免疫组化幻灯

掌握免疫组化技术的概念、掌握免疫组化技术的概念、原理、优点、原理、优点、ABCABC染色的基本操染色的基本操作，了解免疫组化染色技术的其作，了解免疫组化染色技术的其他几种方法及临床应用他几种方法及临床应用。学习重点学习重点主要讲述的内容主要讲述的内容概述概述l免疫组化的概念和优点免疫组化的概念和优点。l免疫组化染色前的准备。免疫组化染色前的准备。l抗体的标记抗体的标记l如何降低非特异性染色。如何降低非特异性染色。免疫组织化学方法免疫组织化学方法免疫组化结果的判定以及染好切片的关键免疫组化结果的判定以及染好切片的关键免疫组织化学的应用免疫组织化学的应用。免疫酶组织化学染色图片举例免疫酶组织化学染色图片举例。免疫组织化学又称免疫细胞化学，其主要原理是用免疫组织化学又称免疫细胞化学，其主要原理是用免疫组织化学又称免疫细胞化学，其主要原理是用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作抗原、半抗原的光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作抗原、半抗原的光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可应用相应的特异性抗体，将其用免受体及病原体等都可应用相应的特异性抗体，将其用免受体及病原体等都可应用相应的特异性抗体，将其用免疫细胞化学手段检出，并研究。疫细胞化学手段检出，并研究。疫细胞化学手段检出，并研究。概念概念1.1.1.高度的特异性高度的特异性高度的特异性抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。免疫细胞化学的突出优点是：2.2.2.敏感性高敏感性高敏感性高现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。基因水平的检测技术。基因水平的检测技术。3.3.3.方法步骤统一方法步骤统一方法步骤统一若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。4.4.4.形态、机能和代谢密切结合形态、机能和代谢密切结合形态、机能和代谢密切结合是一种集定性、定位和定量密切结合；形态、是一种集定性、定位和定量密切结合；形态、是一种集定性、定位和定量密切结合；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。抗原修复抗原修复 常规石蜡切片的标本一般均采用甲醛固定，甲醛常规石蜡切片的标本一般均采用甲醛固定，甲醛固定的部分组织细胞免疫组化的敏感性明显降低，主固定的部分组织细胞免疫组化的敏感性明显降低，主要原因为甲醛固定过程中形成的要原因为甲醛固定过程中形成的醛键醛键以及甲醛固定导以及甲醛固定导致的致的蛋白与蛋白之间的交联蛋白与蛋白之间的交联，均会封闭部分抗原决定，均会封闭部分抗原决定簇，同时甲醛的这种交联作用会影响细胞膜的簇，同时甲醛的这种交联作用会影响细胞膜的通透性，通透性，使抗体分子难于渗入细胞内，从而影响染色效果。使抗体分子难于渗入细胞内，从而影响染色效果。化学方法化学方法(酶消化方法酶消化方法)胰蛋白酶胰蛋白酶(trypsin)消化方法消化方法 酶浓度一般为酶浓度一般为0.05%0.1%,胃蛋白酶胃蛋白酶(pepsin消化方法消化方法 0.4%胃蛋白酶胃蛋白酶 链霉蛋白酶链霉蛋白酶(poruse)消化方法消化方法 浓度为浓度为0.1%。物理方法物理方法 单纯加热方法单纯加热方法;高压加热方法高压加热方法;微波方法微波方法微波方法微波方法将将切片常规脱腊后水洗，放入盛有枸橼酸缓冲切片常规脱腊后水洗，放入盛有枸橼酸缓冲液的容器中，置微波炉加热沸腾，时间为液的容器中，置微波炉加热沸腾，时间为5min2次。次。加热完毕，将切片缸在室温下放置，使缸内温加热完毕，将切片缸在室温下放置，使缸内温度自然下降至度自然下降至40左右，蒸馏水洗，进入免疫左右，蒸馏水洗，进入免疫组化染色。