动物疫病监测的采样技术(修改)

动物疫病监测的采样技术目的与意义 在动物疫病监测中，采样方法、采样部位、采样数量和样品质量直接决定监测结果的准确性和监测结论的科学性。因此，对采样人员采样方法、技术都有特定的要求。采样人员必须是兽医技术人员，而且应熟悉采样器具的使用，掌握正确采样方法。本片旨在为从事采样工作的技术人员如何科学采样提供技术指导。第一节 采样的一般原则与采样方法第二节 采样器械物品的准备第三节 血液样品的采集方法及技术要求第四节 动物活体样品的采集及技术要求第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求第六节 样品的记录、保存、包装和运送第七节 动物采样和运输过程的生物安全第八节 重大动物疫病采样及运输要求第一节 采样的一般原则与采样方法（1）一、采样的一般原则1.凡是血液凝固不良、天然孔流血的病、死动物，应耳尖采血涂片，首先排除炭疽，炭疽病死的动物严禁剖检。2.采样时应从胸腔到腹腔，先采实质脏器尽量做到无菌，避免外源性的污染，最后采腔肠器官等内容物易造成污染的组织、内容物等。3.采取的病料必须有代表性，采取的脏器组织应为病变明显部位。取材时应根据不同疫病或检验目的，采其相应血样、活体组织、脏器、肠内容物、分泌物、排泄物或其他材料。肉眼难以判定病因时，应全面系统采集病料。第一节 采样的一般原则与采样方法（2）4.病料最好在使用治疗药物前采取，用药后会影响病料中病原微生物的检出。死亡动物的内脏病料采取，最迟不超过死后6小时(尤其在夏季)，否则 ，尸体腐败，难以采到合格的病料。5.血液样品在采集前一般禁食8小时。采集血样时，应根据采样对象、检验目的及所需血量确定采血方法与采血部位。6.采样时应考虑动物福利和环境的影响，防止污染环境和疫病传播，做好环境消毒和废弃物的处理，同时做好个人防护，预防人畜共患病感染。第一节 采样的一般原则与采样方法（3）二、采样的种类和时间采样前，必须考虑采样目的，根据检验项目和要求的不同，选择适当的样本和采样时机是十分重要。应严格按规定时间采样。合理采集样本。第一节 采样的一般原则与采样方法（4）1.当疫病诊断时，采集病死动物的有病变的脏器组织、血清和抗凝血。采集样品的大小及量要满足诊断的需要，以及必要的复检和留样备份。1)一般情况下，对于采集的常规病料，有临诊症状需要做病原分离的，样品必须在病初的发热期或症状典型时采样，病死的动物，应立即采样。第一节 采样的一般原则与采样方法（5）2)采集血液样品，如果是用于病毒检验样品，在动物发病初体温升高期间采集；对于没有症状的带毒动物，一般在进入隔离场后7天以前采样；用于免疫动物血清学诊断时，需采集双份血清监测比较抗体效价变化的，第一份血清采于发病初期并作冻结保存，第二份血清采于第一份血清后34周，双份血清同时送实验室；第一节 采样的一般原则与采样方法（6）3)用于寄生虫检验样品，因不同的血液寄生虫在血液中出现的时机及部位各不相同，因此，需要根据各种血液寄生虫的特点，取相应时机及部位的血制成血涂片和抗凝血，送实验室。第一节 采样的一般原则与采样方法（7）2.进行免疫效果监测时，动物免疫后14-20天，随机采集同群动物血清样品30份。3.进行疫情监测或流行病学调查时，根据区域内养殖场户数量和分布，按一定比例随机抽取养殖场户名单，然后每个养殖场户按估算的感染率，计算采样数量，随机采取。第一节 采样的一般原则与采样方法（8）三、采样数量1.诊断时15只(头)病死动物的有病变的器官组织、血清和抗凝血各10份。2.免疫效果监测时 每群血清样品应采集30份。3.疫情监测或流行病学调查时采集血清、各种拭子、体液、粪尿或皮毛样品等，采样数量可根据动物年龄、季节、周边疫情情况估算其感染率，然后计算应采样品数量。第一节 采样的一般原则与采样方法（9）4.当种群疫病监测净化时，要制定疫病监测净化方案，按照方案确定的采样次数和采样日期，逐头采样。第二节 采样器械物品的准备（1）一、器 械1.采样箱、保温箱或保温瓶、解剖刀、剪刀、镊子、酒精灯、酒精棉、碘酒棉、注射器及针头等。2.样品容器包括小瓶、平皿、离心管及易封口样品袋、塑料包装袋等。3.试管架、玻片、铝盒、瓶塞、无菌棉拭子、胶布、封口膜、封条、冰袋等。注意：采样刀剪等器具和样品容器须无菌。