动物细胞融合ppt课件

19571957年，日本科学家岗田善雄在培养动年，日本科学家岗田善雄在培养动物细胞时加入失去活性的物细胞时加入失去活性的仙台病毒仙台病毒，发，发现了细胞融合、产生具有两个核的细胞。现了细胞融合、产生具有两个核的细胞。后来人们用此方法又成功地诱导了不同后来人们用此方法又成功地诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活，动物细胞融合技术随之诞胞培养成活，动物细胞融合技术随之诞生。现在这项技术已经广泛应用于细胞生。现在这项技术已经广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、病毒学等多种学学、遗传学、免疫学、病毒学等多种学科的研究工作中。科的研究工作中。1957年，日本科学家岗田善雄在培养动物细胞时加入失去活性的1细胞细胞A细胞细胞B杂种细胞杂种细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法仙台病毒仙台病毒疱疹病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒新城鸡瘟病毒 概念：概念：通过诱导两个或多个细胞合并成一个双核或通过诱导两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）。如果）。如果2个不同的细胞进行融合，则称为细胞杂交（个不同的细胞进行融合，则称为细胞杂交（cell hybridization）细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法仙台病毒概念：通2融合细胞的类型：融合细胞的类型：同核体（同核体（homokaryon）：由同一生物：由同一生物个体的细胞（基因型相同）所融合形成个体的细胞（基因型相同）所融合形成的融合细胞。的融合细胞。异核体（异核体（heterokaryon）：）：来自不同基来自不同基因型的细胞所融合形成的杂交细胞。因型的细胞所融合形成的杂交细胞。融合细胞的类型：31.生物方法（病毒）生物方法（病毒）病毒是最早采用的融合剂。某些病毒被膜中有病毒是最早采用的融合剂。某些病毒被膜中有融合蛋白融合蛋白（fusion protein），），可介导病毒同宿主可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合。细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等。用作融合剂的病毒新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等。用作融合剂的病毒必须事先必须事先灭活灭活（紫外线或（紫外线或-丙内酯），使病毒的丙内酯），使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。感染活性丧失而保留病毒的融合活性。第二节第二节 诱导细胞融合的方法诱导细胞融合的方法1.生物方法（病毒）第二节诱导细胞融合的方法4用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图5 仙台病毒是最常用的病毒诱导融合剂。仙台病毒是最常用的病毒诱导融合剂。优点：优点：融合率较高、应用广（对各种动融合率较高、应用广（对各种动物细胞都适宜）、容易培养（可在鸡胚物细胞都适宜）、容易培养（可在鸡胚中大量繁殖）。中大量繁殖）。病毒介导融合的缺点：病毒介导融合的缺点：不稳定，在保存过程中融合活性会降不稳定，在保存过程中融合活性会降低；制备过程比较烦琐。此外，病毒引低；制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。生干扰。仙台病毒是最常用的病毒诱导融合剂。优点：融合率较高、62.2.化学诱导融合化学诱导融合 化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇其中最常用的是聚乙二醇（PEGPEG）。）。PEGPEG可以促使细胞凝结、破坏互相接触处可以促使细胞凝结、破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。形成一个大的双核或多核融合细胞。2.化学诱导融合7影响影响PEGPEG诱导融合效果的因素：诱导融合效果的因素：1.分子量与浓度：分子大、浓度高的分子量与浓度：分子大、浓度高的PEG，有利于融合，但毒性也随之增大。一般用有利于融合，但毒性也随之增大。一般用分子量分子量PEG 1000-4000，40%-60%2.PH:8.0-8.23.诱导时间：长，效率高，但毒性增大、容诱导时间：长，效率高，但毒性增大、容易形成多核细胞易形成多核细胞4.温度：温度：38-40度度影响PEG诱导融合效果的因素：83.3.