组化染色。抗体的标记抗体的标记为了使抗原为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记，抗体可见，必须将抗体标记，利用标记物与其他物质的反应将阳性结果利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大，放大，并转换成可见的荧光或呈现出颜色。并转换成可见的荧光或呈现出颜色。免疫组化染色中比较成熟的标记物有：免疫组化染色中比较成熟的标记物有：异硫氰酸荧光素、辣根过氧化物酶、铁异硫氰酸荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白、胶体金、葡萄球菌蛋白、胶体金、葡萄球菌A蛋白、生物素、蛋白、生物素、放射形核素等。放射形核素等。由于标记物和抗体结合，酶促反应的定由于标记物和抗体结合，酶促反应的定位就间接地显示抗原位就间接地显示抗原-抗体反应的定位。抗体反应的定位。免疫组织化学染色中的非特异性着色免疫组织化学染色中的非特异性着色凡不属于特异性抗原抗体反应所呈现的染色。凡不属于特异性抗原抗体反应所呈现的染色。原因：原因：l组织方面：自发荧光、内源性过氧化物酶或组织方面：自发荧光、内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶、内源性生物素等。碱性磷酸酶、内源性生物素等。l试剂方面：抗体不纯、标记酶或荧光不纯或试剂方面：抗体不纯、标记酶或荧光不纯或标记过量等。标记过量等。l在滴加一抗前，采用非免疫动物血清封闭组织在滴加一抗前，采用非免疫动物血清封闭组织中的带电集团，避免与第一抗体的非特异性结中的带电集团，避免与第一抗体的非特异性结合。合。l阻断内源性酶。如阻断内源性酶。如3%3%的的H H2 2O O2 2等。等。l增加第一抗体的稀释度增加第一抗体的稀释度l调整孵育时间及反应温度调整孵育时间及反应温度l避免染色过程中标本干枯等方法。避免染色过程中标本干枯等方法。免疫酶组织化学消除非特异性染色的几种方法免疫酶组织化学消除非特异性染色的几种方法免疫组化染色方法免疫组化染色方法(1)免疫荧光法免疫荧光法(2)免疫酶标法免疫酶标法(3)免疫胶体金法免疫胶体金法免疫荧光法的基本原理免疫荧光法的基本原理将已知的抗体分子标记上荧光素，再与相应的抗原将已知的抗体分子标记上荧光素，再与相应的抗原起反应，形成的抗原抗体复合物因带有荧光素，在起反应，形成的抗原抗体复合物因带有荧光素，在荧光显微镜下可以观察到发出荧光的免疫复合物结荧光显微镜下可以观察到发出荧光的免疫复合物结合部位，从而做出判断。合部位，从而做出判断。作为病理诊断，免疫荧光法具一些不足之处作为病理诊断，免疫荧光法具一些不足之处,如：如：l(1)特异性抗体用量大；特异性抗体用量大；l(2)敏感性及特异性不够理想；敏感性及特异性不够理想；l(3)荧光强度随时间延长而慢慢减弱；荧光强度随时间延长而慢慢减弱；l(4)需要昂贵的特殊显微镜。需要昂贵的特殊显微镜。免疫酶组织化学方法免疫酶组织化学方法6060年代日本学者年代日本学者NakaneNakane等首创建立了酶标记等首创建立了酶标记抗体技术检测组织中的抗原，免疫酶组织化抗体技术检测组织中的抗原，免疫酶组织化学技术的特点：学技术的特点：可用普通显微镜代替荧光显微镜；可用普通显微镜代替荧光显微镜；切片不易褪色，可长期保存；切片不易褪色，可长期保存；阳性细胞定位精确；阳性细胞定位精确；组织结构清晰；组织结构清晰；可作免疫电镜超微结构观察等优点。可作免疫电镜超微结构观察等优点。