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动物取材与固定动物取材与固定一一、动物取材、动物取材（一）动物处死（一）动物处死要求：要求：动作迅速，及时解剖、取材与固定动作迅速，及时解剖、取材与固定（二）（二）（二）（二）动物处死动物处死动物处死动物处死的方法：的方法：的方法：的方法：可采用麻醉法、空气栓塞法、颈椎脱臼或断头、动脉可采用麻醉法、空气栓塞法、颈椎脱臼或断头、动脉放血等。放血等。1 1、狗用麻醉法或击头法、狗用麻醉法或击头法2 2、猫用窒息法、猫用窒息法3 3、兔用栓塞法、兔用栓塞法4 4、小白鼠用断颈法、小白鼠用断颈法（三）（三）动物取材动物取材选择选择 根据实验要求首先选择动物种类，其次选择组织部位及取材的大小，取材时应熟悉组织器官的结构特点。1、动物选择2、部位选择3、切面方向选择（四四）取材要求）取材要求1、新鲜2、小而薄 1.5cm1.5cm 0.5cm 3、保持原有的形态4、注意环境温度的影响5、刀、剪要锋利二、二、动物组织动物组织固定固定（一）（一）固定的目的和意义：固定的目的和意义：防止离体组织、细胞自溶与腐败，保持组织、细胞与生活时相似的形态和防止离体组织、细胞自溶与腐败，保持组织、细胞与生活时相似的形态和结构；结构；使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，使其保使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变成不溶性物质，使其保持原有的结构；持原有的结构；使组织中的各种物质沉淀、凝固后产生不同的折射率，形成光学上的差异，使组织中的各种物质沉淀、凝固后产生不同的折射率，形成光学上的差异，以便染色后易于观察和鉴别；以便染色后易于观察和鉴别；固定剂有硬化作用，可增加组织硬度，便于制片；固定剂有硬化作用，可增加组织硬度，便于制片；保存抗原及保存抗原及DNADNA、RNARNA，特别是准备用于做免疫组化染色和核酸原位杂交的，特别是准备用于做免疫组化染色和核酸原位杂交的标本，及时而恰当的固定尤其重要。标本，及时而恰当的固定尤其重要。（二）（二）动物组织动物组织取材与固定取材与固定1、成年家兔、成年家兔栓塞法处死 取下列组织取下列组织心肌心肌 （心脏乳头肌）入（心脏乳头肌）入ADFADF液液中固定中固定24h24h骨骼肌（舌肌）入骨骼肌（舌肌）入中性甲醛的固定液中性甲醛的固定液液中固定液中固定24h24h神经节（颈胸椎处）入神经节（颈胸椎处）入高尔基体固定液高尔基体固定液中固定中固定18h18h脊髓（颈胸椎处）入脊髓（颈胸椎处）入2%2%的硝酸银水溶液的硝酸银水溶液中固定中固定每班两只每班两只 两组同学完成。两组同学完成。2、成年猫、成年猫窒息法处死 取下列组织神经节（颈胸椎处）入神经节（颈胸椎处）入高尔基体固定液高尔基体固定液中固定中固定脊髓（颈胸椎处）入脊髓（颈胸椎处）入2%2%的硝酸银水溶液的硝酸银水溶液中固定中固定卵巢卵巢 入入中性甲醛固定液中性甲醛固定液中固定中固定膈肌膈肌入中性甲醛固定液中性甲醛固定液中固定 每班壹只每班壹只 两组同学完成两组同学完成3、一月龄家兔、一月龄家兔栓塞法栓塞法处死处死 取肋间肌取肋间肌，剪成剪成0.2cm0.2cm0.2cm0.2cm见方的肌肉颗粒（共见方的肌肉颗粒（共剪剪100100颗）。颗）。取剪好的肌肉组织入蚁酸溶液中固定取剪好的肌肉组织入蚁酸溶液中固定15min15min左右，呈半透左右，呈半透明状即可。明状即可。不经水洗，直接放入不经水洗，直接放入1%1%的氯化金水溶液中浸染的氯化金水溶液中浸染15-60min15-60min左左右，肉眼观察见肌肉组织呈金黄色即可，如已成棕色表明浸右，肉眼观察见肌肉组织呈金黄色即可，如已成棕色表明浸染过度，所以应随时观察。染过度，所以应随时观察。将已经还原好的肌肉组织用蒸馏水涤数次，放在滤纸上将将已经还原好的肌肉组织用蒸馏水涤数次，放在滤纸上将组织上的水分沾干，再转入甘油酒精（甘油一份，组织上的水分沾干，再转入甘油酒精（甘油一份，50%50%酒精酒精一份）中保存备用。一份）中保存备用。4、小白鼠、小白鼠 断颈法断颈法处死处死 取小肠，用生理盐水将肠道内清洗干净，取小肠，用生理盐水将肠道内清洗干净，剪成剪成2cm2cm长的小段，长的小段，入入RegaudRegaud固定液固定液中固定中固定 线粒体切片标本的制作线粒体切片标本的制作1 1、取材、取材、取材、取材：小白鼠小肠或肝小白鼠小肠或肝2 2、固定：、固定：、固定：、固定：入入RegaudRegaud固定液固定液固定固定2 2天（每天需更换一次固定液）天（每天需更换一次固定液）3 3、媒染、媒染、媒染、媒染：入：入3%3%重铬酸钾水溶液中媒染重铬酸钾水溶液中媒染7 7天（每两天更换一天（每两天更换一次新液）次新液）4 4、冲洗：、冲洗：、冲洗：、冲洗：先用自来水冲洗先用自来水冲洗2424小时，然后用蒸馏水浸洗数次。小时，然后用蒸馏水浸洗数次。