 3、在血红蛋白的提取和分离过程中不断用磷酸缓、在血红蛋白的提取和分离过程中不断用磷酸缓、在血红蛋白的提取和分离过程中不断用磷酸缓、在血红蛋白的提取和分离过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？冲液处理的目的是什么？冲液处理的目的是什么？冲液处理的目的是什么？在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液引起溶液引起溶液引起溶液pHpH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。的溶液叫做缓冲溶液。的溶液叫做缓冲溶液。的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pHpH范围的缓冲液。范围的缓冲液。范围的缓冲液。范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反应体系的缓冲溶液的作用是维持反应体系的缓冲溶液的作用是维持反应体系的缓冲溶液的作用是维持反应体系的pHpH不变。不变。不变。不变。2 2 2 2、什么是缓冲液？它的作用是什么、什么是缓冲液？它的作用是什么、什么是缓冲液？它的作用是什么、什么是缓冲液？它的作用是什么?4 4 4 4、电泳的作用及其原理是什么？、电泳的作用及其原理是什么？、电泳的作用及其原理是什么？、电泳的作用及其原理是什么？许多重要的生物大分子许多重要的生物大分子许多重要的生物大分子许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基如多肽、核酸等都具有可解离的基如多肽、核酸等都具有可解离的基如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的团，在一定的团，在一定的团，在一定的PHPH下下下下,这些基团会带上正电或负电。在电场的作这些基团会带上正电或负电。在电场的作这些基团会带上正电或负电。在电场的作这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下用下用下用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小子本身的大小子本身的大小子本身的大小,形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度,从从从从而实现样品中各种分子的分离。而实现样品中各种分子的分离。而实现样品中各种分子的分离。而实现样品中各种分子的分离。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。过程非常直观，大大简化了实验操作。过程非常直观，大大简化了实验操作。过程非常直观，大大简化了实验操作。5 5 5 5与其他真核细胞相比，红细胞有什么特电与其他真核细胞相比，红细胞有什么特电与其他真核细胞相比，红细胞有什么特电与其他真核细胞相比，红细胞有什么特电?这这这这特点对你进行蛋白质的分离有什么意义特点对你进行蛋白质的分离有什么意义特点对你进行蛋白质的分离有什么意义特点对你进行蛋白质的分离有什么意义?血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步包血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。6 6 6 6你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作-纯化纯化1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定色谱柱的制作过程：准备材料色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安装色谱柱安装色谱柱2 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填步步骤操作要求操作要求操作要求操作要求色色谱柱垂直固定在支架上柱垂直固定在支架上计算称量凝算称量凝胶胶根据色根据色谱柱体柱体积计算凝胶用量算凝胶用量配制配制悬浮液浮液凝胶凝胶颗粒蒸粒蒸馏水水充分溶充分溶胀凝胶凝胶颗粒洗脱液粒洗脱液沸水浴沸水浴装填装填悬浮液浮液一次性一次性缓慢倒入；慢倒入；轻轻敲打敲打缓冲液洗冲液洗涤平衡平衡立刻用磷酸立刻用磷酸缓冲液洗冲液洗涤平衡平衡12h12h装配好的凝胶柱3 3、样品加入与洗脱、样品加入与洗脱-调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面加入蛋白质样加入蛋白质样加入蛋白质样加入蛋白质样品品品品调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面洗脱洗脱洗脱洗脱收集分装蛋白质收集分装蛋白质收集分装蛋白质收集分装蛋白质（1 1）调节缓冲液面：）调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。（2 2）滴加透析样品：）滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝破坏凝胶面。胶面。（3 3）样品渗入凝胶床：）样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。（4 4）洗脱：）洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。（5 5）收集：）收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收集流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）（6 6）注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白三、三、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。目的：目的：目的：目的：血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定 观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-5-1818），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。四、实验结果分析与评价四、实验结果分析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3 3 3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？效果？效果？效果？四、实验结果分析与评价四、实验结果分析与评价本课题作业本课题作业本课题作业本课题作业;1.1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?2.2.什么是缓冲溶液什么是缓冲溶液?它的作用是什么它的作用是什么?3.3.电泳的作用及其原理是什么电泳的作用及其原理是什么?4.4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?5.5.与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点红细胞有什么特点?这一特点对你进行这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义蛋白质的分离有什么意义?（1）计算：根据色谱柱的内体积计算所需）计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量凝胶量（2）凝胶溶胀：）凝胶溶胀：凝胶浸泡于蒸馏水充分溶凝胶浸泡于蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液胀后，配成凝胶悬浮液（3）固定：固定：将色谱柱装置固定在支架上将色谱柱装置固定在支架上（4）装填：装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。填装均匀。（5）洗涤平衡：）洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml的的20mmol/l的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH为为7.0）充分充分洗涤平衡洗涤平衡12小时小时。装填时装填时注意：注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装、装填凝胶柱时不得有气泡存在：填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果降低分离效果。洗涤平衡时洗涤平衡时洗涤平衡时洗涤平衡时注意：注意：注意：注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象的现象。2 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填4 4、用、用SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定测定蛋白质的分子量时，可选用一组蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子已知分子量的标准蛋白量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的子量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，用，用电泳电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以，可以测定测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。试剂出售。