第二节 采样器械物品的准备（2）二、采样记录用品 不干胶标签、签字笔、记号笔、采样单、采样登记表、畜禽标识阅读器等。三、保存液阿氏液(A1severs)、30甘油盐水缓冲液、肉汤、PBS液、双抗。以上溶液配制详见附录A。四、人员防护用具 口罩、防护镜、一次性手套、乳胶手套、防护服、防护帽、胶靴等。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（1）采集动物血液是采样的一项重要内容，对疫病监测意义重大。采血过程中应严格保持无菌操作。采血前，应用酒精棉对采血部位消毒。采血完毕，局部消毒并用干棉球按压止血。采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥无菌。在采血、分离血清过程中，应避免溶血。几种常用的动物主要采血方法介绍如下。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（2）一、禽的采血方法 1.雏鸡心脏采血 左手抓鸡，术者手持采血针，平行颈椎从胸腔前口插入回抽见有回血时，即把针芯向外拉使血液流入采血针。2.成年禽心脏采血 成年禽只采血可取侧卧或仰卧保定。(1)侧卧保定采血 助手抓住禽两翅及两腿，右侧卧保定，在触及心搏动明显处，或胸骨脊前端至背部下凹处连线的12处消毒，垂直或稍向前方刺人23厘米，回抽见有回血时，即把针芯向外拉使血液流入采血针。(2)仰卧保定采血 胸骨朝上，用手指压离嗉囊，露出胸前口，用装有长针头的注射器，将针头沿其锁骨俯角刺入，顺着体中线方向水平穿行，直到刺入心脏。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（3）3.翅静脉采血 在翅下静脉处消毒，手持采血针，从无血管处向翅静脉丛刺入，见有血液回流，即把针芯向外拉使血液流入采血针。也可保定禽只，使翅膀展开，露出腋窝部，用消毒棉消毒。拇指压近心端，待血管怒张后，用装有细针头的注射器，由翼根向翅方向平行刺入静脉，方向反了？放松对近心端的按压，缓慢抽取血液。采血完毕用棉球按压止血。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（4）二、猪的采血方法 1.耳缘静脉采血站立保定，助手用力在耳根捏压静脉的近心端，手指轻弹后，用酒精棉球反复涂擦耳静脉使血管怒张。沿血管刺入，见有血液回流，缓慢抽取所需量血液或接入真空采血管。用棉球按压止血。2.前腔静脉采血(1)站立保定，保定器保定让猪头仰起，露出右腋窝，从右侧向心脏方向刺人，回抽见有回血时，即把针芯向外拉使血液流入采血针。(2)仰卧保定，把前肢向后方拉直。如何操作？是否向上向外一般用装有20号针头的注射器采血，其穿刺部位在胸骨端与耳基部连线上胸骨端旁2厘米的凹陷处，向后内方与地面呈60度角刺入23厘米，当进入约2厘米时可一边刺入一边回抽针管内芯；刺入血管时即可见血进入针管内，采血完毕，局部消毒。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（5）三、牛、羊的采血方法 1.牛、羊颈静脉采血 将动物保定，稍抬头颈，于颈静脉沟上13与中13交界部剪毛消毒，一手拇指按压采血部位下方颈静脉沟血管，促使颈静脉怒张，另一手执针头，与皮肤呈45度角，由下向上方刺入，血液顺器壁流入容器内，防止气泡产生。待血量达到要求后，拔下针头，用消毒棉球按压针眼，轻按止血。2.牛尾静脉采血：固定动物，使牛尾往上翘，手离尾根部约30厘米。在离尾根10厘米左右中点凹陷处，先用酒精棉球消毒，然后将采血针针头垂直刺人(约1厘米深)。针头触及尾骨后再退出1毫米进行抽血。采血结束，消毒并按压止血。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（6）3.乳房静脉采血：奶牛、奶山羊可选乳房静脉采血，奶牛腹部可看到明显隆起的乳房静脉，消毒后在静脉隆起处，针头向后肢方向快速刺入，见有血液回流，接人真空采血管。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（7）四、其他动物血液采集 1.