临床基因诊断进展_陈鸣

临床分子生物学诊断进展临床分子生物学诊断进展陈鸣陈鸣 教授教授 主任医师主任医师第三军医大学第三附属医院检验科第三军医大学第三附属医院检验科023-68757601，OUTLINE测序技术测序技术乙肝病毒耐药突变检测乙肝病毒耐药突变检测预测某些疾病的遗传风险程度预测某些疾病的遗传风险程度肿瘤化疗药物敏感试验肿瘤化疗药物敏感试验生物芯片技术生物芯片技术固相芯片固相芯片液相芯片液相芯片基因组和分子检测：基因组和分子检测：生物芯片技术生物芯片技术DNA芯片 cDNA芯片芯片Oligo芯片芯片 信息生物芯片多肽芯片 生物芯片微流体芯片功能生物芯片芯片实验室 组织芯片蛋白芯片抗体芯片蛋白质芯片SAGE/CAGEepigenetics芯片芯片质粒质粒microarray微株微株array基因组基因组genetics转录组转录组mRNAIntroductionn“Science”:Foder提出基因芯片概念提出基因芯片概念 1991 n第一张基因芯片：美国第一张基因芯片：美国Affymetrix公司公司 1992n第一张以玻璃为载体的基因芯片：第一张以玻璃为载体的基因芯片：Stanford大学大学PBrown实验室，实验室，1995n“Science”:Schena 基因表达谱的研究，基因表达谱的研究，1995 n第一张实用型基因芯片：第一张实用型基因芯片：Affymetrix 1996n中国科学界第一次专项讨论：第中国科学界第一次专项讨论：第80次次“香山科学会议香山科学会议”上，上，1997年年9月月n1998年度自然科学领域十大进展之一年度自然科学领域十大进展之一n美国正式启动基因芯片计划：美国正式启动基因芯片计划：1998n“生物芯片技术生物芯片技术”正式列入国家正式列入国家“863”计划计划：1999Sample DNAEach spot contains known DNABiochipComplementary DNA hybridizeSignal appearsBiochip Based on Hybridization 7我国残疾人口有我国残疾人口有8296万，其中耳聋残疾人群万，其中耳聋残疾人群占占2004万，占万，占24%，累及，累及2.6亿家庭人口。亿家庭人口。耳聋人群耳聋人群2006年第二次全国残疾人抽样调查数据年第二次全国残疾人抽样调查数据 8耳 聋非综合征型耳聋（70%）遗传因素(约60%)常染色体隐性（80%）环境因素（约40%）综合征型耳聋（30%）Alport 综合征Pendred综合征Waardenburg综合征BOR综合征Usher综合征细菌感染病毒感染耳毒性药物声损伤常染色体显性（15%）X连锁（1%3%）线粒体 1%耳耳 聋聋 的的 致致 病病 因因 素素9中国人群遗传性耳聋的特点中国人群遗传性耳聋的特点n遗传性耳聋突变位点具有明显的种族差异遗传性耳聋突变位点具有明显的种族差异n中国人群大部分遗传性耳聋由中国人群大部分遗传性耳聋由4个基因的突变所引起：个基因的突变所引起：GJB2、GJB3、SLC26A4（PDS）、）、mtDNA 12s rRNA等等n中国人群的耳聋突变热点：中国人群的耳聋突变热点：lGJB2：35 del G，176 del 16，235 del G，299 del ATlSLC26A4（PDS）：）：IVS7-2 AG，2168 AGlGJB3：538CTl线粒体：线粒体：12S rRNA：1555 AG，1494 CT10基因型与临床表型的对应关系基因型与临床表型的对应关系线粒体基因线粒体基因 C1494T、A1555G突变：突变：氨基糖甙类药物敏感性耳聋氨基糖甙类药物敏感性耳聋GJB2基因：基因：先天性重度以上感音神经性耳聋先天性重度以上感音神经性耳聋PDS基因：基因：大前庭导水管综合征（大前庭导水管综合征（EVAS）一种内耳畸形，先天或后天）一种内耳畸形，先天或后天重度以上感音神经性耳聋重度以上感音神经性耳聋GJB3：后天高频感音神经性耳聋后天高频感音神经性耳聋11遗传性耳聋的遗传特点遗传性耳聋的遗传特点父母均为健康携带者12耳聋基因检测的价值耳聋基因检测的价值耳聋父亲耳聋母亲子女100%发病尽量避免两个同一基因纯合突变的聋人结婚！