细胞工程与作物育种

第九部分第九部分 细胞细胞工程与作物育种工程与作物育种基本概念基本概念 作物细胞工程（作物细胞工程（plant cell engineering)是以是以细胞和组织培养细胞和组织培养技术为基础发展起来的一门技术为基础发展起来的一门学科。它以细胞为基本单位，在体外（学科。它以细胞为基本单位，在体外（in vitro）条件下进行培养、繁殖或人为地使细）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿产生某种物胞某些生物学特性按人们的意愿产生某种物质的过程。质的过程。植物细胞细胞工程植物细胞细胞工程动物细胞工程动物细胞工程理论基础：理论基础：细胞的全能性（细胞的全能性（cell totipotency）。）。因为细胞核内有保持物种遗传性所需要的全因为细胞核内有保持物种遗传性所需要的全套遗传物质所以高度分化的体细胞具有发育套遗传物质所以高度分化的体细胞具有发育成一个生物体的能力。成一个生物体的能力。植物组织培养植物体细胞杂交全能性的高低全能性的高低：受精卵受精卵 配子（如卵细胞）配子（如卵细胞）体细胞体细胞 分化程度低的细胞分化程度低的细胞 分化程度高的细胞分化程度高的细胞 植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞第一节第一节 细胞和组织培养技术细胞和组织培养技术组织培养（组织培养（tissue culture，in vitro culture）通常用于所有类型的植物无菌培）通常用于所有类型的植物无菌培养技术养技术。包括：胚胎培养、器官培养、愈伤组织培养、液体培养（悬浮培养）外植体外植体（explant）是指用来进行培养）是指用来进行培养的植物体某一部分组织的统称。选择外植的植物体某一部分组织的统称。选择外植体要考虑：体要考虑：基因型；基因型；植物的合适部位；植物的合适部位；考虑它的合适年龄考虑它的合适年龄 步骤：取外植体、消毒、接种于培养步骤：取外植体、消毒、接种于培养基上、置于一定条件下培养基上、置于一定条件下培养 一、培养基及其组成：一、培养基及其组成：基本培养基基本培养基：MSMS，N N6 6等等 植物生长调节剂植物生长调节剂：生长素、细胞分裂素、：生长素、细胞分裂素、赤霉素等赤霉素等 能量物质能量物质：蔗糖等其他添加物酵母粉、：蔗糖等其他添加物酵母粉、椰子汁、水解乳蛋白、酪蛋白水解物等椰子汁、水解乳蛋白、酪蛋白水解物等 无机盐无机盐和水和水大量元素大量元素C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.ClCl微量元素微量元素Fe.Cu.Mo.Zn.Fe.Cu.Mo.Zn.MnMn.Co.B.Na.Co.B.Na 水水蒸馏水、双蒸水或去离子水蒸馏水、双蒸水或去离子水有机化有机化合物合物 糖糖碳源和能源碳源和能源氨基酸类氨基酸类有机氮源有机氮源维生素类维生素类 维生素维生素b b1 1、维生素、维生素b b6 6、生物素、烟酸、生物素、烟酸、叶酸等叶酸等生长调生长调节物质节物质 生长素生长素IAAIAA、NAANAA、2,4-D2,4-D、IBAIBA细胞分裂素细胞分裂素天然：天然：6-BA6-BA、KTKT；人工：；人工：ZTZT、2-iP2-iP 赤霉素赤霉素 GA GA3 3 3 3成份不成份不定物质定物质 椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥琼脂琼脂 从海藻中提取的一种高分子碳水化合物从海藻中提取的一种高分子碳水化合物培养基的成分MS大量大量(10)800mlMS微量微量(100)400mlKNO3 15.20gCuSO4.5H2O0.001gMgSO4.7H2O 2.96gCoCl2.6H2O0.001gNH4NO3 13.20gNa2MoO4.2H2O0.01gCaCl2.2H2O 3.52gMnSO4.H2O0.676gKH2PO4 1.36gZnSO4.7H2O0.344gH3BO30.248gKI0.0332gMS有机有机(100)200ml改良改良1/2MS 大量大量(10)400mlGlycine0.04gKNO33.80gVB10.008gMgSO4.7H2O0.74gVB60.01gNH4NO33.30g烟酸烟酸0.01gCaCl2.2H2O0.88g肌醇肌醇2.00gKH2PO40.34g二、培养基的配制二、培养基的配制(1)水和药品 水必须采用蒸馏水或去离子水，药品最好采用分析纯，至少是化学纯药品。