物理方法物理方法(离心，震动，电融合离心，震动，电融合)最常用的是电融合法最常用的是电融合法 细胞在电场中排列成串、聚集成串珠状，细胞在电场中排列成串、聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，促使细胞在相互接触的然后施加高压电脉冲，促使细胞在相互接触的细胞膜处产生穿孔，导致细胞之间的细胞质连细胞膜处产生穿孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。通，进而发生细胞融合。细胞电融合技术有许多优点，如细胞电融合技术有许多优点，如诱导细胞诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。可重复性好。3.物理方法(离心，震动，电融合)9 两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，如：类型细胞，如：1)1)亲本细胞亲本细胞 2)2)同核体：同源细胞的融合体同核体：同源细胞的融合体 3)3)异核体：非同源的细胞的融合异核体：非同源的细胞的融合体体 4)4)多核体：含有双亲不同比例核多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体物质的融合体 筛选的目的是为了获得优良的杂种筛选的目的是为了获得优良的杂种细胞细胞第三节第三节 杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，如：10融合细胞的筛选方法融合细胞的筛选方法1.1.利用细胞形态、大小、颜色差异筛选利用细胞形态、大小、颜色差异筛选2.2.利用抗药性筛选利用抗药性筛选亲本亲本A A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感素不敏感 亲本亲本B B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长养基上生长 融合细胞的筛选方法1.利用细胞形态、大小、颜色差异筛选113.3.利用营养互补筛选：利用营养互补筛选：细胞在缺乏一种细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本亲本A A：色氨酸缺陷型色氨酸缺陷型 亲本亲本B B：苏氨酸缺陷型苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。亡。3.利用营养互补筛选：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能124.利用基因缺陷互补筛选利用基因缺陷互补筛选 最常用的是在亲本细胞的嘧啶和嘌呤代谢最常用的是在亲本细胞的嘧啶和嘌呤代谢途径中引入途径中引入缺陷突变缺陷突变来筛选杂交细胞，即来筛选杂交细胞，即HAT筛选系统。筛选系统。细胞合成核苷酸有细胞合成核苷酸有2条途径：从头合成途径和条途径：从头合成途径和补救途径。补救途径。阻断从头合成核苷酸阻断从头合成核苷酸途径的物质：途径的物质：次黄嘌呤次黄嘌呤(hypoxantin，H)、氨基蝶呤、氨基蝶呤(aminopterin，A)和胸和胸腺嘧啶脱氧核苷腺嘧啶脱氧核苷(thymidin，T)。HAT培养基：培养基：含有含有H、A、T的培养基的培养基4.利用基因缺陷互补筛选阻断从头合成核苷酸途径的物13 在在HATHAT培养基上，细胞从头合成培养基上，细胞从头合成核苷酸核苷酸途途径被阻断，只能利用补救合成途径。径被阻断，只能利用补救合成途径。在补救途径中，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖在补救途径中，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（转移酶（简称简称HGPRTHGPRT）和胸苷酸激酶）和胸苷酸激酶（TKTK）起起重要作用。重要作用。HGPRTHGPRT-和和TKTK-的细胞不能增殖，的细胞不能增殖，但但HGPRTHGPRT-TKTK+与与HGPRTHGPRT+-TK-TK-融合细胞融合细胞则可以增殖。则可以增殖。在HAT培养基上，细胞从头合成核苷酸途径被阻断，只能利14鼠人XTK-HGPRT+TK+HGPRT-鼠人鼠人鼠 人TK+和HGPRT+HATHATHAT不分裂不分裂分裂HAT筛选示意图鼠人XTK-TK+鼠人鼠人鼠人TK+和HGPRT+HATHA15第四节第四节 融合细胞的克隆化培养融合细胞的克隆化培养 筛选出来的融合细胞仍属于异质性的筛选出来的融合细胞仍属于异质性的细胞群，不完全是纯系，需要进一步纯细胞群，不完全是纯系，需要进一步纯化、获得同质性的细胞群。常用方法是化、获得同质性的细胞群。常用方法是克隆化培养。克隆化培养。克隆化培养：克隆化培养：培养单个杂交细胞、以得培养单个杂交细胞、以得到遗传特征相同而稳定的杂种细胞系。到遗传特征相同而稳定的杂种细胞系。第四节融合细胞的克隆化培养筛选出来的融合细胞仍属于161.1.