标记抗体法标记抗体法不标记抗体法不标记抗体法常用的免疫酶组织化学方法常用的免疫酶组织化学方法免疫酶组织化学常用的酶免疫酶组织化学常用的酶理想的标记酶的要求理想的标记酶的要求l酶的活性高且稳定酶的活性高且稳定l终产物稳定，不扩散，有良好的定位终产物稳定，不扩散，有良好的定位l酶和抗体的结合不影响抗原和抗体的结合酶和抗体的结合不影响抗原和抗体的结合l在组织中和体液中不存在内源性的酶及其底在组织中和体液中不存在内源性的酶及其底物物应用最多的标记酶应用最多的标记酶辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）l稳定性好，在稳定性好，在PH3.512范围范围,60加热加热15分钟不分钟不失活失活l穿透性强，溶解度大穿透性强，溶解度大.l底物为底物为H2O2，DAB（3，3-二氨基联苯胺）为供氢二氨基联苯胺）为供氢体体,反应式为：反应式为：lHRP.H2O2+DH2 HRP+D+2H2O碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AP）ABCABC三步法三步法(亲和素亲和素-生物素生物素-过过氧化物酶连结法氧化物酶连结法)ABCABC法是利用亲和素（卵白素）与生法是利用亲和素（卵白素）与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质物素特有的高度亲和力这一生物学性质,先将生物素与辣根过氧化酶（先将生物素与辣根过氧化酶（HRPHRP）结合，结合，形成生物素化形成生物素化HRP(BHRP(B液液)，然后与亲和素，然后与亲和素(A(A液液)按一定的比例混合，形成按一定的比例混合，形成ABCABC复合复合物。用生物素化的二抗与一抗结合，再物。用生物素化的二抗与一抗结合，再与与ABCABC复合物结合，最后用底物显色剂显复合物结合，最后用底物显色剂显色。色。ABC 复合物复合物A液液亲和素液亲和素液B液液与生物素结与生物素结合的过氧化物酶溶液合的过氧化物酶溶液ABC 复合物复合物ABC 法法优点：优点：敏感性高，约为敏感性高，约为PAPPAP法的法的8-408-40倍；倍；特异性强，非特异性背景着色低；特异性强，非特异性背景着色低；方法简便，应用范围广方法简便，应用范围广。步骤：石蜡切片脱蜡至水；石蜡切片脱蜡至水；缓冲液洗；缓冲液洗；3%3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶;缓冲液洗；缓冲液洗；滴加非免疫动物血清滴加非免疫动物血清20min20min步骤步骤步骤步骤 直接直接滴加第一抗体；滴加第一抗体；PBSPBS冲洗；冲洗；滴加生物素化的二抗；滴加生物素化的二抗；PBSPBS冲洗；冲洗；滴加滴加ABCABC复合物；复合物；PBSPBS冲洗；冲洗；DABDAB显色。显色。SPSP法或法或LSABLSAB、SABCSABC法法(链亲和素链亲和素-过氧化物酶连结法过氧化物酶连结法)用链亲和素（用链亲和素（SASA）代替代替ABCABC复合物中的卵白复合物中的卵白素蛋白（亲和素）即形成素蛋白（亲和素）即形成SPSP法。染色原理同法。染色原理同ABCABC法法。LSABLSAB法中由于采用链亲和素，避免了与组法中由于采用链亲和素，避免了与组织中内源性生物素结合的可能，所以背景染织中内源性生物素结合的可能，所以背景染色低、放大效果高。其标记技术比色低、放大效果高。其标记技术比PAPPAP、ABCABC法更为简便、敏感、特异，且价格较低而在法更为简便、敏感、特异，且价格较低而在我国逐渐普及。我国逐渐普及。IGS法法(免疫金法免疫金法)：用金标记代替酶标记。用金标记代替酶标记。IGS的基本原理是先用特异性抗体与的基本原理是先用特异性抗体与抗原反应，随后用金标记的间接抗体或抗原反应，随后用金标记的间接抗体或A蛋白再与特异性抗体结合，再用乳酸蛋白再与特异性抗体结合，再用乳酸银处理，银颗粒沉积在金颗粒上，还原银处理，银颗粒沉积在金颗粒上，还原银显示为黑褐色银显示为黑褐色。免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则 每批染色都要有特异性阳性对照和阴性对照为基础每批染色都要有特异性阳性对照和阴性对照为基础,才能对才能对染色结果做判断。