免疫学检测技术的基本原理

第二十二章第二十二章 免疫学检测免疫学检测技术的基本原理技术的基本原理1主主 要要 内内 容容n n抗原和抗体的体外实验抗原和抗体的体外实验n n免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定2n 免疫学检测技术：免疫学检测技术：运用免疫学原理设计的检测方法运用免疫学原理设计的检测方法 可用于：可用于：诊断免疫相关性疾病诊断免疫相关性疾病 探讨发病机制探讨发病机制 监测病情和治疗效果监测病情和治疗效果3第一节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测对感染性疾病的诊断：对感染性疾病的诊断：n n感染早期：查病原体（抗原）n n感染晚期：检测特异性抗体抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法 =血清学方法（血清学反应，血清学方法（血清学反应，血清学方法（血清学反应，血清学方法（血清学反应，serological reactionserological reaction）用已知用已知用已知用已知 Ag Ag 检测未知检测未知检测未知检测未知 Ab(?)Ab(?)用已知用已知用已知用已知 Ab Ab 检测未知检测未知检测未知检测未知 Ag(?)Ag(?)4一、抗原抗体反应的原理：一、抗原抗体反应的原理：（一）特异性：（一）特异性：（一）特异性：（一）特异性：AgAg（表位）与表位）与表位）与表位）与Ab(CDR)Ab(CDR)的结合的结合的结合的结合 可逆性：可逆性：可逆性：可逆性：非共价键结合非共价键结合非共价键结合非共价键结合（二）可见性：（二）可见性：（二）可见性：（二）可见性：AbAb与与与与AgAg的比例合适的比例合适的比例合适的比例合适 形成肉眼可见聚合物形成肉眼可见聚合物形成肉眼可见聚合物形成肉眼可见聚合物。阶段性：阶段性：阶段性：阶段性：特异性结合阶段：几秒特异性结合阶段：几秒特异性结合阶段：几秒特异性结合阶段：几秒 几分钟几分钟几分钟几分钟 可见反应阶段：可见反应阶段：几分钟几分钟 几小时几小时 几十小时几十小时5影响抗原抗体反应的主要因素：影响抗原抗体反应的主要因素：AgAg与与与与AbAb的浓度、的浓度、的浓度、的浓度、比例比例比例比例电解质电解质电解质电解质:0.85%NaCl0.85%NaCl 温度温度温度温度:37:370 0C C 酸碱度酸碱度酸碱度酸碱度:pH=6-8pH=6-8AgAg浓度浓度浓度浓度A Ag g A Ab b复复复复合合合合物物物物前带前带前带前带后带后带后带后带等价带等价带等价带等价带6抗原与抗体的种类：抗原与抗体的种类：n n抗原的类型：抗原的类型：n n颗粒性抗原：颗粒性抗原：细胞，细菌，人工微球细胞，细菌，人工微球/珠珠n n可溶性抗原：可溶性抗原：细胞成分，蛋白分子，小分子化合细胞成分，蛋白分子，小分子化合物物7n n抗体的类型：抗体的类型：n n多克隆抗体多克隆抗体(抗血清抗血清):):识别多个表位，特异性识别多个表位，特异性差差n n单克隆抗体：单克隆抗体：识别单个表位，识别单个表位，特异性好特异性好n n抗抗-抗体（二抗）：抗体（二抗）：抗异种抗异种IgIg的抗体的抗体8二、抗原或抗体的检测方法二、抗原或抗体的检测方法（一）凝集反应：（一）凝集反应：（agglutination）颗粒性抗原（或可溶性抗原吸附在与颗粒性抗原（或可溶性抗原吸附在与免疫无关的载体上）与相应抗体在适当条免疫无关的载体上）与相应抗体在适当条件下形成肉眼可见的凝集小块。件下形成肉眼可见的凝集小块。