5、脱水透明：脱水透明：在酒精中从低浓度到高浓度依次脱水，100%以下的浓度每次1小时，在100%酒精中2次，每次30分钟，转入二甲苯2次透明，每次30分钟。6、浸蜡包埋：、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1次，软蜡1次，硬蜡1次，每次30分钟，用纸盒或金属包埋盒包埋。（包埋时注意切面方向）7、切片贴片烤片：、切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度2-4微米，在贴片容器中贴片，入37。C恒温箱中烘烤24小时。8、脱蜡入水：脱蜡入水：二甲苯2次，每次10min,100%酒精中2次,每次5min,100%以下的浓度每次2min，下行至蒸馏水。9、媒染媒染：入5%铁明矾水溶液中媒染24小时（37。C恒温箱中）。10、染色：、染色：蒸馏水速洗后入苏木精染液中染色24小时。11、分色：、分色：蒸馏水速洗后入2.5%铁明矾水溶液中分色，数秒后，显微镜下镜检，见细胞核和线粒体呈黑色，细胞质呈无色或灰色即可。此步骤非常关键，一定要不间断此步骤非常关键，一定要不间断镜检。镜检。12、返蓝：、返蓝：自来水浸泡数小时13、脱水透明：脱水透明：与第8步骤（脱蜡入水）相反方向操作即可。14、镜检封固：、镜检封固：镜下检查，染色合格的切片滴1滴中性树胶，盖上盖玻片。放入凉片盒中。高尔基体切片标本的制作高尔基体切片标本的制作1、取材、取材：猫或兔的神经节2、固定：、固定：入高尔基体固定液固定8-18小时3、冲洗：冲洗：用蒸馏水速洗2次。4、镀银：、镀银：入2%硝酸银水溶液中镀银48小时（室温下、避光）5、冲洗：冲洗：用蒸馏水速洗2次6、还原：还原：入硝酸银还原液中24小时7、冲洗：冲洗：用蒸馏水速洗2次8、脱水透明：、脱水透明：在酒精中从低浓度到高浓度依次脱水，100%以下的浓度每次40分钟，在100%酒精中2次，每次20分钟，转入二甲苯2次透明，每次20分钟。9、浸蜡包埋：、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1次，软蜡1次，硬蜡1次，每次20分钟，用纸盒或金属包埋盒包埋。10、切片贴片烤片：切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度3-6微米，在贴片容器中贴片，入37。C恒温箱中烘烤24小时11、脱蜡入水：脱蜡入水：二甲苯2次，每次10min,100%酒精中2次,每次5min,100%以下的浓度每次2min，下行至蒸馏水。12、调色：、调色：入1%氯化金水溶液中2小时常规组织切片制作常规组织切片制作（HE染色）染色）组织切片的染色方法很多，最常用的是HE染色法，该方法适用于人体或动物多种组织，对任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用，所以，HE染色法显微制片技术的基本方法。1、取材、取材：动物多种组织（如：大动脉、大静脉、腹腔AV伴行处、疏松结缔组织、膀胱、鼻腔上皮组织、胃、睾丸、输精管、体皮、脑垂体、大脑皮质、卵巢 等）2、固定：、固定：入中性甲醛固定液中固定24小时3、冲洗：、冲洗：自来水冲洗时间24小时。4、脱水透明：脱水透明：在酒精中从低浓度到高浓度依次脱水，100%以下的浓度每次2小时，在100%酒精中2次，每次1.5小时，转入二甲苯2次透明，每次1.5小时。5、浸蜡包埋：、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1次，软蜡2次，硬蜡2次，以上各级每次1-1.5小时，用纸盒或金属包埋盒包埋。6、切片贴片烤片：切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度6-8微米，在贴片容器中贴片，入37。C恒温箱中烘烤24小时。7、脱蜡入水：、脱蜡入水：二甲苯2次，每次10min,100%酒精中2次,每次5min,100%以下的浓度每次2min，下行至蒸馏水。以下程序按教材材要求进行。注意事项：注意事项：在0.5%的盐酸酒精中分色过程中，数秒后，必须要在显微镜下镜检，见细胞核呈蓝色，细胞质呈无色或灰色即可。此步骤非常关键，一定要不间断镜检。神经元纤维切片的制作神经元纤维切片的制作1、取材、取材：猫或兔的脊髓2、固定：、固定：入2%硝酸银水溶液固定3-6d，避光,35。C恒温箱中。3、冲洗：冲洗：用蒸馏水速洗2次。4、还原还原：室温室温入硝酸银还原液24小时。5、冲洗：冲洗：用蒸馏水速洗2次6、脱水：入100%酒精脱水24小时7、浸蜡包埋：、浸蜡包埋：等量二甲苯与软蜡1次，软蜡2次，硬蜡2次，以上各级每次1-1.5小时，用纸盒或金属包埋盒包埋8、切片贴片烤片：切片贴片烤片：载玻片上涂少许蛋白甘油，切片厚度6-8微米，在贴片容器中贴片，入37。C恒温箱中烘烤24小时。9、脱蜡脱蜡镜检：镜检：二甲苯中脱蜡，镜检封片。
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