第六章外源基因的表达ppt课件

第六章第六章 外源基因的表达外源基因的表达1MerryChristmas!第六章 外源基因的表达1五、酵母表达系统五、酵母表达系统酵母（酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞行无性繁殖的单细胞真核生物真核生物，是外源基，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。因最理想的真核生物基因表达系统。2五、酵母表达系统酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行v酵母菌的特点：酵母菌的特点：基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于便，并于19961996年完成了对年完成了对酿酒酵母基因组全序列酿酒酵母基因组全序列的的测定；测定；具有原核生物所不具备的具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修蛋白质翻译后加工和修饰系统饰系统；可将外源基因表达产物可将外源基因表达产物分泌分泌到培养基中；到培养基中；对人体和环境对人体和环境安全安全，不含毒素和特异性病毒；，不含毒素和特异性病毒；可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。廉。3酵母菌的特点：基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，1、酵母基因表达载体、酵母基因表达载体酵母克隆和表达载体是由：酵母克隆和表达载体是由：酵母野生型质粒酵母野生型质粒、原核生物质粒载体上的功能基因原核生物质粒载体上的功能基因（如抗性基因、（如抗性基因、复制子等）、复制子等）、宿主染色体宿主染色体DNADNA上自主复制子结构上自主复制子结构（ARSARS）、）、中心粒序列中心粒序列（CENCEN）、）、端粒序列端粒序列（TELTEL）等一起构建而成。）等一起构建而成。酵母基因表达系统的载体一般是一种酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒穿梭质粒，能在能在酵母菌酵母菌和和大肠杆菌大肠杆菌中进行复制。中进行复制。41、酵母基因表达载体酵母克隆和表达载体是由：4 DNA复制起始区复制起始区酵母表达载体包含两类复制起始序列：酵母表达载体包含两类复制起始序列：在在大肠杆菌大肠杆菌中复制的复制起始序列中复制的复制起始序列在在酵母菌酵母菌中引导进行自主复制的序列中引导进行自主复制的序列5 DNA复制起始区酵母表达载体包含两类复制起始序列：在大肠 选择标记选择标记营养缺陷型选择标记：营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。它与宿主的基因型有关。显性选择标记：显性选择标记：可用于各种类型的宿主细胞，可用于各种类型的宿主细胞，并提供直观的选择标记。并提供直观的选择标记。G418：氨基糖苷类抗生素：氨基糖苷类抗生素Cycloheximide：蛋白合成抑制剂：蛋白合成抑制剂6 选择标记营养缺陷型选择标记：它与宿主的基因型有关。显性选有丝分裂稳定区有丝分裂稳定区酵母菌表达载体在细胞内酵母菌表达载体在细胞内拷贝数少拷贝数少，分子质量，分子质量较大，相当于较大，相当于微型染色体微型染色体。表达载体上的表达载体上的有丝分裂稳定区有丝分裂稳定区，决定载体在宿，决定载体在宿主细胞分裂时，能平均分配到子细胞中去，主细胞分裂时，能平均分配到子细胞中去，它来它来源于酵母菌染色体着丝粒片段。源于酵母菌染色体着丝粒片段。7有丝分裂稳定区酵母菌表达载体在细胞内拷贝数少，分子质量较大表达盒表达盒表达盒由表达盒由启动子启动子、分泌信号序列分泌信号序列和和终止子终止子等组等组成，是酵母表达载体的重要元件。成，是酵母表达载体的重要元件。p分泌信号序列分泌信号序列是前体蛋白是前体蛋白N N端一段长为端一段长为17173030个个氨基酸残基的氨基酸残基的分泌信号肽编码区分泌信号肽编码区，主要，主要功能功能是引导是引导分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻译分泌蛋白从细胞内转移到细胞外，并对蛋白质翻译后的加工起重要作用。后的加工起重要作用。8表达盒表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成，是酵母表2 2、酵母基因表达载体的种类、酵母基因表达载体的种类（1 1）自主复制型质粒载体）自主复制型质粒载体（yeast replicating yeast replicating plasmidplasmid，YRPYRP）该载体含有酵母基因组的该载体含有酵母基因组的DNADNA复制起始区、选择复制起始区、选择标记和基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进标记和基因克隆位点等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。行自我复制。u优点：在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞优点：在酵母细胞中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达中的拷贝数可达200200个。