蛋白质--生物化学资料

第二章第二章 蛋白质化学蛋白质化学1.蛋白质的结构2.蛋白质的性质3.蛋白质的分析分离蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构和功能结构和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生生命活动命活动过程。蛋白质的分类蛋白质的分类l(1)(1)依据蛋白质的外形分类依据蛋白质的外形分类l球状蛋白质：球状蛋白质：外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。l纤维状蛋白质纤维状蛋白质：分子类似纤维或细棒，如肌动蛋白、角蛋白。（2 2）依据蛋白质的组成分类）依据蛋白质的组成分类l按照分子组成，可以分为按照分子组成，可以分为:l简单蛋白简单蛋白(simple protein)(simple protein)：只有肽链只有肽链 l结合蛋白结合蛋白(conjugated protein)(conjugated protein)：肽链肽链+辅基辅基简单蛋白简单蛋白 P18P18l又称为单纯蛋白质；又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由这类蛋白质只含由-氨基酸组成氨基酸组成的肽链，的肽链，不含其它成分。不含其它成分。l1 1，清蛋白和球蛋白：广泛存在于动物组织中。，清蛋白和球蛋白：广泛存在于动物组织中。l2 2，谷蛋白和醇溶谷蛋白：，谷蛋白和醇溶谷蛋白：l3 3，精蛋白和组蛋白：，精蛋白和组蛋白：l4 4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。结合蛋白结合蛋白 P18-19P18-19l由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成:l色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成,如血红如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。l糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成,如细胞膜中如细胞膜中的糖蛋白等。的糖蛋白等。l脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成,如血清如血清-，-脂蛋白等。脂蛋白等。l核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成,如细胞核中如细胞核中的核糖核蛋白等。的核糖核蛋白等。蛋白质的生物学功能l蛋白质功能的多样性蛋白质功能的多样性l催化功能、调节功能、结构功能、运输催化功能、调节功能、结构功能、运输功能、免疫功能、运动功能、贮藏功能、功能、免疫功能、运动功能、贮藏功能、生物膜的功能；生物膜的功能；l蛋白质功能的复杂性蛋白质功能的复杂性l功能的体现受到多种因素的影响、表现功能的体现受到多种因素的影响、表现出竞争性、可调节性等。出竞争性、可调节性等。蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成主要有主要有C、H、O、N和和S。有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量P或金属元素或金属元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋白质还，个别蛋白质还含有含有 I。蛋白质的含氮量平均为蛋白质的含氮量平均为16。l通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式：通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式：蛋白质含量蛋白质含量(g%)=含氮量含氮量(g%)6.25 蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点l某一溶液中蛋白质的百分含量为55%，此溶液的蛋白质氮的百分浓度为_lA.8.8%lB.8.0%lC.8.4%lD.9.2%lE.9.6%蛋白质的组成l大分子物质成分研究方法：l水解。对蛋白质来说有三种水解方法：P20酸解碱解酶解l水解产物是氨基酸。那么，什么是氨基酸？蛋白质完全水解得到各种氨基酸的混合物，蛋白质完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段，最后得到各部分水解通常得到多肽片段，最后得到各种氨基酸的混合物。种氨基酸的混合物。所以，所以，氨基酸氨基酸是蛋白质的是蛋白质的基本结构单元基本结构单元。氨基酸是既有氨基又有羧基的化合物。氨基酸是既有氨基又有羧基的化合物。大多数的蛋白质都是由大多数的蛋白质都是由2020种氨基酸组成。种氨基酸组成。这这2020种氨基酸被称为种氨基酸被称为基本氨基酸基本氨基酸。一、氨基酸一、氨基酸 amino acidamino acid，aaaa 蛋白质的基本组成单位蛋白质的基本组成单位存存在在自自然然界界中中的的氨氨基基酸酸有有300余余种种，但但组组成成人人体体蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸仅仅有有20种种，且且均均属属 L-氨基酸氨基酸（甘氨酸除外，无旋光性）。（甘氨酸除外，无旋光性）。