半固体培养法半固体培养法=平板培养平板培养 2.2.单细胞在软琼脂（或者琼脂糖）培单细胞在软琼脂（或者琼脂糖）培养基上增殖后不能移动，形成集落。待养基上增殖后不能移动，形成集落。待细胞集落长到肉眼可见后，用吸管从琼细胞集落长到肉眼可见后，用吸管从琼脂上挑出来脂上挑出来(一般一般8-108-10天后天后)，再移到液，再移到液体培养基中，进行繁殖。体培养基中，进行繁殖。半固体培养法=平板培养172.2.有限稀释法有限稀释法 将细胞稀释到将细胞稀释到100100个个/ml/ml，理论上每，理论上每0.01ml(100.01ml(10l)含有含有1 1个细胞。取个细胞。取0.01ml0.01ml细胞液在培细胞液在培养板养板(如如9696孔板孔板)的小孔中培养，则可获得单个细胞的小孔中培养，则可获得单个细胞形成的集落。形成的集落。1)1)取取1.0 ml 5101.0 ml 5104 4/ml/ml细胞细胞+4ml+4ml培养基稀释，得培养基稀释，得 1101104 4/ml./ml.2)2)取取0.5ml 1100.5ml 1104 4/ml/ml细胞液细胞液+4.5ml+4.5ml培养基稀释，培养基稀释，得得1101103 3/ml./ml.3)3)取取0.5ml1100.5ml1103 3/ml/ml细胞液细胞液+4.5ml+4.5ml培养基稀释，得培养基稀释，得100 cells/ml.100 cells/ml.4)4)取取0.01ml0.01ml的的 100 cells/ml 100 cells/ml细胞液于培养板小孔，细胞液于培养板小孔，加加0.1 ml0.1 ml培养基，培养后得杂种细胞系。培养基，培养后得杂种细胞系。2.有限稀释法将细胞稀释到100个/ml，理论上183.3.显微镜操作法显微镜操作法 通过显微操作分离杂交单细胞、分别单独培养。通过显微操作分离杂交单细胞、分别单独培养。4.4.盖片分离法盖片分离法1)1)用钉锤于洁净的橡胶上砸干净盖玻片；用钉锤于洁净的橡胶上砸干净盖玻片；2)2)选择碎块、大小形态适用碎片；选择碎块、大小形态适用碎片；3)3)加培养液、进行细胞培养；加培养液、进行细胞培养；4)4)倒置镜下选细胞，挑出单细胞玻片；倒置镜下选细胞，挑出单细胞玻片；5)5)进行单个细胞培养。进行单个细胞培养。3.显微镜操作法通过显微操作分离杂交单细胞、分别单独195.5.荧光激活分离法荧光激活分离法 用一种荧光激活细胞分类器（用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescence Activated Cell Sorter，FACS）分离杂交细胞。）分离杂交细胞。原理：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个原理：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在激发光的激发下，荧光素发射荧细胞的线形液滴，在激发光的激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。不同容器中。5.荧光激活分离法20第五节第五节 细胞融合技术的应用细胞融合技术的应用 动物体受抗原刺激后可产生抗体，抑制抗原的作用；动物体受抗原刺激后可产生抗体，抑制抗原的作用；增加身体的抗体就可以提高机体的抗病能力。增加身体的抗体就可以提高机体的抗病能力。抗体具有特异性，其特异性取决于抗原分子的决定抗体具有特异性，其特异性取决于抗原分子的决定簇。簇。抗原决定簇：抗原决定簇：存在于抗原分子中决定抗原特异性的存在于抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，一般由特殊化学基团，一般由58个氨基酸或单糖或核苷酸个氨基酸或单糖或核苷酸残基组成。残基组成。一、一、B B淋巴细胞杂交瘤生产单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤生产单克隆抗体第五节细胞融合技术的应用动物体受抗原刺激后可产21 各种抗原分子具有很多抗原决定簇，不同抗原的各种抗原分子具有很多抗原决定簇，不同抗原的决定簇数目不同，如白喉类毒素有决定簇数目不同，如白喉类毒素有8 8个，流感病毒有个，流感病毒有4040多个。抗原决定簇大多存在于抗原的表面，但也多个。抗原决定簇大多存在于抗原的表面，但也有隐藏在抗原内部。有隐藏在抗原内部。抗体是由抗体是由B B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。泌的。每一个每一个B B淋巴细胞在成熟的过程中只产生一种淋巴细胞在成熟的过程中只产生一种抗体。动物脾脏有上百万种不同的抗体。动物脾脏有上百万种不同的B B淋巴细胞，因此，淋巴细胞，因此，当机体受抗原刺激时，每种当机体受抗原刺激时，每种B B淋巴细胞产生一种抗体淋巴细胞产生一种抗体（单一抗体），整个动物可以产生众多不同的抗体（单一抗体），整个动物可以产生众多不同的抗体（多克隆抗体）。