食品中志贺氏菌检验

食品中志贺氏菌检验食品中志贺氏菌检验一、实验目的 了解食品安全与志贺氏菌检验关系1 了解志贺氏菌生理形态化学性质2 掌握志贺氏菌检验方法和结果判断3检验食品中是否有志贺氏菌4二.实验原理需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37，最适pH为6.4-7.8。37培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，能分解葡萄糖，产酸不产气。不发酵乳糖，靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。三、实验的试剂和仪器仪器与设备试剂和仪器试剂和仪器培养基与试剂仪器与设备v规格名称数量用途v1、500ml广口瓶1个稀释样品v2、500ml三角瓶1个制增菌液v3、250ml三角瓶4个制培养基v4、18180mm试管制三糖铁培养基v5、13100mm试管 制蛋白胨水等v6、1ml移液管v7、10ml移液管v8、直径为90mm平皿 5副 制SS、EMB平板v9、250ml量筒1个v10、玻璃棒 v11.、恒水浴箱 1个v12、显微镜 1台 镜检培养基与试剂vGN增菌液225ml/瓶1瓶500ml三角瓶vEMB培养基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶vSS琼脂 100ml/瓶 1瓶250ml三角瓶v三糖铁斜面 6ml/支 6支 15150mm试管v葡萄糖半固体培养费基 4ml/支 5支 13100mm试管v蛋白胨水2ml/支5支 13100mm试管v5%乳糖发酵管 3ml/支5支 13100mm试管v甘露醇发酵管 3ml/支5支13100mm试管v棉子糖发酵管 3ml/支 5支 13100mm试管v甘油发酵管3ml/支 5支13100mm试管 四、实验步骤验步骤 实流程图操作步骤流程图流程图 采样 样品处理 选择性增菌 选择性平板划分 生化实验 镜检 结果报告 实验前的准备v对烧杯、玻璃棒、移液管、试管、培养皿、锥形瓶的清洗v注意：洗涤后的仪器应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠v对试管、玻璃棒、移液管、锥形瓶、烧杯、培养皿进行包扎：要将报纸裁成5-10公分，成30卷起，结尾处向上折叠即。包扎灭菌培养基的制备v1.CN 增菌液v成分:胰蛋白胨20g 柠檬酸钠5g 磷酸二氢钾1.5g 葡萄糖1g 去氧胆碱酸钠0.5g 氯化钠5g 甘露醇2g 磷酸氢二钾4g 蒸馏水1000ml ph7.0v制法：按上述成分配好，加热溶解，校正PH。分装每瓶225ml，115 C高温灭菌15minv2、HE琼脂v成分：蛋白胨12g 水杨素2g 蒸馏水1000ml 乙液20ml 牛肉膏3g 胆盐20g 0.4%溴麝香草芬兰钠溶液16ml 乳糖12g 氯化钠5g 蔗糖12g 琼脂20g 甲液20ml HP7.5v制法：将蛋白胨、乳糖、水杨素、氯化钠、蔗糖、牛肉膏、胆盐等溶解于400ml蒸馏水中作为基础液；加琼脂与600ml蒸馏水中，加热溶解。加入甲液乙液与基础液中，校正HP,再加指示剂。并与琼脂液合并，冷却，倾注平板，培养基的制备v3、SS琼脂液的配制v成分：牛肉膏0.6g 琼脂2.04g 三号胆盐0.42g 蒸馏水120ml，月示胨0.6gv制法：将牛肉膏、月示胨和胆盐溶解于400ml蒸馏水中，将琼脂加入600ml蒸v馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合121高压灭菌15min,保存备用。v4、麦慷慨琼脂液的配制v成分：蛋白胨2.04g 脙胨0.36g 猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g 氯化钠0.6g 琼脂2.04g 蒸馏水120mL 乳糖1.2g 0.01%结晶紫水溶液1.2mL 0.5%中性红水溶液0.6mLv制法：将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2，v将琼脂加入于600ML蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于121高压灭菌15min备用。临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至5055时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。培养基的制备v5、伊红美蓝琼脂（EMB）v成分：蛋白胨 10g 2%伊红溶液20ml 乳糖10g 0.65%美兰溶液10ml 磷酸二氢钾28g 蒸馏水1000ml 琼脂17g PH7.1 v制法：将蛋白胨、磷酸盐、琼脂溶解于蒸馏水中，校正ph，分装于烧杯内，121c高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶解琼脂，冷却，加入伊红和美蓝溶液，摇匀。倾注平板。v6、三糖铁琼脂的配制v成分：蛋白胨4.8g 牛肉膏0.6g 乳糖1.2g 蔗糖1.2g 葡萄糖0.12g 氯化钠0.6g 硫酸亚铁胺0.024g 硫代硫酸钠0.024g 琼脂0.72g 酚红0.003g 蒸馏水120mL pH7.4v制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121高压灭菌15min。放置高层斜面备用。培养基的制备v7、生理盐水的配制v成分Nacl0.9g,蒸馏水100mlv制法一般每种检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包扎后于121度高压灭菌15minv8、氯化钠结晶紫增菌液的配制v成分：蛋白胨2.4g 氯化钠4.8g 0.01%结晶紫溶液0.6mL 蒸馏水120mL pH9.0 v制法：胨晶晶紫外，其他按上述成分配好，加热溶解。约加30%氢氧化钾溶液4.5mL，校正pH。加热煮沸，过滤。再加入结晶紫溶液，混合后分装试管。121高压灭菌15min操作步骤v1.灭菌v 干热灭菌：剪刀及棉绳等干热灭菌v 湿热灭菌：均质袋、纱布、各种培养基、生理盐水、增菌液v2.采样 从食堂中取一个鸡蛋v3.样品处理 将鸡蛋打碎放入无菌碗里，然后用杀菌的玻璃棒搅拌，在放入到均质袋中用均质器打匀v4.增菌 称取检样25g，加入装有225mlGN增菌液的500ml的广口瓶内，于（361）培养6-8h操作步骤v5.分离 取增菌液一环，划线接种于SS琼脂平板一个，伊红美蓝琼脂平板一个，于（361）培养18-24小时。志贺菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。v6.生化试验 挑取平板上的可疑菌落，接种三塘铁琼脂和半固体各一管，一般应多挑取几个以防遗漏，志贺菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸，不产气，斜面产碱，不产生硫化氢，无动力，在半固体管内，沿穿刺线生长。v7.镜检 从三塘铁琼脂和半固体各一管中挑取生长出来的菌落，进行革兰氏染色，然后放在显微镜下观察。v8.结果报告 五五 注意事项注意事项1、志贺菌在常温存活期很短。因此，当样品采集后，应尽快进行检验。如果在24h内检验，样品可保存在冰箱内，入欲保存较长时间，必须放在低温冰箱内。2、迄今没有很好的曾菌培养基。目前仍然认为用GN肉汤曾菌检查食品中和粪便中的志贺菌是有效的。注意事项注意事项3、增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺菌的阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于两个。中等选择性的，HE或SS琼脂平板一个；弱选择性的。麦康凯或EMB琼脂平板一个。WS琼脂可作为中等选择性培养基使用，FX琼脂可作为弱选择性培养基使用。4、动力的观察非常重要。挑取可疑菌落，除接种一支三糖铁琼脂外，还要接种一支半固体琼脂。实验结果实验结果实验结果实验结果实验结果志贺菌在培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落志贺菌在三糖铁琼脂中底沉产酸，不产气，斜面产碱，不产生硫化氢 无动力在，在半固体管内沿穿刺线生长。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！20