个。u缺点：缺点：经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅经过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少速减少。92、酵母基因表达载体的种类（1）自主复制型质粒载体（yeas（2 2）整合型质粒载体）整合型质粒载体（yeast integration yeast integration plasmidplasmid，YIPYIP）整合型质粒载体不含酵母整合型质粒载体不含酵母DNADNA复制起始区，不复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，但含有能在酵母中进行自主复制，但含有整合介导区整合介导区，可通过可通过DNADNA的同源重组将外源基因整合到酵母染色的同源重组将外源基因整合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制体上，并随染色体一起进行复制。质粒与染色体。质粒与染色体DNADNA的同源重组主要有的同源重组主要有单交换单交换（插入）（插入）整合整合和和双交双交换换（或替换）（或替换）整合整合两种方式。两种方式。10（2）整合型质粒载体（yeast integration p（3 3）着丝粒型质粒载体）着丝粒型质粒载体（yeast yeast centromeric plasmidcentromeric plasmid，YCPYCP）该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增该型质粒载体是在自主复制型的基础上，增加了酵母染色体加了酵母染色体有丝分裂稳定序列元件有丝分裂稳定序列元件。在细胞。在细胞分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定分裂时，质粒载体能平均分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只有性较高，但拷贝数很低，通常只有1 12 2个拷贝。个拷贝。11（3）着丝粒型质粒载体（yeast centromeric p该载体在酵母细胞中以该载体在酵母细胞中以线性双链线性双链DNADNA的形式存在，的形式存在，每个细胞内只有每个细胞内只有单拷贝单拷贝。p在细胞分裂和遗传过程中，能将染色体载体均匀在细胞分裂和遗传过程中，能将染色体载体均匀分配到子细胞中，并保持相对独立和稳定。分配到子细胞中，并保持相对独立和稳定。p酵母菌选择标记基因酵母菌选择标记基因赭石突变抑制基因赭石突变抑制基因 SUP4SUP4表表达时菌落呈白色，不表达时呈红色。外源基因的插达时菌落呈白色，不表达时呈红色。外源基因的插入可灭活入可灭活SUP4SUP4基因，获得红色的重组转化子。基因，获得红色的重组转化子。pYACYAC载体可插入载体可插入200200800kb800kb的外源基因片段的外源基因片段，因，因而特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。而特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。（4 4）酵母人工染色体）酵母人工染色体（yeast artificial yeast artificial chromosomechromosome，YACYAC）12该载体在酵母细胞中以线性双链DNA的形式存在，每个细胞内只有3、酵母基因表达系统宿主菌、酵母基因表达系统宿主菌主要包括主要包括酿酒酵母酿酒酵母*巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母乳酸克努维酵母乳酸克努维酵母多型汉森酵母多型汉森酵母133、酵母基因表达系统宿主菌主要包括酿酒酵母*巴斯德毕赤酵母乳4、在酵母中高效表达外源基因的策略在酵母中高效表达外源基因的策略选择合适的受体细胞系统选择合适的受体细胞系统提高表达载体在细胞中的拷贝数提高表达载体在细胞中的拷贝数提高外源基因的转录水平提高外源基因的转录水平144、在酵母中高效表达外源基因的策略选择合适的受体细胞系统1六、哺乳动物细胞基因表达系统六、哺乳动物细胞基因表达系统哺乳动物细胞是最高等的真核生物细胞，其结哺乳动物细胞是最高等的真核生物细胞，其结构、功能和基因表达调控更加复杂。要表达构、功能和基因表达调控更加复杂。要表达具有生具有生物学功能的蛋白质物学功能的蛋白质和和具有特异性催化功能的酶具有特异性催化功能的酶，需，需要在高等真核生物细胞中进行。要在高等真核生物细胞中进行。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的基因的转录转录、mRNA翻译翻译及及翻译后蛋白质加工翻译后蛋白质加工等过程。等过程。15六、哺乳动物细胞基因表达系统哺乳动物细胞是最高等的真核生物细1、哺乳动物基因表达载体的组成特征、哺乳动物基因表达载体的组成特征哺乳动物基因表达载体哺乳动物基因表达载体质粒载体质粒载体病毒载体病毒载体哺乳动物基因表达质粒载体是一类哺乳动物基因表达质粒载体是一类穿梭质粒穿梭质粒，能，能够在够在细菌细菌（大肠杆菌）和（大肠杆菌）和哺乳动物细胞哺乳动物细胞中进行扩增。中进行扩增。