91 1、直接凝集反应：、直接凝集反应：天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象抗体直接结合所出现的凝集现象 ：（1 1）玻片法）玻片法）玻片法）玻片法定性试验：定性试验：定性试验：定性试验：已知已知已知已知 Ab Ab 未知未知未知未知 Ag(?)Ag(?)ABOABO血型鉴定，血型鉴定，血型鉴定，血型鉴定，细菌种属抗原型别的鉴定细菌种属抗原型别的鉴定细菌种属抗原型别的鉴定细菌种属抗原型别的鉴定+10（2）试管法）试管法半定量试验：半定量试验：诊断伤寒副伤寒的诊断伤寒副伤寒的“肥达氏反应肥达氏反应”病人血清病人血清病人血清病人血清倍比稀释倍比稀释倍比稀释倍比稀释伤寒细菌悬液伤寒细菌悬液伤寒细菌悬液伤寒细菌悬液1:21:41:81:161:321:64对照对照112 2、间接凝集反应：、间接凝集反应：+载体：载体：载体：载体：红红红红 血血血血 球：球：球：球：间接血凝试验间接血凝试验间接血凝试验间接血凝试验12（二）沉淀反应二）沉淀反应 (precipitation)：可溶性性抗原与相应抗体直接结合，在可溶性性抗原与相应抗体直接结合，在适当条件下形成肉眼可见的沉淀现象（沉淀适当条件下形成肉眼可见的沉淀现象（沉淀线）。线）。1 1、单向免疫扩散、单向免疫扩散、单向免疫扩散、单向免疫扩散(radical(radical immunodiffusionimmunodiffusion)：可定量检测可定量检测可定量检测可定量检测AgAg13含抗人含抗人含抗人含抗人IgGIgG琼脂琼脂琼脂琼脂制成平板制成平板制成平板制成平板待测血样待测血样待测血样待测血样(IgGIgG浓度浓度浓度浓度?)?)标准人标准人标准人标准人IgGIgG不同浓度不同浓度不同浓度不同浓度制作标准曲线制作标准曲线制作标准曲线制作标准曲线待测样品结果待测样品结果待测样品结果待测样品结果142、双向免疫扩散、双向免疫扩散(double(double immunodiffusionimmunodiffusion)：-定性检测定性检测Ag或或Ab；Ab效价滴定效价滴定AgAgAbAb扩散扩散扩散扩散AgAgAbAb扩散扩散扩散扩散1:21:41:81:161:241:641516、免疫电泳、免疫电泳（immuno electrophoresis)+标本先电泳标本先电泳标本先电泳标本先电泳*两侧挖槽加两侧挖槽加两侧挖槽加两侧挖槽加AbAbAbAb孵孵孵孵育后出现肉眼可育后出现肉眼可育后出现肉眼可育后出现肉眼可见沉淀见沉淀见沉淀见沉淀-17184 4、火箭电泳：单扩试验、火箭电泳：单扩试验、火箭电泳：单扩试验、火箭电泳：单扩试验 +电泳电泳电泳电泳 可定量分析可定量分析可定量分析可定量分析195 5、免疫比浊：、免疫比浊：Ag Ab Ag-Ab（免疫复合物）免疫复合物）比浊仪比浊仪 测量测量 浊度浊度，计算抗原含量计算抗原含量目前替代目前替代 单扩测量血清单扩测量血清Ig20（四）免疫标记技术四）免疫标记技术 用标记抗体或抗原进行抗原抗体反应用标记抗体或抗原进行抗原抗体反应：利用荧光素、酶、放射性同位素以及胶利用荧光素、酶、放射性同位素以及胶利用荧光素、酶、放射性同位素以及胶利用荧光素、酶、放射性同位素以及胶体金标记抗体，以检测相应抗原的技术体金标记抗体，以检测相应抗原的技术体金标记抗体，以检测相应抗原的技术体金标记抗体，以检测相应抗原的技术1 1、免疫荧光技术、免疫荧光技术 （immunofluorescenceimmunofluorescence techniques techniques）n利用荧光素标记抗体或抗抗体以检测细胞表面或利用荧光素标记抗体或抗抗体以检测细胞表面或利用荧光素标记抗体或抗抗体以检测细胞表面或利用荧光素标记抗体或抗抗体以检测细胞表面或细胞内抗原的技术。细胞内抗原的技术。细胞内抗原的技术。细胞内抗原的技术。