染色结果做判断。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。阴性结果不能视为抗原不表达阴性结果不能视为抗原不表达,即阴性结果无判断意义即阴性结果无判断意义;阳阳性结果有强弱、多少之分性结果有强弱、多少之分,当免疫组化结果与当免疫组化结果与HEHE切片诊断有矛盾时切片诊断有矛盾时,以以HEHE切片诊断为切片诊断为准。准。应用应用“反证法反证法,确保免疫组化在诊断病理中的准确性。确保免疫组化在诊断病理中的准确性。避免假阴性和假阳性的发生。避免假阴性和假阳性的发生。免疫组织化学的应用免疫组织化学的应用(一一)提高病理诊断的准确性提高病理诊断的准确性病病理理诊诊断断当当属属坚坚信信不不疑疑的的，但但在在实实际际工工作作中中要要做做到到100%100%是是不不可可能能的的。采采用用免免疫疫组组化化检检查查后后，部部分分疑疑难难病病例例最最后后获获得得正正确确诊诊断断。应应用用免免疫疫组组化化方方法法，可可以以大大大大提提高高病病理理诊诊断断的的准准确确率率，有有利利于于疾疾病病的的临床诊治。临床诊治。1 1、激激素素受受体体及及生生长长因因子子的的检检测测在在预预后后及及治治疗方面的应用疗方面的应用激激素素受受体体和和各各种种生生长长因因子子对对正正常常组组织织的的功功能能调调节节是是必必不不可可少少的的，同同时时也也可可影影响响着着肿肿瘤瘤的的生生物物学学行行为为。应应用用免免疫疫组组化化方方法法，可可对对肿肿瘤瘤内内各各种种激激素素受受体体与与生生长长因因子子进进行行定定位位、定定量量分分析析，这这已已广广泛泛应应用用于肿瘤临床工作。于肿瘤临床工作。(二二)在肿瘤病理学的研究和诊断中的应用在肿瘤病理学的研究和诊断中的应用如如对对乳乳腺腺癌癌与与激激素素受受体体关关系系的的研研究究已已有有了了较较明明确确的的结结论论，即即雌雌激激素素受受体体阳阳性性的的乳乳腺腺癌癌患患者者预预后后优优于于阴阴性性者者，而而且且阳阳性性者者对对内内分分泌泌治治疗疗反反应应好好、无无瘤瘤生生存存期期延延长长。相相似似的的结结果果也也见见于于子子宫宫内内膜膜癌癌和和卵卵巢癌。巢癌。2 2、癌癌基基因因蛋蛋白白表表达达的的临临床床及及预预后后方方面面的的研研究应用究应用对对癌癌基基因因(oncogenesoncogenes)在在肿肿瘤瘤生生物物学学中中的的价价值值已已有有大大量量的的研研究究，用用免免疫疫组组化化的的方方法法可可对对这这些些癌癌基基因因蛋蛋白白进进行行定定位位和和定定量量的的检检测测，以以探探讨讨其其临临床床意意义义。虽虽然然癌癌基基因因的的种种类类繁繁多多，但但目目前前已已有有肿肿瘤瘤临临床床意意义义的的却却十十分分有有限限，主主要要是是c-c-erbB-2erbB-2、c-c-mycmyc、rasras和和p53p53。在在乳乳腺腺癌癌的的研研究究中中发发现现表表达达cerbB-2cerbB-2的的浸浸润润性性乳乳腺腺癌癌患患者者预预后后差差。恶恶性性度度高高者者阳阳性性率率高高。在在卵卵巢巢癌癌中中阳阳性性率率为为30%30%，而而且且提提示示，阳阳性性表表达达的的卵卵巢巢癌癌者者预预后后要要差。差。c-c-mycmyc是是作作用用于于核核内内DNADNA的的癌癌基基因因，可可剌剌激激DNADNA的的合合成成。c-c-mycmyc的的过过度度表表达达则则促促进进肿肿瘤瘤的的生生长长和和发发展展，因因而而肿肿瘤瘤的的侵侵袭袭性性增增加加。在在对对宫宫颈颈癌癌、小小细细胞胞肺肺癌癌的的研研究究中已证实，中已证实，c-c-mycmyc表达增加者存活期缩短。表达增加者存活期缩短。p21p21是是一一种种rasras癌癌基基因因蛋蛋白白，己己发发现现在在肝肝细细胞胞癌癌、大大肠肠癌癌中中表表达达增增高高，在在卵卵巢巢癌癌亦亦有有过过度度表表达达的的报报道道。对对于于其其预预后后意意义义则则仍仍有有一一些些不不同同的的看看法。法。