161、哺乳动物基因表达载体的组成特征哺乳动物基因表达载体质粒载v哺乳动物基因表达载体组成元件一般包括：哺乳动物基因表达载体组成元件一般包括：基因的基因的转录元件转录元件：即转录的启动子、增强子、：即转录的启动子、增强子、终止子、终止子、poly(A)信号和内含子剪接信号等；信号和内含子剪接信号等；用于筛选转化子的用于筛选转化子的选择标记选择标记；在细菌中进行在细菌中进行复制和筛选复制和筛选的元件；的元件；基因表达的基因表达的调控元件调控元件。17哺乳动物基因表达载体组成元件一般包括：基因的转录元件：即转录（1）复制子）复制子 表达载体的复制子一般采用表达载体的复制子一般采用病毒基因组的复制病毒基因组的复制子子，带有这些复制子的表达载体能以，带有这些复制子的表达载体能以附加体附加体的形式的形式进行复制。进行复制。通常用于构建哺乳动物表达载体的复制子有通常用于构建哺乳动物表达载体的复制子有SV40、多瘤病毒多瘤病毒和和牛乳头瘤病毒牛乳头瘤病毒等的复制子。不同等的复制子。不同表达复制子的效率是不相同的。表达复制子的效率是不相同的。18（1）复制子 表达载体的复制子一般采用病毒基因组的复制子，带（2 2）启动子和增强子）启动子和增强子表达载体的表达载体的启动子启动子长为长为100100200bp200bp，位于转录起，位于转录起始位点上游。目前构建的哺乳动物基因表达载体的始位点上游。目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，启动子，主要来源于病毒主要来源于病毒。病毒载体的病毒载体的增强子增强子位于转录起始位点的上游，它位于转录起始位点的上游，它可大幅度提高启动子的转录水平。多数增强子具有可大幅度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性宿主特异性。19（2）启动子和增强子表达载体的启动子长为100200bp，（3 3）终止信号和加）终止信号和加poly(A)poly(A)信号信号RNARNA聚合酶的转录终止和加聚合酶的转录终止和加poly(A)poly(A)信号依赖于信号依赖于DNADNA模板上两种特异的序列模板上两种特异的序列，一是位于，一是位于poly(A)poly(A)位点位点上游上游11113030个核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序个核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列列AAUAAAAAUAAA，二是，二是poly(A)poly(A)位点位点下游下游的的GUGU丰富区或丰富区或U U丰丰富区。因此，在构建表达载体的时候必须加上这两富区。因此，在构建表达载体的时候必须加上这两种序列。种序列。20（3）终止信号和加poly(A)信号RNA聚合酶的转录终止和 常用的加常用的加poly(A)poly(A)信号来自信号来自SV40SV40，它是一，它是一段段长为长为237bp237bp的的BamHBamH I I-Bcl I-Bcl I限制酶酶切片段限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信号与加号与加poly(A)poly(A)信号。信号。21 常用的加poly(A)信号来自SV40，它是一（4 4）剪接信号）剪接信号外源基因的表达在一级转录物加上外源基因的表达在一级转录物加上poly(A)poly(A)信号信号后，后，内含子内含子被剪除并形成成熟的被剪除并形成成熟的mRNAmRNA。mRNAmRNA剪接所剪接所必需的最短序列位于内含子必需的最短序列位于内含子5 5 和和3 3 边界上。边界上。在构建真核表达载体时都组入一个在构建真核表达载体时都组入一个SV40SV40的内含的内含子子，利用该内含子及其剪接信号构建的载体，表达，利用该内含子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载体要高。外源基因的水平比普通的载体要高。若外源基因为若外源基因为cDNAcDNA，表达载体中不含内含子剪，表达载体中不含内含子剪接信号，也不会影响其表达。接信号，也不会影响其表达。22（4）剪接信号外源基因的表达在一级转录物加上poly(A)信（5 5）选择标记基因）选择标记基因为了快速有效地筛选哺乳动物转化细胞，必须为了快速有效地筛选哺乳动物转化细胞，必须在构建表达载体时组入动物细胞特异性选择标记在构建表达载体时组入动物细胞特异性选择标记基因。目前已发展的哺乳动物细胞基因转化筛选基因。目前已发展的哺乳动物细胞基因转化筛选标记如下表所示：标记如下表所示：23（5）选择标记基因为了快速有效地筛选哺乳动物转化细胞，必须在24242、哺乳动物基因表达载体、哺乳动物基因表达载体不带真核复制起始序列的质粒型载体（整合）不带真核复制起始序列的质粒型载体（整合）带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体带真核病毒调控序列元件的质粒表达载体SV40衍生的表达载体衍生的表达载体牛乳头瘤病毒（牛乳头瘤病毒（BPV）衍生载体）衍生载体人疱疹病毒（人疱疹病毒（EBV）衍生的表达载体）衍生的表达载体人腺病毒（人腺病毒（adenovirus）衍生的表达载体）衍生的表达载体反转录病毒（反转录病毒（retrovirus）衍生的表达载体）衍生的表达载体252、哺乳动物基因表达载体不带真核复制起始序列的质粒型载体（整3、哺乳动物基因表达宿主细胞、哺乳动物基因表达宿主细胞 哺乳动物基因表达宿主细胞选择的哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则基本原则：来源丰富、转化效率高、表达效果好来源丰富、转化效率高、表达效果好。