211 1、免疫荧光技术免疫荧光技术 （immunofluorescenceimmunofluorescence techniques techniques）直接法直接法 间接法间接法 2223间接免疫荧光检测自身抗核抗体间接免疫荧光检测自身抗核抗体间接免疫荧光检测自身抗核抗体间接免疫荧光检测自身抗核抗体24n n用酶用酶用酶用酶标记标记标记标记AbAbAbAb(或或或或Ag)Ag)Ag)Ag)与标本中的与标本中的与标本中的与标本中的Ag(Ag(Ag(Ag(或或或或AbAbAbAb)发生发生发生发生特异性结合特异性结合特异性结合特异性结合n n加入酶的底物，在酶作加入酶的底物，在酶作加入酶的底物，在酶作加入酶的底物，在酶作用下产生有色物质用下产生有色物质用下产生有色物质用下产生有色物质n n根据颜色可作出判断或测量光密度值根据颜色可作出判断或测量光密度值根据颜色可作出判断或测量光密度值根据颜色可作出判断或测量光密度值免疫酶标技术：免疫酶标技术：酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（enzyme linked enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay，ELISAELISA）2、免疫酶标技术：、免疫酶标技术：25（1）双抗体夹心法：）双抗体夹心法：+26（2）间接法）间接法+27283、放射免疫测定、放射免疫测定（radio immunoassay，RIA）：）：n n利用放射性同位素标记技术检测抗利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术原的技术n n灵敏度高，用于检测激素等血清中灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质微量物质294.4.免疫胶体金标记技术免疫胶体金标记技术(immunologic colloidal gold signature(immunologic colloidal gold signature，ICS)ICS)n 胶体金颗粒表面带有较多电荷，用胶胶体金颗粒表面带有较多电荷，用胶体金颗粒标记抗体，检测组织或细胞标体金颗粒标记抗体，检测组织或细胞标本中的抗原。本中的抗原。30常用方法：胶体金斑点渗滤试验常用方法：胶体金斑点渗滤试验常用方法：胶体金斑点渗滤试验常用方法：胶体金斑点渗滤试验 胶体金斑点免疫层析试验胶体金斑点免疫层析试验胶体金斑点免疫层析试验胶体金斑点免疫层析试验BDCTA31第二节第二节 免疫细胞测定免疫细胞测定一、淋巴细胞的分离与类型鉴定一、淋巴细胞的分离与类型鉴定一、淋巴细胞的分离与类型鉴定一、淋巴细胞的分离与类型鉴定 外周血单个核细胞外周血单个核细胞外周血单个核细胞外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞。包括淋巴细胞和单核细胞。包括淋巴细胞和单核细胞。包括淋巴细胞和单核细胞。红细胞和多核白细胞密度：为红细胞和多核白细胞密度：为红细胞和多核白细胞密度：为红细胞和多核白细胞密度：为1.0921.092左右，左右，左右，左右，淋巴细胞和单核细胞密度：淋巴细胞和单核细胞密度：淋巴细胞和单核细胞密度：淋巴细胞和单核细胞密度：1.0751.0751.0901.090，血小板密度：血小板密度：血小板密度：血小板密度：1.0301.0301.0351.035。聚蔗糖泛影葡胺聚蔗糖泛影葡胺聚蔗糖泛影葡胺聚蔗糖泛影葡胺(Ficoll):1.0770.001(Ficoll):1.0770.00132一、免疫细胞的分离：一、免疫细胞的分离：一、免疫细胞的分离：一、免疫细胞的分离：（一）外周血单个核细（一）外周血单个核细（一）外周血单个核细（一）外周血单个核细胞（胞（胞（胞（PBMCPBMC）的分离：的分离：的分离：的分离：方法：密度梯度离心法方法：密度梯度离心法方法：密度梯度离心法方法：密度梯度离心法分离液：聚蔗糖泛影葡分离液：聚蔗糖泛影葡分离液：聚蔗糖泛影葡分离液：聚蔗糖泛影葡胺胺胺胺 （比重：（比重：（比重：（比重：1.077 1.077 0.0010.001）稀释稀释稀释稀释全血全血全血全血分离液分离液分离液分离液 RBC RBC粒粒粒粒细胞细胞细胞细胞PBMCPBMC稀释稀释稀释稀释血浆血浆血浆血浆33（二）（二）（二）（二）T T、B