H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-氨基酸的通式氨基酸的通式R各种氨基酸的区别在于侧链各种氨基酸的区别在于侧链R R基的不同。基的不同。l手性炭原子l四面体结构lL-氨基酸：左旋光性注意：旋光性的不确定性！注意：旋光性的不确定性！氨基酸的书写l一般以投影式书写氨基酸。l氨基在左侧的是L型。l氨基酸：氨基位于-碳原子。1.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸3.酸性氨基酸酸性氨基酸4.碱性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸的分类：（一）氨基酸的分类：-R-R基团基团二十种常见蛋白质氨基酸二十种常见蛋白质氨基酸的的分类、结构及三字符号分类、结构及三字符号据营养据营养学分类学分类 必需必需非必需非必需据据R基团化基团化学结构分类学结构分类 脂肪族脂肪族A（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）芳香族芳香族A(Phe、TyrTyr、TrpTrp)杂环杂环(His(His、Pro)Pro)据据R基团基团极性分类极性分类极性极性R基团基团AA非极性非极性R基团基团AA（种）种）不带电荷不带电荷（种）种）带电荷：正电荷带电荷：正电荷（种）负电荷种）负电荷（种）种）据氨基、羧据氨基、羧基数分类基数分类一氨基一羧基一氨基一羧基一氨基二羧基一氨基二羧基(GluGlu、Asp)Asp)二氨基一羧基二氨基一羧基(Lys(Lys、HisHis、ArgArg)人的必需氨基酸人的必需氨基酸LysLysTrpTrpPhePheValValMetMetLeuLeuIleIleThrThrArgArg、HisHis必需与非必需氨基酸l必需必需氨基酸：指人(或其他脊椎动物)自己不能合成，需要从饮食中获得的氨基酸，如赖氨酸、苏氨酸等共8种。l非必需非必需氨基酸：指人(或其他脊椎动物)自己能由简单的前体合成，不需要特定的从饮食中获得的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸等12种。氨基酸的性质氨基酸的性质氨基酸的解离性质氨基酸的解离性质l氨氨基基酸酸在在结结晶晶形形态态或或在在水水溶溶液液中中，并并不不是是以以游游离离的的羧羧基基或或氨氨基基形形式式存存在在，而而是是离离解解成成两两性性离离子子。在在两两性性离离子子中中，氨氨基基是是以以质质子子化化(-NH(-NH3 3+)形形式式存存在在，羧羧基基是是以以离离解状态解状态(-COO(-COO-)存在。存在。l在不同的在不同的pHpH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。条件下，两性离子的状态也随之发生变化。pH1pI10净电荷+0-正离子两性离子负离子氨基酸的氨基酸的等电点等电点（isoelectric point，pI）l 当当溶溶液液浓浓度度为为某某一一pHpH值值时时，氨氨基基酸酸分分子子中中所所含含的的-NH-NH3 3+和和-COO-COO-数数目目正正好好相相等等，净净电电荷荷为为0 0。这这一一pHpH值值即即为为氨氨基基酸酸的的等等电电点点，简简称称p pI I。在在等等电电点点时时，氨氨基基酸酸既既不不向向正正极极也也不不向向负负极极移移动动，即即氨基酸处于两性离子状态。氨基酸处于两性离子状态。l不同氨基酸结构不同，因而等电点不同；l水溶液中氨基和羧基的解离程度不同，氨基酸水溶液不呈中性；l等电点时，氨基酸的偶极离子浓度最大，溶解度最小，可用此性质分离氨基酸。l等电点可以由酸碱滴定测得，也可由解离常数计算而得。l血清白蛋白（pI为4.7）在下列哪种pH值溶液中带正电荷？_lA.pH4.0 lB.pH5.0 lC.pH6.0 lD.pH7.0 lE.pH8.0pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子氨基酸的兼性离子 阳离子阳离子阴离子阴离子氨基酸重要的化学性质氨基酸重要的化学性质 1.1.与茚三酮反应与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定用于氨基酸定量定性测定 2.2.成肽反应成肽反应:氨基酸合成肽的反应基础氨基酸合成肽的反应基础。3.3.与与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)的反应的反应:（sangersanger反应）反应）:用于蛋白质用于蛋白质N-N-端测定。端测定。4.4.与苯异硫氰酯（与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应）的反应:（EdmanEdman反应）：用于蛋白反应）：用于蛋白N-N-端测定。端测定。-氨基和羧基共同参与的反应(1)与茚三酮反应用途用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。常用于氨基酸的定性或定量分析。茚三酮茚三酮水合茚三酮水合茚三酮lSanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。l在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离,不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。