针对聋人群体：针对聋人群体：13耳聋基因检测的价值耳聋基因检测的价值耳聋父亲耳聋母亲子女正常携带者100%基因检测可指导聋人的婚配，避免婚后再生聋儿！针对聋人群体：针对聋人群体：14基因在NSHL中所占比例突变热点主要人群比例GJB2 40%35 del GCaucasoid50-70%176 del 16Asianno data235 del GChinese80%299 del ATAsianno dataGJB3no data538 CTChineseno dataPDS 40%IVS7-2 AG Chinese50%2168 AG Chinese10%Japanese50%12S rRNA no data1555 AG Chinese7%1494 CTChineseno data 现有位点可覆盖中国人群中现有位点可覆盖中国人群中 98%GJB2,80%PDS,90%药物性耳聋患者药物性耳聋患者 遗传性耳聋检测试剂盒包括的基因位点遗传性耳聋检测试剂盒包括的基因位点晶芯晶芯遗传性耳聋基因检测试剂盒遗传性耳聋基因检测试剂盒标本采集标本采集3 3管管EDTAEDTA抗凝的紫头管（最好空腹）抗凝的紫头管（最好空腹）16遗传性耳聋检测芯片的检测结果遗传性耳聋检测芯片的检测结果235 杂合1555均质IVS 杂合2168和IVS复合杂合2168 纯合Wild TypeControlWild typeMutation可对四个基因可对四个基因9个位点的基因型进行准确检测，个位点的基因型进行准确检测，报告野生、杂合突变或纯合突变等三种结果报告野生、杂合突变或纯合突变等三种结果 QC BC PC PC NC QC 35W IC35 538W 35M ICG3 538M 176W 1494W PC 176M 1494M BC235W 1555W 2168W 235M 1555M 2168M 299W ICmt IVSW299M IC21 IVSM ICG2 BC ICIVS 检测意义检测意义nGJB2基因 先天性耳聋基因：当GJB2基因发生突变时，患者出生即表现出耳聋症状 检测意义：为耳聋患者确诊病因；指导生育有聋儿的家庭再次生育；筛查有耳聋家族史的家庭成员的基因突变情况；等n线粒体12s rRNA基因 药毒性耳聋致病基因：当该基因发生突变时，患者听力正常，但当使用氨基糖甙类药物时，就会导致重度耳聋的发生 检测意义：通过检测此基因，可以明确被检者该基因突变情况，指导患者用药；明确患者家庭中该疾病的遗传性19nGJB3基因 后天性耳聋基因：当GJB3基因发生突变时，患者青少年时期听力正常，当发育至青壮年期间（2030岁）时，听力逐渐下降，直至发生重度耳聋 检测意义：通过检测此基因，可以为听力下降的患者明确病因；指导生育有聋病患者的家庭再次生育；筛查有耳聋家族史的家庭成员的基因突变情况nSLC26A4（PDS）基因 大前庭导水管综合征致病基因：当PDS基因发生突变时，患者出生时耳蜗发生畸变，但不发生耳聋症状，当患者患感冒、头部受打击时，听力逐渐下降，直至发生重度耳聋 检测意义：通过检测此基因，可以为听力下降的患者明确病因；指导患者生活习惯，指导生育有聋病患者的家庭再次生育；筛查有耳聋家族史的家庭成员的基因突变情况实例介绍122样本由杭州惠样本由杭州惠耳听力提供耳听力提供父亲：父亲：21682168突变携带者；突变携带者；听力正常听力正常母亲：母亲：IVSIVS突变携带者；突变携带者；听力正常听力正常孩子：孩子：SLC26A4SLC26A4基因复合杂合；基因复合杂合；聋儿聋儿实例介绍223样本由中国聋康样本由中国聋康中心提供中心提供父亲：父亲：235235突变携带者；突变携带者；听力正常听力正常母亲：母亲：299299突变携带者；突变携带者；听力正常听力正常孩子：孩子：GJB2GJB2基因复合杂合；基因复合杂合；聋儿聋儿实例介绍324父亲：野生型；父亲：野生型；聋儿聋儿母亲：野生型；母亲：野生型；聋儿聋儿孩子：孩子：野生型；野生型；听力正常听力正常样本由大坪医院提供样本由大坪医院提供LuminexLuminex 