B细胞的纯化：细胞的纯化：细胞的纯化：细胞的纯化：贴壁法贴壁法贴壁法贴壁法去除单核细胞去除单核细胞去除单核细胞去除单核细胞 花环沉降法、尼龙毛法花环沉降法、尼龙毛法花环沉降法、尼龙毛法花环沉降法、尼龙毛法分离分离分离分离T T、B B细胞细胞细胞细胞（三）免疫磁珠分离法：（三）免疫磁珠分离法：（三）免疫磁珠分离法：（三）免疫磁珠分离法：（四）（四）（四）（四）FACSFACS分离法：分离法：分离法：分离法：34二、二、T细胞数量检测：细胞数量检测：1、E花环试验：花环试验：n n原理：原理：原理：原理：T T细胞均有细胞均有细胞均有细胞均有CD2CD2分子，而分子，而分子，而分子，而B B细胞无细胞无细胞无细胞无;n n将将将将SRBCSRBC与人外周血淋巴细胞混合与人外周血淋巴细胞混合与人外周血淋巴细胞混合与人外周血淋巴细胞混合;n nSRBCSRBC可可可可结合于结合于结合于结合于T T细胞周围形成花环细胞。细胞周围形成花环细胞。细胞周围形成花环细胞。细胞周围形成花环细胞。352、免疫荧光标记技术：、免疫荧光标记技术：n n用荧光素标记用荧光素标记用荧光素标记用荧光素标记CD3CD3、CD4CD4或或或或CD8CD8单抗与淋单抗与淋单抗与淋单抗与淋巴细胞混合巴细胞混合巴细胞混合巴细胞混合n n经荧光显微镜观察经荧光显微镜观察经荧光显微镜观察经荧光显微镜观察n n或用流式细胞仪测定或用流式细胞仪测定或用流式细胞仪测定或用流式细胞仪测定363738三、三、NK 细胞杀伤功能检测：细胞杀伤功能检测：-NK-NK细胞具有非特异杀伤肿瘤活性，在体细胞具有非特异杀伤肿瘤活性，在体细胞具有非特异杀伤肿瘤活性，在体细胞具有非特异杀伤肿瘤活性，在体外与肿瘤细胞混合，可被激活而杀伤肿瘤细胞外与肿瘤细胞混合，可被激活而杀伤肿瘤细胞外与肿瘤细胞混合，可被激活而杀伤肿瘤细胞外与肿瘤细胞混合，可被激活而杀伤肿瘤细胞n n取外周血淋巴细胞（含取外周血淋巴细胞（含取外周血淋巴细胞（含取外周血淋巴细胞（含NKNK细胞）细胞）细胞）细胞）n n与与与与K562K562（白血病细胞株）混合，孵育白血病细胞株）混合，孵育白血病细胞株）混合，孵育白血病细胞株）混合，孵育4h4hn n通过形态学或细胞计数方法检测通过形态学或细胞计数方法检测通过形态学或细胞计数方法检测通过形态学或细胞计数方法检测K562K562肿瘤细胞肿瘤细胞肿瘤细胞肿瘤细胞被杀伤的数量被杀伤的数量被杀伤的数量被杀伤的数量n n计算计算计算计算NKNK细胞的杀伤活性细胞的杀伤活性细胞的杀伤活性细胞的杀伤活性39四、白细胞功能测定四、白细胞功能测定（一）、一）、一）、一）、T T 细胞功能测定细胞功能测定细胞功能测定细胞功能测定 、细胞增殖试验、细胞增殖试验、细胞增殖试验、细胞增殖试验 T T细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，诱发的分裂和增殖过程却是同，但被激活后，诱发的分裂和增殖过程却是同，但被激活后，诱发的分裂和增殖过程却是同，但被激活后，诱发的分裂和增殖过程却是相同。相同。相同。相同。用用用用T T细胞敏感刺激物体外刺激细胞敏感刺激物体外刺激细胞敏感刺激物体外刺激细胞敏感刺激物体外刺激T T细胞，细胞，细胞，细胞，T T细胞细胞细胞细胞发生增殖、转化，根据增殖转化能力评价发生增殖、转化，根据增殖转化能力评价发生增殖、转化，根据增殖转化能力评价发生增殖、转化，根据增殖转化能力评价T T细细细细胞功能。胞功能。胞功能。胞功能。40形态学特征形态学特征形态学特征形态学特征:体积增大体积增大体积增大体积增大4-54-5倍倍倍倍;核染色体疏松核染色体疏松核染色体疏松核染色体疏松;核核核核 仁明显仁明显仁明显仁明显;胞浆出现空泡。