（2 2）与与二二硝硝基基氟氟苯苯反反应应lEdmanEdman （苯异硫氰酸酯法）苯异硫氰酸酯法）此法的特点是能够不断重复此法的特点是能够不断重复循环，将肽链循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。蛋端氨基酸残基逐一进行标记和解离。蛋白质测序。白质测序。（3 3）与与异异硫硫氰氰酸酸酯酯反反应应-氨基和羧基共同参与的反应（4 4）成成肽肽反反应应用途用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。肽键肽键l组成肽键的原子处于同一平面。组成肽键的原子处于同一平面。l肽肽键键中中的的C-NC-N键键具具有有部部分分双双键键性性质质，不不能能自自由由旋转。旋转。-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转。肽键平面成为肽链盘曲折叠的基本单位。多肽多肽l一个氨基酸的氨基与一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成键称为肽键，所形成的化合物称为肽。的化合物称为肽。多肽的结构多肽的结构l由由两两个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽肽称称为为二二肽肽，由由多多个个氨氨基基酸酸组组成成的的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。N 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由氨基自由氨基的一端的一端C 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由羧基自由羧基的一端的一端多肽链有两端多肽链有两端*多多肽肽链链(polypeptide chain)是是指指许许多多氨氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。基酸之间以肽键连接而成的一种结构。l在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序；列顺序称为氨基酸顺序；l氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨端氨基酸残基为终点的排列顺序；如上述五肽可表示为：基酸残基为终点的排列顺序；如上述五肽可表示为：l Ser-Val-Ser-Val-Tyr-Asp-GlnTyr-Asp-Gln 天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽l在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。白质的亚单位。l但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为常称为活性肽活性肽。l如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等胱甘肽；蛇毒多肽等。蛋白质的结构蛋白质的结构l 蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式结合蛋白质是由一条或多条多肽链以特殊方式结合而成的生物大分子。而成的生物大分子。l l蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在在60006000以上的多肽称为蛋白质。以上的多肽称为蛋白质。蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）（构象）。在。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。决定。蛋白质有蛋白质有四种四种结构层次：结构层次：一级结构一级结构，二级结构二级结构，三级结构三级结构和和四级结构四级结构。蛋白质的结构蛋白质的结构定义定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。顺序。一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构主要的化学键主要的化学键肽键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。，有些蛋白质还包括二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。功能的基础。目目 录录二、蛋白质的二级结构二、蛋白质的二级结构蛋蛋白白质质分分子子中中某某一一段段肽肽链链的的局局部部空空间间结结构构，即即该该段段肽肽链链主主链链骨骨架架原原子子的的相相对对空空间间位位置置，并并不不涉涉及及氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链的的构构象象。定义定义 主要的化学键主要的化学键：氢键氢键 主要有-螺旋-折叠-转角无规卷曲蛋蛋白白质质的的二二级级结结构构共价键共价键次级键次级键化学键化学键肽键肽键一级结构一级结构氢键氢键二硫键二硫键二、三、四级结构二、三、四级结构疏水键疏水键盐键盐键范德华力范德华力三、四级结构三、四级结构蛋白质分子中的共价键与次级键蛋白质分子中的共价键与次级键二硫键二硫键 （1 1）-螺旋（螺旋（-helix）是在角蛋白中最常见的是在角蛋白中最常见的构象，为右手螺旋。每构象，为右手螺旋。每圈螺旋圈螺旋3.6个氨基酸残个氨基酸残基。侧链基团基。侧链基团R在螺旋在螺旋外侧。