在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特性尽可能接近的特性尽可能接近的肿瘤细胞肿瘤细胞常被选择为基因转移的常被选择为基因转移的受体细胞。受体细胞。目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主要有：要有：CHO-K1细胞、细胞、COS细胞、鼠骨髓瘤细胞细胞、鼠骨髓瘤细胞等。等。263、哺乳动物基因表达宿主细胞 哺乳动物基因表达宿主细胞选择的CHO-K1CHO-K1细胞细胞CHO-K1CHO-K1细胞细胞中国仓鼠卵巢的中国仓鼠卵巢的上皮细胞上皮细胞。目前被用于基因表达的受体细胞是一株目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢缺乏二氢叶酸还原酶（叶酸还原酶（dhfrdhfr）的突变株）的突变株，它可在氨甲蝶呤，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水选择压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达平的表达，表达量可达10g/ml10g/ml以上。以上。二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶可降解可降解氨甲蝶呤氨甲蝶呤氨甲蝶呤氨甲蝶呤可抑制可抑制DNADNA和和RNARNA的合成。的合成。27CHO-K1细胞CHO-K1细胞中国仓鼠卵巢的上皮细胞。外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持；外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持；适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。该细胞株是目前应用该细胞株是目前应用最广泛最广泛的哺乳动物基因表达受体的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、干扰素）、干扰素、干扰素、干扰素、凝血因子、凝血因子等在等在CHO细细胞中得到表达。胞中得到表达。CHO-K1细胞特点细胞特点28外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持；该细胞株是目前应COS细胞细胞它来源于它来源于非洲绿猴肾细胞系（非洲绿猴肾细胞系（CV-1），能组成，能组成性表达性表达SV40的大的大T抗原。抗原。COS细胞的特点细胞的特点：细胞来源丰富；细胞来源丰富；细胞易于培养和转染；细胞易于培养和转染；能使转染到该细胞中的带有能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的转录复制子的转录载体快速扩增；载体快速扩增；能瞬时大量表达外源基因的产物。能瞬时大量表达外源基因的产物。29COS细胞它来源于非洲绿猴肾细胞系（CV-1），能组成性表达由于转染质粒在由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受而死亡。将导致细胞无法忍受而死亡。利用利用COS细胞作为外源基因细胞作为外源基因瞬时表达瞬时表达的受体细的受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功能分析等研究。构与功能分析等研究。30由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞如鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和和J558L等已被用等已被用作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、）、tPA等多种外源基因在鼠骨髓瘤细胞中得等多种外源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。到表达。鼠骨髓瘤细胞的特点：鼠骨髓瘤细胞的特点：细胞易于培养和转染，可在无血清培养基中进细胞易于培养和转染，可在无血清培养基中进行高密度悬浮培养；行高密度悬浮培养；能进行分泌表达，且表达量高；能进行分泌表达，且表达量高；能对蛋白质进行糖基化修饰。能对蛋白质进行糖基化修饰。31鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和J558L等已4、提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略、提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略（1 1）设法提高外源基因的表达水平和产量）设法提高外源基因的表达水平和产量（2 2）改造宿主细胞的特性）改造宿主细胞的特性（3 3）抑制细胞凋亡，延长细胞周期）抑制细胞凋亡，延长细胞周期（4 4）提高表达蛋白糖基化水平）提高表达蛋白糖基化水平324、提高哺乳动物基因表达系统表达效率的策略（1）设法提高外源七、植物细胞基因表达系统（自学）七、植物细胞基因表达系统（自学）33七、植物细胞基因表达系统（自学）33第四节第四节 基因表达产物的检测与分离纯化基因表达产物的检测与分离纯化p389一、基因表达产物的检测一、基因表达产物的检测外源基因表达产物检测的过程就是对外源基因表达产物检测的过程就是对特异性特异性mRNA或或蛋白质蛋白质的检测。的检测。检测特异性检测特异性mRNA的方法的方法Northern杂交法杂交法检测特异性蛋白质的方法检测特异性蛋白质的方法生化反应检测法生化反应检测法免疫学检测法免疫学检测法生物学活性检测法生物学活性检测法34第四节 基因表达产物的检测与分离纯化p389一、基因表达产1、外源基因转录产物的检测、外源基因转录产物的检测Southern杂交杂交可以检测到外源基因是否存在于可以检测到外源基因是否存在于受体细胞中，但不能确定外源基因是否转录受体细胞中，但不能确定外源基因是否转录。而。而利用利用Northern杂交技术杂交技术可以检测外源基因是否转可以检测外源基因是否转录出录出mRNA。检测外源基因转录产物还可采用检测外源基因转录产物还可采用RT-PCR的方法。的方法。351、外源基因转录产物的检测Southern杂交可以检测到外源2、报告基因的酶法检测、报告基因的酶法检测报告基因必须具备报告基因必须具备两大特点两大特点：其表达产物及其功能在未转化的植物细胞中并不其表达产物及其功能在未转化的植物细胞中并不存在；存在；其表达产物便于检测。其表达产物便于检测。362、报告基因的酶法检测报告基因必须具备两大特点：其表达产物及报告基因一般是编码酶的基因报告基因一般是编码酶的基因p哺乳动物细胞基因工程中：哺乳动物细胞基因工程中：氯霉素乙酰转移氯霉素乙酰转移酶基因（酶基因（CATCAT）、）、-葡萄糖苷酸酶基因葡萄糖苷酸酶基因（GUSGUS）、胸苷激酶基因（）、胸苷激酶基因（tktk）、二氢叶酸还原）、二氢叶酸还原酶基因（酶基因（DHFRDHFR）等。）等。p植物基因工程中：植物基因工程中：GUSGUS基因、基因、CATCAT基因、冠瘿基因、冠瘿碱合成酶基因（胭脂碱合成酶基因、章鱼碱合碱合成酶基因（胭脂碱合成酶基因、章鱼碱合成酶基因）、荧光素酶基因和抗卡那霉素基因成酶基因）、荧光素酶基因和抗卡那霉素基因（npt-npt-基因）等。基因）等。37报告基因一般是编码酶的基因哺乳动物细胞基因工程中：氯霉素乙酰cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰CoA转向氯霉素，而乙酰化的氯霉素不再具有氯霉素的活性，失去转向氯霉素，而乙酰化的氯霉素不再具有氯霉素的活性，失去了干扰蛋白质合成的作用。了干扰蛋白质合成的作用。真核细胞不含氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源性活真核细胞不含氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源性活性，性，因而因而cat基因可作为真核细胞转化的标记基因及报告基因。基因可作为真核细胞转化的标记基因及报告基因。cat基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性，并可通过对基因转化的植物细胞能够产生对氯霉素的抗性，并可通过对转化细胞中氯霉素乙酰转移酶活性的检测来了解外源基因的表转化细胞中氯霉素乙酰转移酶活性的检测来了解外源基因的表达。达。cat的活性可以通过反应底物的活性可以通过反应底物乙酰乙酰CoA的减少的减少或反应产物或反应产物乙乙酰化氯霉素及还原型酰化氯霉素及还原型CoASH的生成的生成来测定，目前常用的方法有来测定，目前常用的方法有硅胶硅胶G薄层层析法薄层层析法及及DTNB分光光度法分光光度法。cat（氯霉素乙酰转移酶）基因的检测（氯霉素乙酰转移酶）基因的检测38cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰CoA转向gus（-葡萄糖苷酸酶）基因的检测葡萄糖苷酸酶）基因的检测gus基因存在于某些细菌体内，编码基因存在于某些细菌体内，编码-葡萄糖苷酸酶，该葡萄糖苷酸酶，该酶是一种酶是一种水解酶水解酶，能催化许多，能催化许多-葡萄糖苷酯类物质的水解。绝葡萄糖苷酯类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的大多数的植物细胞内不存在内源的gus活性，许多细菌及真菌活性，许多细菌及真菌也缺乏内源也缺乏内源gus活性，因而活性，因而gus基因被广泛用作转基因植物、细基因被广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其在基因外源基因瞬时表达的转化菌和真菌的报告基因，尤其在基因外源基因瞬时表达的转化实验中，实验中，gus基因应用得最多。基因应用得最多。