家兔和豚鼠采血，心脏部位约在胸前由下向上数第三与第四肋骨间，用手触摸心脏搏动最强部位，剪毛消毒，将注射器针头由此部位垂直刺入心脏，家兔略有颤动，表明针头已穿入心脏，然后轻轻地抽取，如有回血，表明已插入心腔内，即可抽血；如无回血，可将针头退回一些，重新插入心腔内，若有回血，按压心脏，缓慢抽取所需血量。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（8）2.小鼠采血，可以先麻醉，一般取其仰卧姿势，在其锁骨与剑突连线的中点沿胸骨左边缘进针5毫米左右，边刺人边抽吸，即可采血。也可进行尾静脉采血，固定动物并露出鼠尾。将尾部浸在45左右的温水中数分钟，使尾部血管充盈。再将尾擦干，用锐器(刀或剪刀)割去尾尖o3o5厘米，让血液自由滴人盛器或用血红蛋白吸管吸取，。采血结束，伤口消毒并按压止血。小鼠通常采用眼球摘除法采血。若需反复采血可采用毛细血管眼内眦采血法或断尾采血法。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（9）五、血液样品的制备常规血液制备可分为两类，即抗凝血和非抗凝血。1抗凝血常用作细菌或病毒检验样品 采血前，预先在真空采血管或其他容器内按每10毫升血液加入0.1肝素1毫升或EDTA 20毫克。采集的血液立即与抗凝剂充分混合，防止凝固，但要轻轻混匀以免溶血。也可将血液放入装有玻璃珠的灭菌瓶内，振荡脱纤维蛋白。采集的血液经密封后贴上标签，立即冷藏送实验室。必要时，可在血液中按每毫升加入青霉素和链霉素各5001000国际单位，以抑制血源性或采血过程中污染细菌。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（10）2非抗凝血 即不加抗凝剂的血液，等血液凝固后析出血清一般用作血清学监测试验。血清分离方法：血液在室温下倾斜放置24小时(防止暴晒)，待血液凝固自然析出血清，或用无菌剥离针剥离血凝块，将试管放在装有2537温水的杯内或37温箱内1小时，待大部分血清析出后取出血清，必要时经1 5002000转分离心5分钟，分离血清。将血清移到另外的小塑料离心管中，盖紧盖子，封口，贴标签，4冷藏。须长期保存时，将血清置于一20冷冻。第三节 血液样品的采集方法及技术要求（11）3血片 采取末梢血液、静脉血或心血。取一滴血液样品，滴在已消毒的载玻片上，另取一片载玻片作推片，将推片自血滴左侧向右移动，当血滴均匀地附着在两片之间后再将推片向左平稳地推移(两片成3045度夹角)，推出均匀的血膜，火焰固定后置于载玻片盒或载玻片架中。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（1）一、家禽活体的样品采集 1.家禽咽喉拭子和泄殖腔拭子采集方法 取无菌棉签，插入鸡喉头内或泄殖腔转动3圈，取出，插入离心管中(事先加入1毫升含青霉素、链霉素各3000国际单位pH为72的PBS)，剪去露出部分，盖紧瓶盖，做好标记。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（2）2.羽毛采集方法 拔取受检鸡含羽髓丰满的翅羽或身上其他部位大羽，将含有羽髓的羽根部分按编号分别剪下收集于小试管内，于每管内滴加蒸馏水23滴(羽髓丰满时也可不加)，用玻璃棒将羽根挤压于试管底，使羽髓浸出液流至管口，用滴管将其吸出。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（3）二、猪活体的样品采集 1.扁桃体采取方法 从活体采取扁桃体样品时，应使用专用扁桃体采集器：先用开口器开口，可以看到突起的扁桃体，把采样钩放在扁桃体上，快速扣动扳机取出扁桃体放离心管中，冷藏送检。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（4）2.腔拭子、咽拭子采集方法 应用灭菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉的分泌物，蘸取分泌物后，立即将拭子浸入保存液中，密封低温保存。常用的保存液有含抗生素的PBS保存液(pH7.4)、灭菌肉汤(pH7.27.4)或30甘油盐水缓冲液。若准备将待检标本接种组织培养，则应保存于含0.5乳蛋白水解液中。一般每支拭子需保存液1毫升。