阿维菌素的液相色谱分析

阿维菌素的液相色谱分析阿维菌素的液相色谱分析1.阿维菌素介绍n n阿维菌素的产生菌阿维菌素的产生菌阿维链霉菌阿维链霉菌(Streptom(Streptom yces avermitilis)yces avermitilis)是是19751975年日本北里研究所从年日本北里研究所从日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的.阿维链阿维链霉菌自发现以来霉菌自发现以来,以日本北里大学和北里研究所以以日本北里大学和北里研究所以及美国及美国MerkMerk公司为主的研究小组分别对它开展了公司为主的研究小组分别对它开展了深入研究深入研究,形成了一个重要的抗生素研究领域形成了一个重要的抗生素研究领域.与与其他链霉菌一样其他链霉菌一样,阿维链霉菌不仅具有复杂的形态阿维链霉菌不仅具有复杂的形态分化分化,也具有合成多种次级代谢产物的能力也具有合成多种次级代谢产物的能力,由它由它产生的阿维菌素在医药、农业及畜牧业上有着重产生的阿维菌素在医药、农业及畜牧业上有着重要的商业价值要的商业价值.目前对阿维链霉菌的研究主要集中目前对阿维链霉菌的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域在阿维菌素的生物合成领域.2.阿维菌素结构n n阿维菌素的天然发酵产物共有阿维菌素的天然发酵产物共有8 8个组分个组分A1a,A21,A2a,A2b,B1a,A1a,A21,A2a,A2b,B1a,B1b,B2aB1b,B2a和和B2b,B2b,它们的区别主要在于它们的区别主要在于C25,C222,23C25,C222,23和和C226C226位所位所连接的基团不同。连接的基团不同。3仪器和试剂n n高效液相色谱仪高效液相色谱仪:具有紫外可变波长检测器具有紫外可变波长检测器;(;(岛津公司岛津公司LC-LC-10A10An n色谱数据处理机色谱数据处理机;(CLASS-10A;(CLASS-10A工作站。工作站。)n n色谱柱色谱柱:150 mm3.9 mm(id):150 mm3.9 mm(id)不锈钢柱不锈钢柱,内装内装Nova-Nova-Pak C18Pak C18、5m5m填充物填充物;(Waters);(Waters)n n过滤器过滤器:滤膜孔径约滤膜孔径约0.45m;0.45m;n n微量进样器微量进样器:50L;:50L;n n定量进样管定量进样管:5L;:5L;n n超声波清洗器超声波清洗器;n n甲醇甲醇:色谱级色谱级;n n水水:新蒸二次蒸馏水新蒸二次蒸馏水;n n乙腈乙腈:色谱级色谱级;n n阿维菌素标样阿维菌素标样:已知阿维菌素已知阿维菌素(B1a+B1b)(B1a+B1b)质量分数质量分数98.0 98.0%。4.色谱操作条件n n流动相:甲醇+乙腈+水=38+38+24,膜过滤,并进行脱气;n n流量:1.0 mL/min;n n柱温:室温(温差变化应不大于2);n n检测波长:245 nm;n n进样体积:5L;n n保留时间:B1a15.6 min,B1b11.3 min。典型阿维菌素乳油高效液相色谱图见图典型阿维菌素乳油高效液相色谱图见图5.溶液的配制n n5.1标样溶液的制备 称取阿维菌素标样0.05 g(精确至0.00 02g),置于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。5.2试样溶液的制备 称取含阿维菌素0.05 g的试样(精确0.0 002 g),置于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。6.测定n n 在上述操作条件下,待仪器稳定后,连续注入数针标样溶液,直至相邻两针阿维菌素峰面积相对变化小于1.5%后,按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。7.