主链内部形成外侧。主链内部形成H-键，不涉及侧链键，不涉及侧链R。典型的典型的-螺旋是螺旋是3.613螺螺旋，一周螺旋旋，一周螺旋3.6个氨个氨基酸，跨越基酸，跨越13个原子个原子。（2 2）-折叠折叠l-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象的主链呈锯齿状折叠构象;（2 2）-折叠折叠（3 3）-转角转角l在在-转角部分，由四转角部分，由四个氨基酸残基组成个氨基酸残基组成;l弯曲处的第一个氨基弯曲处的第一个氨基酸残基的酸残基的 -C=O-C=O 和第和第四个残基的四个残基的 N-H N-H 之间形成氢键，形成之间形成氢键，形成一个环状结构。一个环状结构。l这类结构主要存在于这类结构主要存在于球状蛋白分子中。球状蛋白分子中。(4)(4)无规则卷曲无规则卷曲l l无规则卷曲或称卷曲无规则卷曲或称卷曲无规则卷曲或称卷曲无规则卷曲或称卷曲(coil)(coil)(coil)(coil)，泛指那些不能被归入泛指那些不能被归入泛指那些不能被归入泛指那些不能被归入明确的二级结构如折叠片或螺旋的多肽区段；明确的二级结构如折叠片或螺旋的多肽区段；明确的二级结构如折叠片或螺旋的多肽区段；明确的二级结构如折叠片或螺旋的多肽区段；l l是蛋白质中一系列是蛋白质中一系列是蛋白质中一系列是蛋白质中一系列无序构象无序构象无序构象无序构象的总称；的总称；的总称；的总称；l l是体现蛋白质分子结构与功能关系的重要肽段。是体现蛋白质分子结构与功能关系的重要肽段。是体现蛋白质分子结构与功能关系的重要肽段。是体现蛋白质分子结构与功能关系的重要肽段。蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构蚕蚕丝丝的的主主要要成成分分是是丝丝心心蛋蛋白白，而而丝丝心心蛋蛋白白的的主主要要二二级级结结构构是是反反平平行行排排列列的的-折折叠叠。丝丝心心蛋蛋白白的的一一级级结结构构含含有有长长的的重重复复序序列列片片段段，-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-。Gly侧侧链链氢氢位位于于折折叠叠平平面面的的一一侧侧，而而Ala和和Ser的的甲甲基基侧侧链链和和羟羟甲甲基基侧侧链链位位于于折折叠叠平平面面的的另另一一侧侧，堆堆积积的的折折叠叠片片靠靠侧侧链链之之间间的的van der Waals力力结合在一起。结合在一起。超二级结构超二级结构（super secondary structure）：在蛋白质中）：在蛋白质中经常存在由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一经常存在由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一起，形成有规则的二级结构集合体，超二级结构又称起，形成有规则的二级结构集合体，超二级结构又称模体模体（motif）。）。四种类型的超二级结构四种类型的超二级结构细胞色素细胞色素C C的的结构结构 纤溶酶原的纤溶酶原的结构结构结构域 结构域是球状蛋白质的折叠单位折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球形的结构，具有部分生物功能生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上两个以上结构域缔合而成三级结构三级结构。结构域的概念有三种不同而又相互联系的涵义:即独立的结构单位、独立的功能单位和独立的折叠单位。结构域结构域（domain）：在较大的蛋白质分子里，多肽链的空）：在较大的蛋白质分子里，多肽链的空间折叠常常形成两个或多个近似球状的三维实体间折叠常常形成两个或多个近似球状的三维实体,它们之间它们之间由舒展的肽链连接。由舒展的肽链连接。由由-折叠、折叠、-螺旋形成的结构域螺旋形成的结构域 丙酮酸激酶丙酮酸激酶的一个结构的一个结构域域 免疫球蛋白免疫球蛋白的一个结构的一个结构域域 卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域-螺旋螺旋-转角转角-折叠折叠二硫键二硫键结构域结构域1结构域结构域2蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构l蛋白质的三级结构是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链侧链基团相互作用,在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。l如果蛋白质分子仅由一条多肽链组成，三级结构就是它的最高结构层次。蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构特征特征 含多种二级结构单元；有明显的折叠层次；是紧密的球状或椭球状实体；分子表面有一空穴(活性部位)；疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。-折叠折叠-转角转角无规则无规则卷曲卷曲空穴空穴 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)N 端端 C端端蛋蛋白白质质的的三三级级结结构构肌红蛋白是第一个被确定具有三级结构的蛋白质肌红蛋白是第一个被确定具有三级结构的蛋白质肌红蛋白是第一个被确定具有三级结构的蛋白质肌红蛋白是第一个被确定具有三级结构的蛋白质 鲸鱼肌红蛋白是鲸鱼肌红蛋白是由由153个氨基酸残个氨基酸残基组成的，另外基组成的，另外含有一个血红素。