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（5）3.肛拭子采集方法 用灭菌棉拭子插入肛门或泄殖腔内采集其内容物和分泌物后，立即将拭子浸入保存液中，密封低温保存。一般每支拭子需保存液1毫升。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（6）三、牛、羊活体的样品采集 1牛、羊O一P液(咽食道分泌物)的采集方法 被检动物在采样前禁食(可饮少量水)12小时，以免胃内容物反流污染OP液。采样探杯在使用前经装有0.2柠檬酸或12氢氧化钠溶液的塑料桶中浸泡5分钟，再用与动物体温一致的清水冲洗探杯后使用，每采完一头动物，探杯要重复进行消毒并充分清洗。采样时动物应站立保定，将探杯随吞咽动作送人食道上部1015厘米处，轻轻来回抽动23次，然后将探杯拉出。取出810毫升OP液，倒入含有等量细胞培养液(0.5水解乳蛋白一Earle液)或磷酸缓冲液(0.04摩升、pH7.4)的灭菌广口瓶中，充分摇匀加盖封口，放冷藏箱及时送检，未能及时送检应置于一30冷冻保存。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（7）2胃液及瘤胃内容物采集(1)胃液采集对于大动物，胃液可用多孔胃管抽取。将胃管送入胃内，其外露端接在吸引器的负压瓶上，加负压后，胃液即可自动流出。如是鼠类，需手术剖腹，从幽门端向胃内插入一塑料管，再由口腔经食道将一塑料管插入前胃，用35pH7.5左右的生理盐水，以12毫升小时的流速灌胃，收集流出液，进行分析。(2)瘤胃内容物采集对活体动物，可以在反刍动物反刍时，当食团从食道逆入口腔时，立即开口拉住舌头，另一只手深人口腔即可取出少量的瘤胃内容物。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（8）四、粪便样品的采集 1.用于病毒检验样品 分离病毒的粪便必须新鲜。少量采集时，以灭菌的棉拭子从直肠深处或泄殖腔黏膜上蘸取粪便，并立即投入灭菌的试管内密封，或在试管内加入少量pH74的保护液再密封。须采集较多量的粪便时，可将动物肛门周围消毒后，用器械或用戴上胶手套的手伸入直肠内取粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻用力下压，刺激排粪，收集粪便。所收集的粪便装入灭菌的容器内，经密封并贴上标签，立即冷藏或冷冻送实验室。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（9）2.用于细菌检验的粪便样品采集 做细菌检验的粪便，最好是在动物使用抗菌药物之前，从直肠或泄殖腔内采集新鲜粪便。采样方法与供病毒检验的方法相同。粪便样品较少时，可投入无菌缓冲盐水或肉汤试管内；较多量的粪便则可装入灭菌容器内，贴上标签后冷藏送实验室。3.用于寄生虫检验的粪便样品采集 粪便样品应选自新排出的粪便或直接从直肠内采得，以保持虫体或虫体节片及虫卵的固有形态，一般寄生虫检验所用粪便量较多，需采取519克新鲜粪便，大家畜一般不少于60克，并应从粪便的内外各层采取。粪便样品以冷藏不冻结状态保存。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（10）五、生殖道样品采集 生殖道样品主要包括动物流产排出的胎儿、死胎、胎盘、阴道分泌物、阴道冲洗液、阴茎包皮冲洗液、精液、受精卵等。生殖道样品采集方法：1.流产胎儿及胎盘 可按采集组织样品的方法，无菌采集有病变组织。也可按检验目的采集血液或其他组织。或将流产后的整个胎儿，用塑料薄膜、油布或数层不透水的油纸包紧，装入冷藏箱，放入冰袋，即送实验室。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（11）2.精液 用人工方法采集，并避免加入防腐剂。3.阴道、阴茎包皮分泌物 可用棉拭子从深部取样，采取后立即放人盛有灭菌肉汤等保存液的试管内，冷藏送检。亦可将阴茎包皮外周、阴户周围消毒后，以灭菌缓冲液或汉克氏液冲洗阴道、阴茎包皮，收集冲洗液。