(2)母液的配置 为方便培养基的制备，现将培养基的各种成份分类配成浓缩的母液，正式配制时按规定用量稀释混合。（3）制备培养基-特别注意PH值（4）培养基的消毒 主要有高温高压灭菌和过滤灭菌两种方法。三、无菌操作方法（一）消毒剂（一）消毒剂消毒剂 使用浓度（%）消除难易 消毒时间（min）消毒效果次氯酸钠 20 易 530 很好次氯酸钙 910 易 530 很好过氧化氢 1012 最易 515 好溴水 12 易 210 很好硝酸银 1 较难 530 好氯化汞氯化汞 0.11 较难较难 215 最好最好抗生素 450mg/L 中 3060 较好 （二）无菌操作 （三）无菌培养第二节第二节 体细胞无性系变异与作物改良体细胞无性系变异与作物改良 一、基本概念 植物体细胞在离体条件下，以及在离体培养之前，会发生各种遗传和不遗传的变异。无性系变异无性系变异（somaclonal variation）：将遗传上的变异称为无性系变异；变异体变异体（variant）：不加任何选择压力而筛选出的变异个体；突变体突变体（mutant）：经过施加某种选择压力所筛选出的无性系变异。二：体细胞变异的遗传基础二：体细胞变异的遗传基础（一）（一）细胞遗传学基础细胞遗传学基础 1.1.外植体细胞先存在的变异外植体细胞先存在的变异 2.2.染色体数量变异染色体数量变异 3.3.染色体结构变异，断裂和重组，相互易位，染色体结构变异，断裂和重组，相互易位，缺失等。缺失等。（二）（二）细胞分裂机制与遗传变异细胞分裂机制与遗传变异 1.1.细胞脱分化后的细胞异常分裂细胞脱分化后的细胞异常分裂 2.2.无丝分裂无丝分裂（三）（三）分子遗传学基础分子遗传学基础 1.1.基因突变基因突变 2.DNA2.DNA碱基修饰碱基修饰 3.3.基因重排基因重排 4.DNA4.DNA总量的变化总量的变化 5.5.转座因子的激活转座因子的激活Comparison of the transgenic plants by particle bombardment with pollen-tube pathway 三三:体细胞无性系变异的广泛性和多样性体细胞无性系变异的广泛性和多样性 四四:体细胞无性系变异的分子检测体细胞无性系变异的分子检测 （一）酶谱分析检测变异（一）酶谱分析检测变异 （二）（二）RFLPRFLP检测变异检测变异 （三）（三）RAPDRAPD检测变异检测变异 （四）其他分子检测（四）其他分子检测 五：细胞和组织培养与作物育种（一）抗性（一）抗性抗病抗除草剂抗寒耐盐耐旱Streptomycin resistance resistant to Liberty herbicidesusceptible to Liberty herbicide （二）、二）、雄性不育突变体雄性不育突变体利用体细胞变利用体细胞变异产生雄性不育系证明是一条可行的途径。异产生雄性不育系证明是一条可行的途径。（三）、各种（三）、各种形态特征形态特征(株高株高)和生物学和生物学特性特性(生育期生育期)突变体突变体体细胞变异在形态特体细胞变异在形态特征和生物特征都有广泛的变异。征和生物特征都有广泛的变异。优良品种细胞培养R0R1群体改良的体细胞克隆遗传稳定性测试育成新品系区域试验审定投入生产田间试验多点田间试验继续田间试验,种子富集互交测试确定遗传方式利用体细胞克隆变异育种的技术路线体细胞无性系变异的不足：体细胞无性系变异的不足：1.1.