含有一个血红素。它的三级结构是它的三级结构是由一簇八个由一簇八个-螺螺旋组成的，螺旋旋组成的，螺旋之间通过一些片之间通过一些片段连接。段连接。不不结合氧时，结合氧时，Fe突出平面突出平面结合氧时，结合氧时，Fe被拉回平面被拉回平面肌红蛋白辅基血红素肌红蛋白辅基血红素 原原卟啉卟啉IX与与Fe的络合物的络合物铁原卟啉称之为血红素。铁原卟啉称之为血红素。血红素中心的血红素中心的Fe应当有应当有6个配位健，其中个配位健，其中4个是与个是与四个吡咯环上的四个吡咯环上的N形成的，形成的，另外两个配位健位于卟啉另外两个配位健位于卟啉环平面上下。环平面上下。Fe可以是可以是Fe2或或Fe3，相应的血红素分别称为亚相应的血红素分别称为亚铁血红素和高铁血红素。铁血红素和高铁血红素。但只有亚铁血红素才能结但只有亚铁血红素才能结合氧。合氧。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构l蛋白质的四级结构是指由多条各自具有一、二、蛋白质的四级结构是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。式及亚基之间的相互作用关系。l这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位，它一般由一条肽链构成，无生理活或亚单位，它一般由一条肽链构成，无生理活性。性。血血红红蛋蛋白白的的四四级级结结构构 在血红蛋白中，其在血红蛋白中，其4 4个亚基与氧分子的亲和性不同。氧分子个亚基与氧分子的亲和性不同。氧分子与血红蛋白的一个亚基结合（比较难）后，引起其构象发与血红蛋白的一个亚基结合（比较难）后，引起其构象发生改变，这种变化在亚基之间传递，从而改变了其他亚基生改变，这种变化在亚基之间传递，从而改变了其他亚基与氧的结合能力，使它们与氧的结合变得容易。与氧的结合能力，使它们与氧的结合变得容易。蛋白质的主要结构层次蛋白质的主要结构层次蛋白质结构层次蛋白质结构层次 蛋白质结构极其复杂，但具有明显的结构层次蛋白质结构极其复杂，但具有明显的结构层次一级结构（多肽链上的氨基酸排列顺序）一级结构（多肽链上的氨基酸排列顺序）二级结构（多肽链主链骨架的局部空间结构）二级结构（多肽链主链骨架的局部空间结构）超二级结构（二级结构单位的集合体）超二级结构（二级结构单位的集合体）结构域（多肽链上可以明显区分的球状区域）结构域（多肽链上可以明显区分的球状区域）三级结构（多肽链上所有原子和基团的空间排布）三级结构（多肽链上所有原子和基团的空间排布）四级结构（由球状亚基或分子缔合而成的集合体）四级结构（由球状亚基或分子缔合而成的集合体）四种结构以及它们之间的关系四种结构以及它们之间的关系四种结构以及它们之间的关系四种结构以及它们之间的关系（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础 蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系l一级结构与功能的关系氨基酸顺序提供重要的化学信息：l1.1.种属差异种属差异l蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近。远近。l2.分子病l基因突变导致蛋白质的一级结构改变，表现出生理功能的异常，使机体出现病态现象。如镰刀状红细胞贫血。分子基础：单个碱基取代分子基础：单个碱基取代-点突变点突变占异常血红蛋白病病因的占异常血红蛋白病病因的90以上。以上。HbE(中国人比较常见中国人比较常见)链链 谷氨酸谷氨酸 26 赖氨酸赖氨酸 GAG AAG异常血红蛋白病异常血红蛋白病-链链N端氨基酸排列顺序端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患患 者）者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-LCompany Logo镰状细胞贫血镰状细胞贫血Company Logo蛋白质空间结构与功能的关系DNA聚合酶活性位点聚合酶活性位点聚聚合合酶酶DNACompany Logo肌红蛋白肌红蛋白（储氧）（储氧）血红蛋白血红蛋白（携氧）（携氧）蛋白质高级结构与功能的关系蛋白质高级结构与功能的关系 Company Logo人类正常血红蛋白的组成和发育演变人类正常血红蛋白的组成和发育演变 血血红红蛋蛋白白是是一一种种复复合合蛋蛋白白，由由四四个个亚亚单位构成四聚体。单位构成四聚体。Company Logo每每个个亚亚单单位位由由一一条条珠珠蛋蛋白白肽肽链链和和一一个个血红素辅基构成。血红素辅基构成。Company LogoO2血血红红素素与与氧氧结结合合后后，铁铁原原子子半半径径变变小小，就就能能进进入入卟卟啉啉环环的的小小孔孔中中，继继而而引引起起肽肽链链位位置置的的变动。变动。Company Logo变构效应变构效应(allosteric effect)蛋蛋白白质质空空间间结结构构的的改改变变伴伴随随其其功功能能的的变变化，称为化，称为变构效应变构效应。Company LogoHb与与Mb一一样样能能可可逆逆地地与与O2结结合合，Hb与与O2结结合合后后称称为为氧氧合合Hb。氧氧合合Hb占占总总Hb的的百百分分数数（称（称百分饱和度百分饱和度）随）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。