1、T淋巴细胞转化试验：淋巴细胞转化试验：41（）（）（）（）3 3H-TdRH-TdR 细胞周期细胞周期细胞周期细胞周期 外周血中外周血中外周血中外周血中T T细胞通常处于细胞周期的细胞通常处于细胞周期的细胞通常处于细胞周期的细胞通常处于细胞周期的G0G0期，期，期，期，受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，从受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，从受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，从受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，从G0G0期进入期进入期进入期进入G1G1期，并合成蛋白质、期，并合成蛋白质、期，并合成蛋白质、期，并合成蛋白质、RNARNA和和和和DNADNA前体物质等，为前体物质等，为前体物质等，为前体物质等，为DNADNA复制准备物质基础，复制准备物质基础，复制准备物质基础，复制准备物质基础，然后进入然后进入然后进入然后进入S S期，细胞合成期，细胞合成期，细胞合成期，细胞合成DNADNA量倍增，此时若在培量倍增，此时若在培量倍增，此时若在培量倍增，此时若在培养液中加养液中加养液中加养液中加3H3H标记的标记的标记的标记的DNADNA前体前体前体前体(3H-(3H-胸腺嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷，3 3H-H-TdR)TdR)，后者即掺入新合成后者即掺入新合成后者即掺入新合成后者即掺入新合成的的的的DNADNA中，根据掺入的多少中，根据掺入的多少中，根据掺入的多少中，根据掺入的多少推测细胞增殖程度。推测细胞增殖程度。推测细胞增殖程度。推测细胞增殖程度。42将单个核细胞悬液加入含培养液的试管中，实将单个核细胞悬液加入含培养液的试管中，实将单个核细胞悬液加入含培养液的试管中，实将单个核细胞悬液加入含培养液的试管中，实验管加适量验管加适量验管加适量验管加适量PHAPHA后，空白对照不加后，空白对照不加后，空白对照不加后，空白对照不加PHAPHA，置，置，置，置5 5CO2CO2温箱温箱温箱温箱3737培养培养培养培养56h56h，加适量加适量加适量加适量3H-TdR3H-TdR，继续培养继续培养继续培养继续培养16h16h，收集细胞，用液体闪烁器测量，记录每分钟脉冲数收集细胞，用液体闪烁器测量，记录每分钟脉冲数收集细胞，用液体闪烁器测量，记录每分钟脉冲数收集细胞，用液体闪烁器测量，记录每分钟脉冲数(cpmcpm)，刺激指数刺激指数刺激指数刺激指数(SI)(SI)表示转化能力。表示转化能力。表示转化能力。表示转化能力。SISIPHAPHA刺激管刺激管刺激管刺激管cpmcpm均值均值均值均值/对照管对照管对照管对照管cpmcpm均值均值均值均值 SI SI 2 243（2 2）MTTMTT法法法法 单个核细胞与单个核细胞与单个核细胞与单个核细胞与PHAPHA混合培养混合培养混合培养混合培养70h70h后，加入四后，加入四后，加入四后，加入四甲基偶氮唑盐（甲基偶氮唑盐（甲基偶氮唑盐（甲基偶氮唑盐（MTTMTT）后再培养后再培养后再培养后再培养46h46h，MTTMTT在在在在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成蓝黑色的成蓝黑色的成蓝黑色的成蓝黑色的MTT-MTT-甲，形成甲，形成甲，形成甲，形成MTT-MTT-甲的量与细胞甲的量与细胞甲的量与细胞甲的量与细胞增殖程度正相关，测增殖程度正相关，测增殖程度正相关，测增殖程度正相关，测ODOD值：值：值：值：SI=SI=试验孔试验孔试验孔试验孔ODOD值值值值/对照孔对照孔对照孔对照孔ODOD值值值值44、细胞毒试验、细胞毒试验CTL、NK细胞对靶细胞有直接杀伤作细胞对靶细胞有直接杀伤作用，依据待检细胞的性质，选用相应靶用，依据待检细胞的性质，选用相应靶细胞，根据靶细胞破坏程度，鉴定相应细胞，根据靶细胞破坏程度，鉴定相应细胞的功能。细胞的功能。453.