产生的变异多，变异类型复杂产生的变异多，变异类型复杂2.2.变异的方向难以控制，难以预测变异的方向难以控制，难以预测3.3.筛选出的突变性状有丧失抗性的趋势筛选出的突变性状有丧失抗性的趋势4.4.多次继代后分化能力丧失多次继代后分化能力丧失5.5.无性系变异更适合营养繁殖作物无性系变异更适合营养繁殖作物第三节第三节 原生质体培养和原生质体培养和 体细胞杂交体细胞杂交 原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁的、裸原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。露的、有生活力的原生质团。就单个细胞而言，就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征。除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征。一一.原生质体培养的利用途径原生质体培养的利用途径 通过原生质体培养可以制造单细胞无通过原生质体培养可以制造单细胞无性系。性系。原生质体可以作为基因转化的受体，原生质体可以作为基因转化的受体，使之接受外源遗传物质（如细胞器、染色使之接受外源遗传物质（如细胞器、染色体或体或DNADNA片段等）产生新的变异类型。片段等）产生新的变异类型。利用原生质体进行许多基础性研究，利用原生质体进行许多基础性研究，如细胞生理、基因调控、分化和发育如细胞生理、基因调控、分化和发育等。等。细胞融合即体细胞杂交。细胞融合即体细胞杂交。体细胞杂交体细胞杂交（somatic hybridizatioin）又）又称原生质融合（称原生质融合（protoplast fussion），是），是指两种原生质体间的杂交。指两种原生质体间的杂交。胞质杂种胞质杂种（cytohybrid）：是指体细胞杂）：是指体细胞杂交过程中有意识地去除（或杀死）某一亲交过程中有意识地去除（或杀死）某一亲本的细胞核，得到的将是一个亲本细胞核本的细胞核，得到的将是一个亲本细胞核和两个亲本细胞质的杂种细胞。和两个亲本细胞质的杂种细胞。二二 植物体细胞杂交（原生质体融合）植物体细胞杂交（原生质体融合）体细胞杂交的特点体细胞杂交的特点 最大特点是最大特点是：有可能使有性杂交不亲：有可能使有性杂交不亲和的双亲之间杂交成功，也就是说在体和的双亲之间杂交成功，也就是说在体细胞水平上的杂交，其双亲间的亲和性细胞水平上的杂交，其双亲间的亲和性或相容性似乎有所提高，因而有可能扩或相容性似乎有所提高，因而有可能扩大杂交亲本和植物资源的利用范围。大杂交亲本和植物资源的利用范围。体细胞杂交的环节体细胞杂交的环节 原生质体的分离和培养；原生质体的分离和培养；原生质体间的融合；原生质体间的融合；融合后杂种细胞的选择；融合后杂种细胞的选择；诱导杂种细胞产生愈伤组织和再生植株。诱导杂种细胞产生愈伤组织和再生植株。Isolation of rice protoplasts from green tissue 原原生生质质体体杂杂交交的的过过程程诱导分化诱导分化1）选择合适的实验材料选择合适的实验材料2）酶的类型和处理条件酶的类型和处理条件：果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等1 1、原生质体的分离与培养原生质体的分离与培养3）原生质体计数）原生质体计数0.25M NaNO0.25M NaNO3 3和高和高浓度浓度CaCa2+2+,聚乙二醇聚乙二醇（PEGPEG）加高浓度加高浓度CaCa2+2+和高和高pHpH值，电融值，电融合技术合技术2、原生质体融合、原生质体融合关键是融合剂的选择：关键是融合剂的选择：融合方式融合方式 原生质体融合有两种融合方式即原生质体融合有两种融合方式即对称融对称融合合和和非对称融合非对称融合。这两种融合方式都能产生。