氧浓度高时：氧浓度高时：氧浓度低时：氧浓度低时：血红蛋白的构象变化与结合氧血红蛋白的构象变化与结合氧 Company Logo（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋蛋白白质质构构象象疾疾病病：若若蛋蛋白白质质的的折折叠叠发发生生错错误误，尽尽管管其其一一级级结结构构不不变变，但但蛋蛋白白质质的的构构象象发发生生改改变变，仍仍可可影影响响其其功功能能，严严重重时时可可导导致疾病发生。致疾病发生。Company Logo蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。Company Logo疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病Company Logo受体蛋白病受体蛋白病 v受体蛋白特异性与某一信号分子结合，通过受体受体蛋白特异性与某一信号分子结合，通过受体蛋白构象变化或化学变化把信号分子带来的信息蛋白构象变化或化学变化把信号分子带来的信息转化为细胞内部的第二信使，引发细胞内反应。转化为细胞内部的第二信使，引发细胞内反应。v如果受体蛋白无法合成或缺陷，则引起细胞内一如果受体蛋白无法合成或缺陷，则引起细胞内一系列的代谢改变，产生受体蛋白病（系列的代谢改变，产生受体蛋白病（receptor receptor protein diseaseprotein disease）。）。Company Logo家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症（familial familial hypercholesterolemiahypercholesterolemia，FHFH）v由于细胞膜上低密由于细胞膜上低密度脂蛋白（度脂蛋白（LDLLDL）受体遗传性缺陷，受体遗传性缺陷，导致血液中胆固醇导致血液中胆固醇含量升高而致病。含量升高而致病。v型突变：是最常型突变：是最常见的突变类型。多见的突变类型。多是是LDLLDL受体基因大受体基因大片段缺失，几乎不片段缺失，几乎不能产生能产生LDLLDL受体。受体。图9-15：LDL受体在细胞内的代谢和5种突变所改变的代谢类型受体在内质网合成后被转运到高尔基复合体，受体以小泡形式被运到细胞表面，陷入有被小窝中，相继形成有被小泡和内体（溶酶体前体）。正常情况下机体可以防止游离胆固醇的累积，因为游离胆固醇增加，（A）LDL受体合成减少，（B）游离胆固醇合成减少，（C）增加胆固醇脂的贮藏。基因突变会使每一步代谢产生改变。Company Logov临床表现为在皮肤等多处有黄瘤形成，胆固醇沉临床表现为在皮肤等多处有黄瘤形成，胆固醇沉积于冠状动脉发生冠心病。通常积于冠状动脉发生冠心病。通常3030岁左右就会出岁左右就会出现上述表现。现上述表现。vLDLLDL受体基因定位于受体基因定位于19P13.119P13.1P13.3P13.3，全长，全长45kb45kb，编码编码839839个氨基酸的受体蛋白。个氨基酸的受体蛋白。家族性高胆固醇血症（家族性高胆固醇血症（familial familial hypercholesterolemiahypercholesterolemia，FHFH）Company Logo蛋白质一级结构（蛋白质一级结构（primary structure），是指氨基酸在的），是指氨基酸在的排列顺序和二硫键的位置。蛋白质的一级结构是最基本的排列顺序和二硫键的位置。蛋白质的一级结构是最基本的结构，其三维结构所需的全部信息都贮存于氨基酸的顺序结构，其三维结构所需的全部信息都贮存于氨基酸的顺序之中。之中。二级结构二级结构（secondary structure）是指多）是指多肽链肽链中彼此靠中彼此靠近的近的氨基酸残基氨基酸残基之间由于之间由于氢键氢键作用而形成的作用而形成的空间结构空间结构。三级结构（三级结构（tertiary structure）是指）是指多肽多肽链在二级结构的链在二级结构的基础上，进一步折叠，基础上，进一步折叠，盘曲盘曲而形成特定的球状而形成特定的球状分子结构分子结构。四级结构四级结构（quaternary structure）是由两条或者两条以）是由两条或者两条以上具有三级结构的上具有三级结构的多肽多肽链聚合而成的具有特定三维结构的链聚合而成的具有特定三维结构的蛋白质构想。蛋白质构想。不同的蛋白质，由于结构不同而具有不同的不同的蛋白质，由于结构不同而具有不同的生物学生物学功能。功能。蛋白质的蛋白质的生物学生物学功能是蛋白质分子的天然功能是蛋白质分子的天然构象构象所具有的性所具有的性质，功能与结构密切相关。质，功能与结构密切相关。1一级结构一级结构与功能的关系与功能的关系 蛋白质的一级结构与蛋白质功能有相适应性和统一性，可从蛋白质的一级结构与蛋白质功能有相适应性和统一性，可从以下几个方面说明：以下几个方面说明：（1）一级结构的变异与）一级结构的变异与分子病分子病 蛋白质中的氨基酸序列与生物功能密切相关，一级结构的变蛋白质中的氨基酸序列与生物功能密切相关，一级结构的变化往往导致蛋白质生物功能的变化。如化往往导致蛋白质生物功能的变化。如镰刀型细胞贫血症镰刀型细胞贫血症，其病因是其病因是血红蛋白血红蛋白基因中的一个基因中的一个核苷酸核苷酸的突变导致该蛋白分的突变导致该蛋白分子中子中-链第链第6位位谷氨酸谷氨酸被被缬氨酸缬氨酸取代。这个一级结构上的细取代。这个一级结构上的细微差别使患者的微差别使患者的血红蛋白分子血红蛋白分子容易发生凝聚，导致容易发生凝聚，导致红细胞红细胞变变成镰刀状，容易破裂引起成镰刀状，容易破裂引起贫血贫血，即，即血红蛋白血红蛋白的功能发生了变的功能发生了变化。化。