常用于常用于gus基因检测的底物基因检测的底物对应的检测方法对应的检测方法5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡萄糖苷酸酯（葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）组织化学染色定位法组织化学染色定位法4-甲基伞形酮酰甲基伞形酮酰-D-葡萄糖醛酸苷酯（葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG）荧光测定法荧光测定法对硝基苯对硝基苯-D-葡萄糖醛酸苷（葡萄糖醛酸苷（PNPG）分光光度测定法分光光度测定法39gus（-葡萄糖苷酸酶）基因的检测gus基因存在于某些细荧光素酶基因的检测荧光素酶基因的检测用作报告基因的荧光素酶主要来自用作报告基因的荧光素酶主要来自细菌细菌或或萤火虫萤火虫。萤火虫荧光素酶萤火虫荧光素酶催化的底物是催化的底物是6-羟基喹啉类，在羟基喹啉类，在Mg2+、ATP及及O2作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化荧光作用下，酶使底物氧化脱羧，生成激活态的氧化荧光素，其发射光子后转变成常态的氧化荧光素，反应中化学能转素，其发射光子后转变成常态的氧化荧光素，反应中化学能转变成光能。变成光能。荧光素荧光素ATP+O2 氧化荧光素氧化荧光素CO2+AMP+PPi+光光萤火虫荧光素酶萤火虫荧光素酶细菌荧光素酶细菌荧光素酶以脂肪醛为底物，需要还原型的黄素单核苷以脂肪醛为底物，需要还原型的黄素单核苷酸及氧参与，使脂肪醛氧化为脂肪酸，同时放出光子。酸及氧参与，使脂肪醛氧化为脂肪酸，同时放出光子。RCHO+O2+FMNH2 RCOOH+H2O+FMN+光光细菌荧光素酶细菌荧光素酶检测方法有两种：检测方法有两种：活体内荧光素酶活性检测活体内荧光素酶活性检测体外荧光素酶活性检测体外荧光素酶活性检测40荧光素酶基因的检测用作报告基因的荧光素酶主要来自细菌或萤火虫dhfr（二氢叶酸还原酶）基因的检测（二氢叶酸还原酶）基因的检测dhfrdhfr基因基因又称又称氨甲蝶呤抗性基因氨甲蝶呤抗性基因，编码，编码二氢叶酸二氢叶酸还原酶还原酶。该酶能催化二氢叶酸还原为四氢叶酸该酶能催化二氢叶酸还原为四氢叶酸，而，而四氢叶酸在胸腺嘧啶核苷酸的合成中起重要作用。四氢叶酸在胸腺嘧啶核苷酸的合成中起重要作用。氨甲蝶呤与二氢叶酸结构类似，能竞争性抑制二氢氨甲蝶呤与二氢叶酸结构类似，能竞争性抑制二氢叶酸还原酶的活性。植物细胞的二氢叶酸还原酶对叶酸还原酶的活性。植物细胞的二氢叶酸还原酶对氨甲蝶呤极为敏感，而来自于细菌或小鼠的二氢叶氨甲蝶呤极为敏感，而来自于细菌或小鼠的二氢叶酸还原酶对氨甲蝶呤的敏感性很低。酸还原酶对氨甲蝶呤的敏感性很低。用细菌的二氢用细菌的二氢叶酸还原酶作为报告基因，可使转基因植物细胞在叶酸还原酶作为报告基因，可使转基因植物细胞在一定浓度的氨甲蝶呤培养基中正常生长，而非转化一定浓度的氨甲蝶呤培养基中正常生长，而非转化的植物细胞则不能生长。的植物细胞则不能生长。41dhfr（二氢叶酸还原酶）基因的检测dhfr基因又称氨甲蝶呤3、免疫学检测、免疫学检测免疫学检测免疫学检测免疫沉淀法免疫沉淀法*酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法Western沉淀法沉淀法*固相放射免疫法固相放射免疫法（抗原（抗原-抗体）抗体）423、免疫学检测免疫学检测免疫沉淀法*酶联免疫吸附法Weste免疫沉淀法免疫沉淀法 可应用于表达产物的可应用于表达产物的定性与定量定性与定量分析。分析。优点：优点：选择性好，灵敏度高，可检测出选择性好，灵敏度高，可检测出100pg水平的放射性标记蛋白，并可从蛋白水平的放射性标记蛋白，并可从蛋白质混合物中提纯出抗原抗体复合物。质混合物中提纯出抗原抗体复合物。43免疫沉淀法 可应用于表达产物的定性与定量分析免疫沉淀法的步骤：免疫沉淀法的步骤：对靶细胞进行对靶细胞进行放射性标记放射性标记。细胞裂解。细胞裂解。形成特异性免疫复合物。形成特异性免疫复合物。靶蛋白的免疫沉淀。靶蛋白的免疫沉淀。蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。44免疫沉淀法的步骤：对靶细胞进行放射性标记。44酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）ELISAELISA是一种利用是一种利用免疫学原理免疫学原理检测抗原、抗体检测抗原、抗体的技术。的技术。它与经典的以同位素标记为基础的液液抗原它与经典的以同位素标记为基础的液液抗原抗体反应体系不同之处是建立了抗体反应体系不同之处是建立了固液抗原固液抗原抗体反应体系抗体反应体系，并采用，并采用酶标记酶标记。抗体与抗原的结。抗体与抗原的结合通过酶反应来检测。由于酶反应的放大作用，合通过酶反应来检测。由于酶反应的放大作用，使测定的使测定的灵敏度极高灵敏度极高，可检出，可检出1pg1pg的目的物。同时的目的物。同时酶反应还具有很强的酶反应还具有很强的特异性特异性。因此。因此ELISAELISA是基因表是基因表达研究中不可缺少的方法。除了达研究中不可缺少的方法。除了可溶性抗原可溶性抗原（抗（抗体）之外，体）之外，ELISAELISA还可以检测含还可以检测含表面抗原表面抗原的细胞。的细胞。