3 3、对肿瘤细胞增生程度的评价、对肿瘤细胞增生程度的评价肿肿瘤瘤细细胞胞增增生生是是否否活活跃跃直直接接影影响响着着临临床床治治疗疗与与预预后后。判判断断一一个个肿肿瘤瘤是是否否生生长长活活跃跃方方法法较较多多，有有核核仁仁组组成成区区嗜嗜银银蛋蛋白白(AgNORAgNOR)的的染染色色、3 3H-H-胸胸腺腺嘧嘧啶啶摄摄入入放放射射自自显显影影、流流式式细细胞胞术术(FCM)(FCM)等等，但但实实践践证证明明其其中中以以免免疫疫组组化化法法对对瘤瘤细细胞胞增增生生抗抗原原进进行行定定位位定定量量最最为为简简便便、可可靠靠，主主要要是是通通过过Ki-67Ki-67和和PCNA(PCNA(proliferprolifer-ationation cell cell nuclear nuclear antigen)antigen)的的单单克克隆隆抗抗体体来来实实现的。现的。4 4、发现微小转移灶、发现微小转移灶用用常常规规病病理理组组织织学学方方法法要要在在一一个个组组织织中中认认出出单单个个转转移移性性肿肿瘤瘤细细胞胞或或几几个个细细胞胞是是不不可可能能的的，而而采采用用免免疫疫组组化化方方法法则则十十分分有助于微小转移灶的发现。有助于微小转移灶的发现。5 5、在肿瘤分期上的意义、在肿瘤分期上的意义在在判判断断肿肿瘤瘤是是原原位位还还是是有有浸浸润润发发生生以以及及有有无无血血管管、淋淋巴巴管管的的侵侵袭袭是是与与肿肿瘤瘤分分期期密密切切相相关关的的。采采用用免免疫疫组组化化法法检检查查可可获获得得明明确确的的结结果果。如如采采用用层层粘粘连连蛋蛋白白(lamininlaminin）和和型型胶胶原原的的单单克克隆隆抗抗体体可可以以清清楚楚地地显显示示基基底底膜膜的的主主要要成成分分。一一旦旦证证实实上上皮皮性性癌癌突突破破了了基基底底膜膜，就就不不是是原原位位癌癌，而是浸润性癌了，其预后意义是不同的而是浸润性癌了，其预后意义是不同的。6 6、指导肿瘤的治疗、指导肿瘤的治疗应应用用免免疫疫组组化化的的检检查查结结果果发发现现，在在肿肿瘤瘤的的治治疗疗上上也也有有应应用用前前景景。如如许许多多肿肿瘤瘤对对化化疗疗不不敏敏感感，是是由由于于瘤瘤细细胞胞内内多多药药耐耐药药基基因因(multidrugmultidrug resistant resistant gene)gene)编编码码的的酶酶的的活活性性增增加加所所致致。如如二二氢氢叶叶酸酸还还原原酶酶以以及及P-P-糖糖蛋蛋白白增增加加，用用免免疫疫组组化化方方法法可可以以检检查查细细胞胞内内的的这这些些酶酶或或糖糖蛋蛋白白，以了解肿瘤是否有抗药性以了解肿瘤是否有抗药性。7 7、在肿瘤病理学的研究和诊断中的其、在肿瘤病理学的研究和诊断中的其他应用他应用组织起源不明肿瘤的判断。组织起源不明肿瘤的判断。研究病原体与肿瘤的关系研究病原体与肿瘤的关系协助确定肿瘤的良恶性协助确定肿瘤的良恶性分化差的癌和肉瘤的鉴别：分化差的癌和肉瘤的鉴别：CK、Vimentin、LCA、S-100等。等。确定原发病灶确定原发病灶lPSA阳性阳性-前列腺癌转移前列腺癌转移l甲状腺球蛋白阳性甲状腺球蛋白阳性-甲状腺癌转移甲状腺癌转移(四四)病原微生物的检查病原微生物的检查(三三)免疫性疾病的辅助诊断免疫性疾病的辅助诊断步骤：石蜡切片脱蜡至水；石蜡切片脱蜡至水；缓冲液洗；缓冲液洗；3%3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶;蒸馏水洗蒸馏水洗2 2次；次；微波抗原修复；微波抗原修复；缓冲液洗；缓冲液洗；滴加非免疫动物血清滴加非免疫动物血清20min20minVEGFVEGF免疫组化实验操作步骤免疫组化实验操作步骤步骤步骤 直接直接滴加第一抗体；滴加第一抗体；PBSPBS冲洗冲洗3 3次；次；滴加生物素化的二抗；滴加生物素化的二抗；PBSPBS冲洗冲洗3 3次；次；滴加滴加ABCABC复合物；复合物；PBSPBS冲洗冲洗3 3次；次；DABDAB显色。显色。