（2）一级结构与）一级结构与生物进化生物进化（3）蛋白质的）蛋白质的激活作用激活作用 2蛋白质蛋白质空间结构空间结构与功能的关系与功能的关系 蛋白质的空间结构与功能之间有密切相关性，其特定的空间结蛋白质的空间结构与功能之间有密切相关性，其特定的空间结构是行使生物功能的基础。构是行使生物功能的基础。（1）核糖核酸酶核糖核酸酶的变性与复性及其功能的丧失与恢复的变性与复性及其功能的丧失与恢复 核糖核酸酶核糖核酸酶是由是由124个氨基酸组成的一条个氨基酸组成的一条多肽多肽链，含有四对链，含有四对二硫二硫键键，空间，空间构象构象为球状分子。将天然为球状分子。将天然核糖核酸酶核糖核酸酶在经变性处理，在经变性处理，则分子内的四对二硫键断裂，分子变成一条松散的肽链，此时则分子内的四对二硫键断裂，分子变成一条松散的肽链，此时酶活性酶活性完全丧失。但除去变性条件后，此酶经氧化又自发地折完全丧失。但除去变性条件后，此酶经氧化又自发地折叠成原有的天然叠成原有的天然构象构象，同时，同时酶活性酶活性又恢复。又恢复。（2）血红蛋白血红蛋白的的变构现象变构现象 血红蛋白是一个血红蛋白是一个四聚体四聚体蛋白质，具有氧合功能，可在血液中运蛋白质，具有氧合功能，可在血液中运输氧。研究发现，输氧。研究发现，脱氧血红蛋白脱氧血红蛋白与氧的与氧的亲和力亲和力很低，不易与氧很低，不易与氧结合。一旦结合。一旦血红蛋白分子血红蛋白分子中的一个亚基与中的一个亚基与O2结合，就会引起该结合，就会引起该亚基构象发生改变，并引起其它三个亚基的构象相继发生变化，亚基构象发生改变，并引起其它三个亚基的构象相继发生变化，使它们易于和氧结合，说明变化后的构象最适合与氧结合。使它们易于和氧结合，说明变化后的构象最适合与氧结合。总结从以上例子可以看出，只有当蛋白质从以上例子可以看出，只有当蛋白质有正确的一级结构，并且以特定的适有正确的一级结构，并且以特定的适当空间构象存在时才具有生物活性。当空间构象存在时才具有生物活性。蛋白质的功能与其结构有着密不可分蛋白质的功能与其结构有着密不可分的关系。的关系。蛋白质的性质蛋白质的性质l蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在电场中不移动。l在不同的在不同的pHpH环境下，蛋白质的电学性质不同。环境下，蛋白质的电学性质不同。在偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电在偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在偏碱性溶液中，蛋白质粒场中向负极移动；在偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳。称为蛋白质电泳。（1 1 1 1）蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的两两两两性性性性离离离离解解解解和和和和电电电电泳泳泳泳现现现现象象象象电电 泳泳l带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。率即异，在电泳时可以分开。l由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布朗运动等。质，如丁达尔现象、布朗运动等。l由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。（2 2）蛋蛋白白质质的的胶胶体体性性质质l蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。所带的电荷和水化作用有关。l1 1）表面形成水膜（水化层）；）表面形成水膜（水化层）；l2 2）带相同电荷。）带相同电荷。l改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质；改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质；l在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。来。（3 3）蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀作作用用l在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电荷状况，或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。l在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。以这种沉淀又称为非变性沉淀。l可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。（3 3）蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀作作用用可逆沉淀可逆沉淀l在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。l由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。化，所以又称为变性沉淀。l如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。