（多克隆抗体）。用免疫动物生产、制备抗体效率用免疫动物生产、制备抗体效率低，且多克隆抗体应用有很多缺陷，分离这些不同低，且多克隆抗体应用有很多缺陷，分离这些不同的抗体极为困难。的抗体极为困难。各种抗原分子具有很多抗原决定簇，不同抗原的决定簇数目不22 选出一个合成一种专一抗体的细胞进行培养，就可选出一个合成一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经增殖而形成的细胞群，即得到由单细胞经增殖而形成的细胞群，即单克隆细胞单克隆细胞。单克隆细胞合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆细胞合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克单克隆抗体隆抗体。单克隆抗体具有理化性状高度均一、生物活性单克隆抗体具有理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合特异性强、质量可控等优点单一、与抗原结合特异性强、质量可控等优点，用途：，用途：1 1医学诊断试剂医学诊断试剂 广泛应用于酶联免疫、放射免疫分析、免疫组化和流广泛应用于酶联免疫、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。单克隆抗体促进了式细胞仪等技术。单克隆抗体促进了商品化试剂盒商品化试剂盒的发的发展，试剂盒灵敏度高、使用方便、快速，用于展，试剂盒灵敏度高、使用方便、快速，用于病原微生病原微生物抗原、肿瘤抗原、免疫细胞及其亚群的检测，激素、物抗原、肿瘤抗原、免疫细胞及其亚群的检测，激素、细胞因子的测定。细胞因子的测定。选出一个合成一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细232.2.食品安全的检测食品安全的检测 食品中的毒素（如黄曲霉毒素）、有机农药的检测。食品中的毒素（如黄曲霉毒素）、有机农药的检测。方便、灵敏方便、灵敏3蛋白质的提纯蛋白质的提纯单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。2.食品安全的检测3蛋白质的提纯单克隆抗体是亲和层244 4 肿瘤的导向治疗（生物导弹）肿瘤的导向治疗（生物导弹）化疗、放疗：无选择性，副作用大化疗、放疗：无选择性，副作用大 把肿瘤单克隆抗体与抗癌药物结合起来，把肿瘤单克隆抗体与抗癌药物结合起来，就成为就成为“生物导弹生物导弹”。把这种抗体。把这种抗体“导弹导弹”注射到癌症患者的血液中，它就会在患者体注射到癌症患者的血液中，它就会在患者体内追踪并附着于癌细胞上，然后与抗体结合内追踪并附着于癌细胞上，然后与抗体结合的抗癌药物杀伤和破坏癌细胞，而且很少损的抗癌药物杀伤和破坏癌细胞，而且很少损伤正常组织细胞。这种抗体伤正常组织细胞。这种抗体“导弹导弹”具有高具有高度选择性，对癌细胞命中率高、杀伤力强大、度选择性，对癌细胞命中率高、杀伤力强大、副作用小等优点。副作用小等优点。4肿瘤的导向治疗（生物导弹）25 动物细胞融合技术为单克隆抗体的制备提供了个动物细胞融合技术为单克隆抗体的制备提供了个全新、高效的方法。全新、高效的方法。1975年，年，G.Kohler（德国德国）和和C.Milstein（阿根廷、阿根廷、英国双国籍英国双国籍）把产生抗体的淋巴细胞与骨髓瘤细胞把产生抗体的淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成进行融合，形成杂交瘤细胞杂交瘤细胞，证明了这种细胞既有，证明了这种细胞既有骨骨髓瘤细胞无限增殖髓瘤细胞无限增殖的能力，又有的能力，又有淋巴细胞产生抗体淋巴细胞产生抗体的功能。因此，这种杂交瘤细胞就能产生大量单一类的功能。因此，这种杂交瘤细胞就能产生大量单一类型的高纯度抗体，型的高纯度抗体，单克隆抗体单克隆抗体。动物细胞融合技术为单克隆抗体的制备提供了个全26Georges J.F.KhlerCsar MilsteinNiels K.Jerne 1984年，年，G.Kohler、C.Milstein和和Niels K.Jerne获得获得Nobel奖，表彰他们关于免疫控制机制理论的研奖，表彰他们关于免疫控制机制理论的研究以及开发制备单克隆抗体技术。究以及开发制备单克隆抗体技术。GeorgesJ.F.KhlerCsarMilst27 单克隆抗体技术的核心是用单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗原免疫刺激的与经特定抗原免疫刺激的B淋巴淋巴细胞细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合融合得到得到杂交瘤细胞杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology）。）。