200 200TMTM多功能流式点阵仪多功能流式点阵仪n液态芯片是基于液态芯片是基于Luminex200TM（美国（美国Luminex公司）的是一个多功能生物芯公司）的是一个多功能生物芯片平台，既能检测蛋白、又能检测核酸的高通量技术平台片平台，既能检测蛋白、又能检测核酸的高通量技术平台n通常用于免疫分析、核酸分析、受体和配体分析等临床检测和科学研究通常用于免疫分析、核酸分析、受体和配体分析等临床检测和科学研究nLuminexTM有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号和计算机运用法则，具有很高的检测特异性和灵敏度字信号和计算机运用法则，具有很高的检测特异性和灵敏度 Luminex200TMLuminex xMAP Technology-1http:/Luminex xMAP Technology-2Luminex xMAP Technology-24263318525816HPV DNAHPV DNA分型检测液芯操作配套设备分型检测液芯操作配套设备 多重多重 PCR 杂杂 交交30-40min2.5hr15min40sec/sample xMAPTM 检测检测 抽提抽提DNA 标本采集标本采集采样刷、细胞保存液、冰箱离心机（10000rpm）、TIP头（大、中、小）、EP管、水浴锅、金属加热器、移液器（1000l、200l）、手套、口罩PCR仪（非荧光）、TIP头（大、中、小）、PCR管、PCR实验室实验室流式荧光仪（Luminex200TM）、电脑PCR仪（非荧光）、TIP头（大、中、小）、PCR管液芯液芯HPV DNAHPV DNA分型产品三大优势分型产品三大优势n激光分析，数字结果激光分析，数字结果n无需洗涤，减少污染无需洗涤，减少污染n液相杂交，重复性好液相杂交，重复性好液相杂交，效率高、重复性好液相杂交，效率高、重复性好 固态芯片产品：固态芯片产品：膜条式反向杂交，基质不均一，温控困难，重复性差 液芯产品：液芯产品：液相杂交，反应彻底，温控严格，重复性好已获已获SFDA药证的项目药证的项目nHPV分型（高危、低危型，同时检测26种压型）n肿瘤标志物（13种）n自身免疫性疾病的诊断标记物OUTLINE测序技术测序技术乙肝病毒耐药突变检测乙肝病毒耐药突变检测预测某些疾病的遗传风险程度预测某些疾病的遗传风险程度肿瘤化疗药物敏感试验肿瘤化疗药物敏感试验生物芯片技术生物芯片技术固相芯片固相芯片液相芯片液相芯片人类基因组计划人类基因组计划The Human Genome ProjectThe Human Genome Projectn1985:1985:提出对整个人提出对整个人类基因组类基因组DNADNA测序测序n1990:1990:国际合作项目，国际合作项目，历时历时1313年年 n花费：花费：$3 Billion$3 Billion人类基因组计划人类基因组计划The Human Genome Project人类基因组计划人类基因组计划The Human Genome Project4.dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,and dTTP)ddGTPddCTPddTTPddATP5.荧光标记的 ddNTPs：不同荧光标记Now we run our products on gel6.DNA Polymerase3.互补的引物5555一个反应1.一个反应中，一个未知片断55552.