45酶联免疫吸附法ELISA是一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的ELISA检测外源基因表达蛋白的四个步骤：检测外源基因表达蛋白的四个步骤：抗体制备（普通抗体、酶标记抗体抗体制备（普通抗体、酶标记抗体一抗、二抗一抗、二抗）抗体或抗原的包被抗体或抗原的包被(固定在固相载体上）固定在固相载体上）免疫反应免疫反应特异性表达产物的检测特异性表达产物的检测46ELISA检测外源基因表达蛋白的四个步骤：抗体制备（普通抗47474848示示意意图图ELISA用血清来检测用血清来检测 49示意图ELISA用血清来检测 49Western印迹法印迹法Western杂交是将蛋白质杂交是将蛋白质电泳电泳、印迹印迹和和免疫测定免疫测定融为一体的蛋白质检测方法。它具有很高的灵敏性，融为一体的蛋白质检测方法。它具有很高的灵敏性，可从植物细胞总蛋白中检测出可从植物细胞总蛋白中检测出50ng的特异蛋白质。的特异蛋白质。若是提纯的蛋白质，可检至若是提纯的蛋白质，可检至15ng。50Western印迹法Western杂交是将蛋白质电泳、印迹和原理：原理：转化的外源基因正常表达时，转基因细胞中转化的外源基因正常表达时，转基因细胞中含有一定量的目的蛋白。从细胞中提取总蛋白或含有一定量的目的蛋白。从细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经剂的溶液中，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原原位印迹位印迹到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点。然后加入特异温育，以封闭非特异性位点。然后加入特异抗体抗体（一抗），（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的标记的合后，再加入能与一抗专一结合的标记的二抗二抗，最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。51原理：转化的外源基因正常表达时，转基因细Western印迹法的五个步骤：印迹法的五个步骤：转基因植株蛋白质的提取转基因植株蛋白质的提取SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质蛋白质条带印迹蛋白质条带印迹探针制备探针制备杂交杂交52Western印迹法的五个步骤：转基因植株蛋白质的提取524、表达产物生物学活性检测、表达产物生物学活性检测当外源基因的表达产物是一种当外源基因的表达产物是一种酶蛋白酶蛋白时，可根据时，可根据酶的催化反应来确定外源基因表达与否和表达的程度。酶的催化反应来确定外源基因表达与否和表达的程度。该方法简便且易于操作，在反应体系中加入特定该方法简便且易于操作，在反应体系中加入特定的的底物底物和和基因表达产物的抽提物基因表达产物的抽提物就可根据反应现象进就可根据反应现象进行定性和定量的分析。行定性和定量的分析。534、表达产物生物学活性检测当外源基因的表达产物是一种酶蛋白时二、基因表达产物的分离纯化二、基因表达产物的分离纯化基因表达产物分离纯化的步骤：基因表达产物分离纯化的步骤：细胞破碎细胞破碎离心分离离心分离柱层析柱层析电泳电泳54二、基因表达产物的分离纯化基因表达产物分离纯化的步骤：细胞破1、细胞的破碎、细胞的破碎对于进行分泌型表达的细胞来说，这一步可以省对于进行分泌型表达的细胞来说，这一步可以省略。对于非分泌型表达的细胞可采用不同的细胞破碎略。对于非分泌型表达的细胞可采用不同的细胞破碎方法。方法。常见的细胞破碎方式常见的细胞破碎方式变性剂裂解法（变性剂裂解法（SDS、NP40）超声波破碎法超声波破碎法机械破碎法机械破碎法酶裂解法（降解）酶裂解法（降解）551、细胞的破碎对于进行分泌型表达的细胞来说，这一步可以省略。2、离心离心离心力一般在数万离心力一般在数万g范围以内，主要用来去除范围以内，主要用来去除未破碎的细胞和细胞壁碎片等；未破碎的细胞和细胞壁碎片等；高速离心：高速离心：超速离心：超速离心：离心力一般离心力一般100,000g以上，可用来去除细胞膜以上，可用来去除细胞膜碎片等高分子复合物。碎片等高分子复合物。v附：离心力和转速的换算公式：附：离心力和转速的换算公式：RCF=11.18(N/1000)2rRCF：相对离心力相对离心力，单位为重力加速度，单位为重力加速度gN：转头旋转速度（转速）转头旋转速度（转速），用，用r/min表示表示r：转头半径转头半径，为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距离，单位为，为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距离，单位为厘米（厘米（cm）562、离心离心力一般在数万g范围以内，主要用来去除未破碎的细3、特异性表达蛋白的初步分离、特异性表达蛋白的初步分离沉淀法：沉淀法：超滤浓缩法：超滤浓缩法：根据蛋白质分子大小的不同而进行根据蛋白质分子大小的不同而进行初步分离的一种方法（初步分离的一种方法（滤膜过滤滤膜过滤）。）。简便有效，能处理大量的样品、并简便有效，能处理大量的样品、并除去大量的杂蛋白。常用除去大量的杂蛋白。常用硫酸氨硫酸氨或或有机溶剂有机溶剂对离心后的样品进行分步对离心后的样品进行分步沉淀。该法也常用于沉淀。该法也常用于蛋白质的浓缩蛋白质的浓缩。573、特异性表达蛋白的初步分离沉淀法：超滤浓缩法：根据蛋白质分4、柱层析、柱层析包括包括凝胶柱层析凝胶柱层析、离子交换层析离子交换层析、吸附层析吸附层析、金属螯合层析金属螯合层析、共价层析共价层析、疏水层析、疏水层析、亲和层析亲和层析等。