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma28动物细胞融合技术为生产单克隆抗体过程动物细胞融合技术为生产单克隆抗体过程动物细胞融合技术为生产单克隆抗体过程29（1）免疫小鼠、制备免疫小鼠、制备B淋巴细胞淋巴细胞 取取6-8周龄周龄Balb/C雌鼠，基础免疫雌鼠，基础免疫2周后，再静脉周后，再静脉加强免疫一次，加强免疫一次，3-5天后分离、制备天后分离、制备B淋巴细胞，用淋巴细胞，用无血清培养液洗无血清培养液洗3次次(37)，并计细胞数和测定活，并计细胞数和测定活力细胞。力细胞。（2）制备骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞 收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次次(37)，计，计数活力细胞数活力细胞(不少于不少于90)。（1）免疫小鼠、制备B淋巴细胞取6-8周龄Bal30（3）细胞融合细胞融合(1)按1：5-10混合B淋巴细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤纸吸净多余上清。(2)将1ml 40的PEG液一滴滴加入细胞混合物中，在60秒内加完，同时并不断轻微转动离心管或用手指轻弹离心管；(3)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完；(4)于5分钟内慢慢加入20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，（3）细胞融合(1)按1：5-10混合B淋巴细胞和骨髓瘤31HATHAT选择：选择：淋巴细胞及其融合细胞：淋巴细胞及其融合细胞：不能生长，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；骨髓瘤细胞及其融合细胞：骨髓瘤细胞及其融合细胞：DNADNA从头合成途径被阻断；从头合成途径被阻断；HGPRTHGPRT缺乏，缺乏，DNADNA合成的补救途径受阻，不能生长，合成的补救途径受阻，不能生长，5 57 7天死亡；天死亡；淋巴细胞和骨髓瘤融合细胞：淋巴细胞和骨髓瘤融合细胞：能生长能生长(5)离心(800转/分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；(6)取96孔板，每孔加50l，再加取等体积细胞悬液。(7)在CO2培养箱中37培养；24h后更换成HAT选择性培养液HAT选择：(5)离心(800转/分，8分钟)，去上清，用完32（4）杂交瘤细胞的选择和克隆化培杂交瘤细胞的选择和克隆化培养养第一次抗体筛选：第一次抗体筛选：融合培养融合培养24h24h后更换成后更换成HATHAT选择性培养液，杂交瘤细胞生长增殖、形成选择性培养液，杂交瘤细胞生长增殖、形成细胞群，再利用免疫学方法检测其抗体合成。细胞群，再利用免疫学方法检测其抗体合成。第二次抗体特异性筛选：第二次抗体特异性筛选：从杂交瘤细胞群中从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。异性杂交瘤细胞。（4）杂交瘤细胞的选择和克隆化培养第一次抗体筛选：融合培养33 由于杂交瘤细胞的染色体不稳定，需要进行3-5次克隆化培养，才可得到基因型稳定、特异性抗体合成稳定的杂交瘤细胞。（5）克隆化培养克隆化培养由于杂交瘤细胞的染色体不稳定，需要进行3-5次克隆化34二、二、T T淋巴细胞杂交瘤生产干扰素、细胞因子淋巴细胞杂交瘤生产干扰素、细胞因子 T淋巴细胞在免疫系统中占有极重要的位置，淋巴细胞在免疫系统中占有极重要的位置，在体内能产生多种淋巴因子，如白介素在体内能产生多种淋巴因子，如白介素2、巨噬、巨噬细胞激活因子、细胞激活因子、B细胞生长因子、抗原特异性或细胞生长因子、抗原特异性或非特异性抑制因子等。非特异性抑制因子等。将胸腺瘤细胞与将胸腺瘤细胞与T细胞融合的细胞，称为细胞融合的细胞，称为“T淋巴细胞杂交瘤淋巴细胞杂交瘤”。利用。利用T淋巴细胞杂交瘤可以淋巴细胞杂交瘤可以获得大量这些因子，从而可用于治疗缺乏这些获得大量这些因子，从而可用于治疗缺乏这些淋巴因子的免疫缺陷患者或改善某些超敏反应淋巴因子的免疫缺陷患者或改善某些超敏反应状态。状态。二、T淋巴细胞杂交瘤生产干扰素、细胞因子35三、制作抗肿瘤细胞疫苗三、制作抗肿瘤细胞疫苗 哺乳动物、人的树突状细胞（哺乳动物、人的树突状细胞（dendrite cell,DC）专一向淋巴细胞提供特异性抗原，启动机体专一向淋巴细胞提供特异性抗原，启动机体T细胞免细胞免疫。疫。DC与无致瘤性的肿瘤细胞融合，则与无致瘤性的肿瘤细胞融合，则DC可以提供可以提供几乎全部肿瘤细胞的抗原，启动机体几乎全部肿瘤细胞的抗原，启动机体T细胞对肿瘤细细胞对肿瘤细胞的捕杀，防止癌细胞的扩增。胞的捕杀，防止癌细胞的扩增。三、制作抗肿瘤细胞疫苗哺乳动物、人的树突状细胞（de36