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（12）六、皮肤样品采集 活动物的病变皮肤如有新鲜的水疱皮、结节、痂皮等可直接剪取35克；活动物的寄生虫病如疥螨、痒螨等，在患病皮肤与健康皮肤交界处，用凸刃小刀，刀刃与皮肤表面垂直，刮取皮屑，直到皮肤轻度出血，接取皮屑供检验。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（13）七、脓 汁 做病原菌检验的，应在未进行药物治疗前采取。采集已破口脓灶脓汁，宜用棉拭子蘸取；未破口脓灶，用注射器抽取脓汁。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（14）八、尿液样品动物排尿时，用洁净容器直接接取。也可使用塑料袋，固定在雌畜外阴部或雄畜的阴茎下接取尿液。采取尿液，宜早晨进行。也可以用导管导尿或膀胱穿刺采集。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（15）九、关节及胸腹腔积液的采集 1皮下水肿液和关节囊(腔)渗出液用注射器从积液处抽取。2胸腔渗出液在牛右侧第五肋间或左侧第六肋间用注射器刺入抽取，马在右侧第六肋间或左侧第七肋间刺人抽取。3腹腔积液采集牛腹腔积液，在最后肋骨的后缘右侧腹壁作垂 线，再由膝盖骨向前引一水平线，两线交点至膝盖骨的点为穿刺部位，用注射器抽取；马的腹腔积液穿刺抽取部位只能在马左腹侧。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（16）十、乳 汁 乳房先用消毒药水洗净(取乳者的手亦应事先消毒)，、并把乳房附近的毛刷湿，最初所挤的34把乳汁弃去，然后再采集10毫升左右乳汁于灭菌试管中。进行血清学检验的乳汁不应冻结、加热或强烈震动。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（17）十一、脊髓液采集方法 使用特制的专用穿刺针，或用长的封闭针头(将针头稍磨钝，并配以合适的针芯)；采样前，术部及用具均按常规消毒。1.颈椎穿刺法穿刺点为环枢孔。动物应站立或横卧保定，使其头部向前下方屈曲，术部经剪毛消毒，穿刺针与皮肤面呈垂直，缓慢刺入。将针体刺人蛛网膜下腔，立即拔出针芯，脑脊髓液自动流出或点滴状流出，盛入消毒容器内。大型动物颈部穿刺一次采集量3570毫升。第四节 动物活体样品的采集及技术要求（18）2.腰椎穿刺法穿刺部位为腰荐孔。动物应站立保定，术部剪毛消毒后，用专用的穿刺针刺人，当刺人蛛网膜下腔时，即有脑脊髓液滴状滴出或用消毒注射器抽取，盛人消毒容器内。大型动物腰椎穿刺一次采集量1530毫升。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（1）采取病料时，应根据临床症状或对大体剖检的初步诊断，有选择地采取剖检病变典型的脏器组织和内容物。如肉眼难以判定时，可全面采取病料。采样原则：病变的脏器组织，要采集病变和健康组织交界处，先采实质脏器，如心、肝、脾、肺、肾，后采集腔肠等脏器组织，如胃、肠、膀胱等。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（2）一、小家畜或家禽活体或尸体的采取 将病死畜禽或将病畜禽致死后，装入密封塑料袋内，装入有冰袋的冷藏箱内，及时送往实验室。二、实质脏器的采取 先采集小的实质脏器如脾、肾、淋巴结，小的实质器官可以完整的采取。大的实质脏器如心、肝、肺等，采集有病变的部分，要采集病变和健康组织交界处。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（3）1.做病理组织学检验的组织样品 必须保持新鲜，样品应包括病灶及临近正常组织的交界部位。若同一组织有不同的病变，应分别各取一块。切取组织样品的刀具应十分锋利，取材后立即放入10倍于组织块的10的福尔马林溶液中固定。组织块厚度不超过0.5cm，切成12cm2(检查狂犬病则需要较大的组织块)。组织块切忌挤压、刮摸和水洗。如作冷冻切片用，则将组织块放在04容器中，尽快送实验室检验。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（4）2.