细胞因子的检测细胞因子的检测1)1)、免疫学检测：、免疫学检测：、免疫学检测：、免疫学检测：ELISAELISA 细胞增殖法：细胞增殖法：细胞增殖法：细胞增殖法：IL-1IL-1、IL-2IL-2等等等等 靶细胞杀伤法：靶细胞杀伤法：靶细胞杀伤法：靶细胞杀伤法：TNFTNF2)2)、生物活性检测法、生物活性检测法、生物活性检测法、生物活性检测法3)3)、分子生物学方法、分子生物学方法、分子生物学方法、分子生物学方法:RT-PCR:RT-PCR检测检测检测检测mRNAmRNA46细胞因子检测可了解免疫调节，了解淋细胞因子检测可了解免疫调节，了解淋巴细胞亚群。巴细胞亚群。免疫学检测法免疫学检测法（1）双抗体夹心法）双抗体夹心法（2）ELISPOT （3）FCM法法47 （2）生物活性测定法）生物活性测定法 根据细胞因子的生物学活性，选用相根据细胞因子的生物学活性，选用相应实验系统：应实验系统：n n细胞增殖法n n直接杀伤法n n保护细胞免受病毒致病变法48（3 3）分子生物学方法：）分子生物学方法：检测基因表达检测基因表达 RTPCR法法 根据细胞因子的核酸序列，设计引物，根据细胞因子的核酸序列，设计引物，利用逆转录利用逆转录PCR测定特定细胞因子的测定特定细胞因子的mRNA的表达。的表达。494、皮肤试验（体内实验）、皮肤试验（体内实验）结核菌素皮肤试验：结核菌素皮肤试验：即即OT/PPD皮试。皮试。-反映体内细胞免疫功能水平。反映体内细胞免疫功能水平。以迟发型超敏反应检测细胞免疫功能。以迟发型超敏反应检测细胞免疫功能。50（二）（二）B 细胞功能测定细胞功能测定（）（）（）（）B B 细胞增殖试验细胞增殖试验细胞增殖试验细胞增殖试验 LPSLPS、SPASPA、抗抗抗抗IgMIgM 抗体抗体抗体抗体 B B 细胞受丝裂原刺激后分裂增殖，培养一细胞受丝裂原刺激后分裂增殖，培养一细胞受丝裂原刺激后分裂增殖，培养一细胞受丝裂原刺激后分裂增殖，培养一 定时间后计数抗体形成细胞的数目。定时间后计数抗体形成细胞的数目。定时间后计数抗体形成细胞的数目。定时间后计数抗体形成细胞的数目。51 （2 2）抗体形成细胞测定）抗体形成细胞测定）抗体形成细胞测定）抗体形成细胞测定 溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验 PBMCPBMC或组织来源的淋巴细胞、或组织来源的淋巴细胞、或组织来源的淋巴细胞、或组织来源的淋巴细胞、SPA-SPA-致敏的羊红细胞致敏的羊红细胞致敏的羊红细胞致敏的羊红细胞（SPA-SRBCSPA-SRBC）、）、）、）、抗人抗人抗人抗人IgIg抗体及补体抗体及补体抗体及补体抗体及补体4 4种成分混合在溶化种成分混合在溶化种成分混合在溶化种成分混合在溶化的的的的0.5%0.5%琼脂糖内，注入密封小室内。琼脂糖内，注入密封小室内。琼脂糖内，注入密封小室内。琼脂糖内，注入密封小室内。抗人抗人抗人抗人IgIg的的的的FcFc段与段与段与段与SPA-SRBCSPA-SRBC结合，抗体形成细胞分泌结合，抗体形成细胞分泌结合，抗体形成细胞分泌结合，抗体形成细胞分泌的的的的IgIg与抗人与抗人与抗人与抗人IgIg结合后活化补体，导致结合后活化补体，导致结合后活化补体，导致结合后活化补体，导致SRBCSRBC溶血，形成一溶血，形成一溶血，形成一溶血，形成一个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（plaqueplaque）。）。）。）。每一个空斑表示一个抗体形成细胞。每一个空斑表示一个抗体形成细胞。每一个空斑表示一个抗体形成细胞。每一个空斑表示一个抗体形成细胞。52（三）吞噬细胞功能测定（三）吞噬细胞功能测定、趋化功能测定、趋化功能测定、趋化功能测定、趋化功能测定 （）、（）、（）、（）、BoydenBoyden小室法小室法小室法小室法 由上下两室组成，中间隔以由上下两室组成，中间隔以由上下两室组成，中间隔以由上下两室组成，中间隔以8m8m的微孔滤膜。