等。584、柱层析包括58层析的基本原理：层析的基本原理：所有的层析系统都是由互不相容的两相组成，一个是所有的层析系统都是由互不相容的两相组成，一个是固定相固定相即层析介质，一个是即层析介质，一个是流动相流动相。利用混合溶液中。利用混合溶液中蛋白质分子的理化特性差异（如吸附力、分子形状大蛋白质分子的理化特性差异（如吸附力、分子形状大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等），使各组小、分子极性、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两相中，并以不同的速度移动，分以不同程度分布在两相中，并以不同的速度移动，最终彼此分开。最终彼此分开。柱层析纯化蛋白质的步骤：柱层析纯化蛋白质的步骤：装柱装柱柱平衡柱平衡上样上样洗脱洗脱分部收集分部收集检测检测59层析的基本原理：柱层析纯化蛋白质的步骤：装柱柱平衡上样洗脱分阳离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷，带负电荷，与阳离子交换与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂 带正电荷，带正电荷，与阴离子交换与阴离子交换离子交换层析是用离子交换层析是用离子交换离子交换剂剂（具有离子交换性能的物（具有离子交换性能的物质）作质）作固定相固定相，利用它与流，利用它与流动相中的离子能进行可逆的动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合交换性质来分离离子型化合物的层析方法。物的层析方法。60阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换离子交换层析是用离子5、聚丙烯酰胺凝胶电泳（、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）适用于分离适用于分离低分子质量蛋白质低分子质量蛋白质、小于、小于1kb DNA片片段及段及DNA序列分析。序列分析。聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺丙烯酰胺（acrylamide）和）和交联剂交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺在有在有引发剂引发剂和和增速剂增速剂的的情况下聚合而成的。通常是丙烯酰胺单体在情况下聚合而成的。通常是丙烯酰胺单体在过硫酸氨过硫酸氨（AP）的引发和的引发和N,N,N,N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺（TEMED）的增速下，产生聚合反应，形成长链。的增速下，产生聚合反应，形成长链。又在又在N,N-甲叉双丙烯酰胺的作用下，聚丙烯酰胺长甲叉双丙烯酰胺的作用下，聚丙烯酰胺长链发生交叉连接而形成凝胶。聚合链的长度和交叉连链发生交叉连接而形成凝胶。聚合链的长度和交叉连接的程度决定了凝胶网孔的大小。接的程度决定了凝胶网孔的大小。615、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）适用于分离低分子质量蛋白质 由于由于空气中的氧空气中的氧能够抑制丙烯酰胺单体能够抑制丙烯酰胺单体的聚合，所以凝胶的制备是向封闭的双玻璃的聚合，所以凝胶的制备是向封闭的双玻璃板夹层中灌胶完成的。聚丙烯酰胺凝胶电泳板夹层中灌胶完成的。聚丙烯酰胺凝胶电泳通常采用通常采用垂直垂直的方式。的方式。62 由于空气中的氧能够抑制丙烯酰胺单体的聚合，缺点：缺点：和琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺凝胶电和琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺凝胶电泳的整个过程显得有些繁琐。泳的整个过程显得有些繁琐。优点：优点：分辨率极高，可分开长度仅相差分辨率极高，可分开长度仅相差0.1的的DNA分子，分子，即即1000bp中相差中相差1bp；其装载量远大于琼脂糖凝胶，多达其装载量远大于琼脂糖凝胶，多达10g的的DNA可可加样于聚丙烯酰胺凝胶中的一个标准加样孔加样于聚丙烯酰胺凝胶中的一个标准加样孔（1cm1cm），而其分辨率不会受到显著影响。），而其分辨率不会受到显著影响。从聚丙烯酰胺凝胶中回收的从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可用纯度很高，可用于要求最高的实验，如鼠胚显微注射。于要求最高的实验，如鼠胚显微注射。63缺点：和琼脂糖凝胶电泳相比，聚丙烯酰胺凝胶电泳的整个过程显得PAGENative-PAGE：主要用于不能变性的表达主要用于不能变性的表达蛋白的分离与纯化。蛋白的分离与纯化。SDS-PAGE：主要用于变性的表达蛋白的主要用于变性的表达蛋白的分离与纯化。分离与纯化。在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳泳动率主要取决于蛋白质分子质量的大小，泳动率主要取决于蛋白质分子质量的大小，而蛋白质分子的荷电状态可以不考虑。而蛋白质分子的荷电状态可以不考虑。64PAGENative-PAGE：主要用于不能变性的表达蛋白的6565