这两种融合方式都能产生三种类型的杂种：三种类型的杂种：综合了双亲全部遗传物质综合了双亲全部遗传物质的对称杂种的对称杂种；部分遗传物质发生丢失的非对部分遗传物质发生丢失的非对称杂种称杂种；只具有融合双亲一方核遗传物质的只具有融合双亲一方核遗传物质的胞质杂种胞质杂种。对称融合对称融合即双亲的核质组装在一起的融合。即双亲的核质组装在一起的融合。非对称融合非对称融合指在融合前对一方亲本原生质体指在融合前对一方亲本原生质体施加一定的处理，钝化其细胞质施加一定的处理，钝化其细胞质,再和另一再和另一方原生质体融合，从而得到非对称杂种或胞方原生质体融合，从而得到非对称杂种或胞质杂种。质杂种。3、杂种和胞质杂种的鉴别、杂种和胞质杂种的鉴别A A 花部和营养体的形态观察；花部和营养体的形态观察；B B 细胞学检测细胞学检测C C 生化鉴定生化鉴定4、分子生物学分析、分子生物学分析原生质体培养与作物遗传改良1.1.克服生殖障碍，创新新种质克服生殖障碍，创新新种质 原生质体融合是克服有性杂交不亲原生质体融合是克服有性杂交不亲和、植物多胚特性等生殖障碍的有效手和、植物多胚特性等生殖障碍的有效手段，并且能转移多基因控制的性状。段，并且能转移多基因控制的性状。转移有利性状，改善作物品质转移有利性状，改善作物品质 3 3、转移部分染色体，获得非对称杂种、转移部分染色体，获得非对称杂种 4 4、转移细胞质基因组，得到胞质杂种、转移细胞质基因组，得到胞质杂种 体细胞杂交面临的困难 1、融合特性的高效性融合特性的高效性2、杂种细胞的培养和选择杂种细胞的培养和选择3、杂种的遗传稳定性控制杂种的遗传稳定性控制 1、诱导融合及杂种细胞的各种生理、诱导融合及杂种细胞的各种生理、生化、生化、遗传机理的研究遗传机理的研究2、电融合的程序化控制研究电融合的程序化控制研究3、各种类型原生质体（胞质体、核质体、各种类型原生质体（胞质体、核质体、细胞器）的制备技术研究细胞器）的制备技术研究4、杂种细胞培养技术的程序化研究杂种细胞培养技术的程序化研究体细胞杂交研究的发展趋势体细胞杂交研究的发展趋势第四节第四节 单倍体细胞培养单倍体细胞培养 单倍体细胞培养及育种利用单倍体细胞培养及育种利用 花药培养花药培养(anther culture)是由单个花是由单个花粉粒在合成培养基上经培养获得完整植株粉粒在合成培养基上经培养获得完整植株的技术。也是获得单倍体的一种技术，的技术。也是获得单倍体的一种技术，我国花药培养始于1970年，目前技术不断在完善。通过花药培养育成的品种如：中花中花9 9号号，在北方高产并高抗稻瘟病。浙粳浙粳6666具有早熟、高产、抗白叶枯病等特点。合单合单76-08576-085抗寒，能种植在纬度48N左右的松花江流域。花药培养的特点及在水稻品种改良上的应用花药培养的特点及在水稻品种改良上的应用(1)(1)后代的快速纯合；后代的快速纯合；(2)(2)排除显隐性的干扰，使配子类型在植株排除显隐性的干扰，使配子类型在植株 水平上充分体现，提高水平上充分体现，提高 选择效率；选择效率；(3)(3)结合诱变处理提高诱变效果。结合诱变处理提高诱变效果。(4)(4)推广品种通过花药培养可达到提纯选优推广品种通过花药培养可达到提纯选优 的作用。的作用。(5)(5)利于突变体的筛选，是遗传研究的良利于突变体的筛选，是遗传研究的良 好实验材料体系；好实验材料体系；有待解决的技术问题有待解决的技术问题1 1、受基因型限制受基因型限制2 2、绿苗分化率还不够高、绿苗分化率还不够高3 3、不能短期内成批产生较多的、不能短期内成批产生较多的H H1 1植株，分植株，分 化绿苗时间长。化绿苗时间长。4 4、耗费比较大、耗费比较大思考题思考题1、名词解释、名词解释 细胞的全能性细胞的全能性 原生质体原生质体2、简述题、简述题（1）、）、花药培养在水稻品种改良上的应用及花药培养在水稻品种改良上的应用及 存在的问题存在的问题（2）、体细胞杂交包括哪些环节）、体细胞杂交包括哪些环节（3）、原生质体培养与作物遗传改良的关系）、原生质体培养与作物遗传改良的关系