的微孔滤膜。的微孔滤膜。的微孔滤膜。检测细胞置于上室，趋化因子置于下室，如被检测细胞置于上室，趋化因子置于下室，如被检测细胞置于上室，趋化因子置于下室，如被检测细胞置于上室，趋化因子置于下室，如被趋化因子吸引，细胞通过滤膜并爬行于滤膜下趋化因子吸引，细胞通过滤膜并爬行于滤膜下趋化因子吸引，细胞通过滤膜并爬行于滤膜下趋化因子吸引，细胞通过滤膜并爬行于滤膜下侧，染色、计数可知趋化情况。侧，染色、计数可知趋化情况。侧，染色、计数可知趋化情况。侧，染色、计数可知趋化情况。53（）、琼脂凝胶法（）、琼脂凝胶法（）、过氧化物酶法（）、过氧化物酶法 中性粒细胞内含有过氧化物酶，趋化中性粒细胞内含有过氧化物酶，趋化后溶解细胞，加入过氧化物酶底物二甲后溶解细胞，加入过氧化物酶底物二甲氧苯胺，氧苯胺，405nm比色，以反映趋化活比色，以反映趋化活性。性。542、吞噬功能测定、吞噬功能测定 （）、硝基蓝四氮唑试验（）、硝基蓝四氮唑试验在白细胞中加入硝基蓝四氮唑试验溶在白细胞中加入硝基蓝四氮唑试验溶液，中性粒细胞在杀菌过程中产生液，中性粒细胞在杀菌过程中产生ROI，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞的其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞的NBT 还原成不溶解的暗兰色甲，沉积于还原成不溶解的暗兰色甲，沉积于胞浆中，称胞浆中，称NBT 阳性细胞，反映吞噬功阳性细胞，反映吞噬功能。能。55（）荧光标记物试验（）荧光标记物试验将荧光素标记的生物颗粒（如白色念将荧光素标记的生物颗粒（如白色念珠菌等）与白细胞混合后，温育一定时珠菌等）与白细胞混合后，温育一定时间后加入台盼蓝并洗涤，以除去未被吞间后加入台盼蓝并洗涤，以除去未被吞噬的荧光颗粒，离心收集细胞，重悬后噬的荧光颗粒，离心收集细胞，重悬后用荧光分光光度计定量分析。用荧光分光光度计定量分析。56第三节第三节 免疫学检测方法的应用免疫学检测方法的应用一、免疫学检测方法的评估与选择一、免疫学检测方法的评估与选择 金金金金标准：公认可靠的诊断方法。标准：公认可靠的诊断方法。标准：公认可靠的诊断方法。标准：公认可靠的诊断方法。特异性：用某方法检查非患者时出现阴性的可能性特异性：用某方法检查非患者时出现阴性的可能性特异性：用某方法检查非患者时出现阴性的可能性特异性：用某方法检查非患者时出现阴性的可能性 特异性真阴性特异性真阴性特异性真阴性特异性真阴性/（真阴性假阳性）（真阴性假阳性）（真阴性假阳性）（真阴性假阳性）X100X100敏感性：用该方法检查患者时出现阳性的可能性。敏感性：用该方法检查患者时出现阳性的可能性。敏感性：用该方法检查患者时出现阳性的可能性。敏感性：用该方法检查患者时出现阳性的可能性。敏感性真阳性敏感性真阳性敏感性真阳性敏感性真阳性/（真阳性假阴性）（真阳性假阴性）（真阳性假阴性）（真阳性假阴性）X100X10057、感染性疾病感染性疾病、免疫缺陷病、免疫缺陷病、自身免疫病、自身免疫病、超敏反应性疾病、超敏反应性疾病、肿瘤、肿瘤二、二、疾病的诊断疾病的诊断58、感染性疾病：、感染性疾病：、感染性疾病：、感染性疾病：动态观察病原体与抗体的消长动态观察病原体与抗体的消长动态观察病原体与抗体的消长动态观察病原体与抗体的消长、HIVHIV感染与免疫缺陷病：感染与免疫缺陷病：感染与免疫缺陷病：感染与免疫缺陷病：动态观察动态观察动态观察动态观察CD4CD4+T T细胞数量细胞数量细胞数量细胞数量、肿瘤患者：、肿瘤患者：、肿瘤患者：、肿瘤患者：动态监测察肿瘤相关抗原的水平动态监测察肿瘤相关抗原的水平动态监测察肿瘤相关抗原的水平动态监测察肿瘤相关抗原的水平4 4、器官移植患者：、器官移植患者：、器官移植患者：、器官移植患者：动态观察动态观察动态观察动态观察T T细胞活化标志的表达细胞活化标志的表达细胞活化标志的表达细胞活化标志的表达三、三、免免 疫疫 学学 监监 测测59