（3 3）蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀作作用用不可逆沉淀不可逆沉淀硫酸铵沉淀（盐析）硫酸铵沉淀（盐析）l原理原理：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质并从溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中（如核酸）将保持在溶液中三氯醋酸（三氯醋酸（TCATCA）沉淀）沉淀l原理原理 在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团露出较多的疏水性基团,使之聚集沉淀使之聚集沉淀丙酮沉淀丙酮沉淀l沉淀机理沉淀机理：降低水的介电常数，导致具有表面水：降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出l优点：优点：分辨能力比盐析法高，分辨能力比盐析法高，沉淀不用脱盐，过滤较为容易沉淀不用脱盐，过滤较为容易l在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性 l蛋白质的性质与它们的结构密切相关。蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性。蛋白质的变性。（4 4）蛋蛋白白质质的的变变性性蛋白质的变性蛋白质的变性l变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。l引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。及强酸和强碱等。蛋白质的变性蛋白质的变性 发生变性的蛋白质发生变性的蛋白质一级结构（构型）和分子量一级结构（构型）和分子量不变不变，高级结构（构象）遭到破坏。，高级结构（构象）遭到破坏。变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。溶溶解度降低解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易易被酶消化被酶消化。蛋白变性可逆变性可逆变性不可逆变性不可逆变性尿素尿素天然核糖核酸酶天然核糖核酸酶硫醇硫醇松散核糖核酸酶松散核糖核酸酶变性核糖核酸酶变性核糖核酸酶天然核糖核酸酶天然核糖核酸酶除去硫醇除去硫醇除去尿素除去尿素除去硫醇除去硫醇除去尿素除去尿素蛋白质的蛋白质的复性复性l 有些蛋白质的变有些蛋白质的变性作用是可逆的，其性作用是可逆的，其变性如不超过一定限变性如不超过一定限度，经适当处理后，度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白可重新变为天然蛋白质质（复性作用）（复性作用）。蛋白质的蛋白质的复性复性大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体 高效表达的目的蛋白高效表达的目的蛋白 在大肠杆菌内形成大在大肠杆菌内形成大 量无活性包含体。量无活性包含体。因无法有效的解决复因无法有效的解决复 性问题，在美国每年性问题，在美国每年 造成的经济损失就达造成的经济损失就达 几十亿美元几十亿美元 包含体电镜图包含体电镜图l大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。氨酸和色氨酸。l这三种氨基酸的在这三种氨基酸的在280nm 280nm 附近有最大吸收。因附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在此，大多数蛋白质在280nm 280nm 附近显示强的吸收。附近显示强的吸收。l利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。（5 5 5 5）蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的紫紫紫紫外外外外吸吸吸吸收收收收反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有有此此反反应应的的蛋蛋白白质质或或氨氨基酸基酸双缩脲反应双缩脲反应NaOH、CuSO2紫紫色色或或粉粉红色红色二个以上肽键二个以上肽键所有蛋白质所有蛋白质米伦反应米伦反应HgNO3 Hg(NO3)2及及HNO3混合物混合物红色红色Tyr黄色反应黄色反应浓浓HNO3及及NH3黄黄色色、橘橘色色Tyr、Phe乙醛酸反应乙醛酸反应(Hopking-Cole反反应应)乙乙醛醛酸酸试试剂剂及及浓浓H2SO4紫色紫色Trp坂口反应坂口反应(Sakaguchi反反 应应)-萘酚、萘酚、NaClO红色红色胍基胍基Arg酚试剂反应酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应反应)碱碱性性CuSO4及及磷磷钨酸钨酸-钼酸钼酸蓝色蓝色酚基、吲哚基酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮反应茚三酮茚三酮蓝色蓝色自由氨基及羧基自由氨基及羧基-氨基酸氨基酸（6 6 6 6）蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应OHN蛋白质的分离和分析技术l根据蛋白质溶解度不同进行分离l根据蛋白质分子大小进行分离l根据蛋白质带电性质进行分离l根据配体特异性进行分离作业l1、名词解释（1）peptide unit；（2）结构域；（3）蛋白质等电点;(4)构象与构型；（5）必须氨基酸与非必须氨基酸；（6）肽键；（7）蛋白质二级结构与三级结构 l2、常用的蛋白质分离纯化方法有哪几种？各自的作用原理是什么？