计算n n试样中阿维菌素试样中阿维菌素(B1a+B1b)(B1a+B1b)的质量分数的质量分数X X1 1(%)(%)按按式式(1)(1)计算计算n n式中式中:n nA A1 1两针标样溶液两针标样溶液,阿维菌素阿维菌素B1aB1a与与B1bB1b峰面峰面积和的平均值积和的平均值;n nA A2 2两针试样溶液两针试样溶液,阿维菌素阿维菌素B1aB1a与与B1bB1b峰面峰面积和的平均值积和的平均值;n nmm1 1标样的质量标样的质量,g;,g;n nmm2 2试样的质量试样的质量,g;,g;n npp标样中阿维菌素标样中阿维菌素(B1a+B1b)(B1a+B1b)的质量分的质量分数数,%,%。8.结果和讨论n n8.18.1线性关系试验线性关系试验 在一定质量范围内在一定质量范围内,按照浓度递增的顺序配制按照浓度递增的顺序配制数个已知样数个已知样,按上述操作条件进行分析。以阿维菌按上述操作条件进行分析。以阿维菌素标样质量为横坐标素标样质量为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲峰面积为纵坐标绘制标准曲线。此标准曲线通过原点。计算得回归方程为线。此标准曲线通过原点。计算得回归方程为Y=2.52108X+4.69103,Y=2.52108X+4.69103,线性相关系数线性相关系数r r=0.9999=0.9999。试验证明当阿维菌素浓度在。试验证明当阿维菌素浓度在0.004 0.004 g/100 mL0.2 g/100 mLg/100 mL0.2 g/100 mL之间之间(进样体积进样体积5L)5L)与其相应的峰面积呈现良好的线性关系。与其相应的峰面积呈现良好的线性关系。n n8.28.2方法精密度试验方法精密度试验 对阿维菌素原药、乳油按上述操作条件进行对阿维菌素原药、乳油按上述操作条件进行多次重复测定多次重复测定,试验表明该定量方法具有较好的精试验表明该定量方法具有较好的精密度。其标准偏差分别为密度。其标准偏差分别为0.320.32、0.0089,0.0089,变异系变异系数分别为数分别为0.34%0.34%、1.1%1.1%。n n8.38.3方法准确度试验方法准确度试验 称取数个已知含量的阿维菌素原药、阿维菌称取数个已知含量的阿维菌素原药、阿维菌素乳油试样素乳油试样,分别加入一定量的阿维菌素标准品分别加入一定量的阿维菌素标准品,按本方法测定其中阿维菌素总质量并计算回收率。按本方法测定其中阿维菌素总质量并计算回收率。阿维菌素原药、乳油的平均回收率分别为阿维菌素原药、乳油的平均回收率分别为99.9 99.9%、100.4%,100.4%,表明该方法具有良好的准确度。表明该方法具有良好的准确度。8.4最佳操作条件的选择8.4.1检测波长的确定 由阿维菌素的紫外光谱图可以看出,阿维菌素B1a和B1b的最大吸收波长均在245 nm附近,由于流动相在该波长处无吸收且对B1a和B1b峰位置无干扰,故检测波长确定为245 nm。n n8.4.28.4.2流动相的选择流动相的选择 我们首先用单纯的甲醇我们首先用单纯的甲醇+水作流动相水作流动相,结果部结果部分厂家的乳油产品中分厂家的乳油产品中B1aB1a和杂质峰分离不开。因和杂质峰分离不开。因此又改用乙腈此又改用乙腈+水作为流动相水作为流动相,但但B1aB1a和和B1bB1b不能不能与杂质完全分离。最后尝试用乙腈与杂质完全分离。最后尝试用乙腈+甲醇甲醇+水作流水作流动相动相,改变乙腈和甲醇之间的比例改变乙腈和甲醇之间的比例,发现当乙腈与发现当乙腈与甲醇比例小于甲醇比例小于1 1时时,B1a,B1a和杂质不能完全分离。当和杂质不能完全分离。当乙腈与甲醇比例大于乙腈与甲醇比例大于1 1时时,B1b,B1b和杂质不能完全分和杂质不能完全分离离,当乙腈和甲醇比例在当乙腈和甲醇比例在1 1附近时附近时B1aB1a和和B1bB1b均能均能与杂质完全分离与杂质完全分离,因此确定采用甲醇因此确定采用甲醇+乙腈乙腈+水水=38+38+24=38+38+24为最佳流动相配比。在采用不同的为最佳流动相配比。在采用不同的色谱柱分析时发现色谱柱分析时发现:为得到合适的保留值和分离度为得到合适的保留值和分离度可适当的改变体积比为可适当的改变体积比为1 1的乙腈甲醇溶液与水的比的乙腈甲醇溶液与水的比例和例和(或或)流速。流速。谢谢！谢谢！