有一段已知序列33337.ddNTP 参入-链合成终止3333 双脱氧荧光测序方法双脱氧荧光测序方法荧光荧光ddGTPddATPddTTPddCTP同位素同位素Sequence of unknown fragmentvs.电泳和数据的产生电泳和数据的产生:Sequence of unknown fragmentShortest synthesized band=5 end of synthesized strandLongest synthesized band=3 end of synthesized strand全自动测序方法全自动测序方法 Automated SequencingAutomated Sequencing测序技术的飞跃测序技术的飞跃n2003年，“HGP”获得首张人类全基因组图谱，花费了30亿美元和13年的时间nCraig Venter开发出一种快速追踪测序方法，并于2007年9月完成Venter自身全基因组的测定工作，花费了大约1亿美元Bad boy of Science 测序技术的飞跃测序技术的飞跃n2008.4.17Nature杂志上，454测序新技术：美国454 Life Sciences公司，花了150万美元，4个月nIllumina genome analyzer nApplied Biosystems SOLiD sequencer 454 sequencing：Emulsion PCR(emPCR)Mix DNA Library&capture beads(limited dilution)Create“Water-in-oil”emulsion+PCR Reagents+Emulsion Oil Perform emulsion PCR Adapter carrying library DNAABMicro-reactors Adapter complementLoad beads into PicoTiterPlate Load Enzyme Beads44 m 5/4/202450测序技术的飞跃测序技术的飞跃nHelicos公司开发的HeliScope Sequencer l“单分子测序”l不需要PCR扩增 l成本最低 n目标：10万美元，3个工作日左右n一个重要的里程碑l在联系个人化基因组和个人化治疗方面l破解生命密码并找到缺陷基因l对于各种遗传疾病、癌症、肥胖等具有难以估量的意义测序技术在临床上的应用测序技术在临床上的应用n肝炎病毒变异、分型的检测（肝炎病毒变异、分型的检测（HBV HBV）n预测某些疾病的遗传风险程度（乳腺癌、结肠癌）预测某些疾病的遗传风险程度（乳腺癌、结肠癌）n个体化用药指导个体化用药指导 （肿瘤化疗用药指导）（肿瘤化疗用药指导）肝炎病毒变异、分型的检测（HBV）核苷类药物核苷类药物干扰素干扰素耐药突变点检测耐药突变点检测LAMADVETVC基因区变异基因区变异 与肝脏疾病的严重程度有关与肝脏疾病的严重程度有关 与抗病毒治疗的效应与抗病毒治疗的效应 与肝癌栓塞治疗的效应与肝癌栓塞治疗的效应 HBVHBV基因分型基因分型n可可在在耐耐药药临临床床表表现现发发生生前前1 14 4个个月月检检测出突变株测出突变株n适时调整用药方案适时调整用药方案n了解病毒在体内存在的状态了解病毒在体内存在的状态n判断肝癌发生的风险率判断肝癌发生的风险率存在着天然耐药株存在着天然耐药株HBV DNA 阳性阳性乳腺癌乳腺癌(breast cancer)(breast cancer)n发生于乳腺导管上皮细胞发生于乳腺导管上皮细胞的恶性肿瘤的恶性肿瘤n是女性常见的肿瘤之一是女性常见的肿瘤之一,约约占全身恶性肿瘤的占全身恶性肿瘤的7%-10%n全世界每年新发乳腺癌约全世界每年新发乳腺癌约150 万例万例,死亡约死亡约57 万例万例GeneticsnBRCA-1nBRCA-2nP53,Rb-1nHer-2/neu,c-erB2,c-mycBRCA1BRCA1、BRCA2BRCA2基因突变与乳腺癌基因突变与乳腺癌n通过对有乳腺癌家族史妇女的通过对有乳腺癌家族史妇女的BRCA1BRCA1和和BRCA2BRCA2基因突基因突变的检测显示变的检测显示,此类人群中约有此类人群中约有10%10%为为BRCA1BRCA1和和BRCA2BRCA2基因突变的携带者。基因突变的携带者。BRCA1BRCA1和和BRCA2BRCA2基因突变的携带基因突变的携带者到者到7070岁时岁时,发生乳腺癌的风险累计达到发生乳腺癌的风险累计达到80%-85%,80%-85%,一生中发生乳腺癌的风险可高达一生中发生乳腺癌的风险可高达90%90%nBRCA1BRCA1和和BRCA2BRCA2基因突变的检测是对于有乳腺癌家族基因突变的检测是对于有乳腺癌家族史人群进行乳腺癌筛查和早期诊断的有效方法史人群进行乳腺癌筛查和早期诊断的有效方法What can YOU do?1.一侧乳腺癌2.乳腺肿块3.有家族史4.肿瘤标记物n每个人是不同的每个人是不同的n大多数病人的治疗方案是相同的大多数病人的治疗方案是相同的n医药费医药费:数以万计的钱花在没有疗效的药物治疗数以万计的钱花在没有疗效的药物治疗n死亡死亡/病重病重:2.2:2.2 亿严重的病例和超过亿严重的病例和超过100100万的死万的死亡例数亡例数最大的挑战最大的挑战:药物个体反应的差异药物个体反应的差异相同药物，相同药效？相同药物，相同药效？l相同临床表现相同临床表现l相同实验室检查结果相同实验室检查结果l相同疾病相同疾病(?)相同药物相同药物.不同的疗效不同的疗效?不同的遗传背景不同的遗传背景可能的原因可能的原因:n药物药物-药物的相互作用药物的相互作用.n药物代谢药物代谢n药物靶点的易感性药物靶点的易感性nOr.SNPSNPSNP:单核苷酸多态性单核苷酸多态性 （Single Nucleotide Single Nucleotide PolymorphismsPolymorphisms）每个个体每个个体l99.9%相同的序列相同的序列l0.1%不同的序列不同的序列 决定了对疾病的易感性决定了对疾病的易感性和对药物的敏感度和对药物的敏感度人群人群 A人群人群 B 药物对大部分病人有效药物对大部分病人有效药物对大部分药物对大部分病人无效病人无效使用该药物使用该药物选择另外的药物选择另外的药物SNP SNP 和药物疗效评价和药物疗效评价药物对大部分药物对大部分病人毒性增加病人毒性增加降低用药剂量降低用药剂量n国际成熟的肿瘤靶向用药的分子检测国际成熟的肿瘤靶向用药的分子检测肿瘤分子分型检测的四大方面肿瘤分子分型检测的四大方面l非小细胞性肺癌：易瑞沙、特罗凯非小细胞性肺癌：易瑞沙、特罗凯 EGFREGFR基因型选择性应基因型选择性应用用,疗效提高疗效提高5 5倍倍l结直肠癌：爱必妥结直肠癌：爱必妥 KrasKras基因型选择性应用疗效提高基因型选择性应用疗效提高50%50%l乳腺癌：赫赛汀乳腺癌：赫赛汀 her2her2基因型选择性应用疗效提高基因型选择性应用疗效提高2 2倍倍n国际研究中的肿瘤靶向用药的分子检测国际研究中的肿瘤靶向用药的分子检测l乳腺癌：拉帕替尼乳腺癌：拉帕替尼 her2her2基因型选择性应用，对赫赛汀无基因型选择性应用，对赫赛汀无效者疗效良好效者疗效良好分子信号通路分子信号通路n国际成熟的肿瘤用药毒作用预测性分子检测国际成熟的肿瘤用药毒作用预测性分子检测肿瘤分子分型检测的四大方面肿瘤分子分型检测的四大方面l伊立替康：因伊立替康：因UGT1A1 TATAUGT1A1 TATA盒中盒中TATA重复数重复数6TA/7TA6TA/7TA的不同的不同毒性差别显著；有必要调整剂量毒性差别显著；有必要调整剂量n国际研究中的肿瘤用药敏感性和毒性预测性分子检测国际研究中的肿瘤用药敏感性和毒性预测性分子检测l氟尿嘧啶类；铂类；紫杉醇类，蒽环类氟尿嘧啶类；铂类；紫杉醇类，蒽环类大坪医院检验科大坪医院检验科谢谢谢谢 谢！谢！谢！谢！