用于病原分离的组织样品的采集 用于微生物学检验的病料应新鲜，尽可能减少污染。(1)用于细菌分离样品的采集，首先以烧红的刀片烧烙组织表面，在烧烙部位刺一孔，用灭菌后的铂金耳伸入孔内，取少量组织作涂片镜检或划线接种于适宜的培养基上。如遇尸体已经腐败，某些疫病的致病菌仍可采集于长骨、肋骨，从骨髓中分离细菌。采集所有组织应分别放入灭菌容器内或灭菌塑料袋内，贴上标签，立即冷藏运送到实验室。必要时也可以作暂时冻结处理，但冻结时间不宜过长。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（5）(2)用于病毒检验样品采集制备方法做病毒检验时，必须用无菌技术采集，可用一套已消毒的器械切取所需脏器组织块，每取一个组织块，应用火焰消毒剪镊等取样器械，组织块应分别放入灭菌容器内并立即密封，贴上标签，注明日期、组织或动物名称，注意防止组织间相互污染。将采取的样品放入冷藏容器立即送实验室。如果运送时间较长，可作冻结状态，也可以将组织块浸泡在pH7.4乳汉氏液或磷酸缓冲肉汤保护液内，并按每毫升保护液加入青霉素、链霉素各1 000国际单位，然后放入冷藏瓶内送实验室。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（6）三、畜禽肠管及肠内容物样品采集与制备方法 肠管的采集：用线扎紧病变明显处(约510厘米)的两端，自扎线外侧剪断，把该段肠管置于灭菌容器中，冷藏送检。肠管内容物的采集：选择肠道病变明显部位，取内容物，用灭菌生理盐水轻轻冲洗；也可烧烙肠壁表面，用吸管扎穿肠壁，从肠腔内吸取内容物，将肠内容物放人盛有灭菌的30甘油盐水缓冲保存液中送检。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（7）四、眼睛样品采集眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，放在灭菌的30甘油盐水缓冲保存液，也可采取病变组织碎屑，置载玻片上，供显微镜检查。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（8）五、皮肤样品采集 1.皮肤采集 采集扑杀或死后的动物皮肤样品，用灭菌器械取病变部位及与之交界的小部分健康皮肤(大约10厘米10厘米)，保存于30的甘油缓冲液中，或10饱和盐水溶液中；活动物的病变皮肤如有新鲜的水疱皮、结节、痂皮等可直接剪取35克；活动物的寄生虫病如疥螨、痒螨等，在患病皮肤与健康皮肤交界处，用凸刃小刀，刀刃与皮肤表面垂直，刮取皮屑、直到皮肤轻度出血，接取皮屑供检验。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（9）2.动物皮肤样品制备方法 病原检验样品的制备方法：剪取的供病原学检验的皮肤样品应放入灭菌容器内，加适量pH74的50甘油磷酸盐缓冲液(A4)，可加适量抗生素，加盖密封后，尽快冷冻保存。组织学检验样品制备方法：剪取的作组织学检验的皮肤样品应立即投入固定液内固定保存。寄生虫检验样品制备方法：供寄生虫检验的皮肤样品可放入有盖容器内。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（10）六、骨样品采集 需要完整的骨标本时，应将附着的肌肉和韧带等全部剔除，表面撒上食盐，然后包入浸过5石炭酸溶液的纱布中，装人不漏水的容器内保存。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（11）七、脑采集 全脑做病毒检查，可将脑浸人30甘油盐水液中或将整个头部割下，泡入浸过消毒液的纱布中，置于不漏水的容器内保存。牛、羊海绵状脑病采样的组织，采样时先打开颅骨，取脑干延髓的脑闩区域，需冰冻保存(一70，无条件则一20保存)；其余大脑、小脑、脑干组织采集后立即置于10福尔马林中，越快越好。尽量取全脑组织，包括大脑、小脑和脑干。注意脑组织需在动物死亡后尽快采集。或在枕骨大孔处用剪刀剪开脑硬膜，目的是便于插入采样勺。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（12）然后用一个手指伸入枕骨大孔中，沿着延脑(延髓)转一周，目的是切断延脑与头骨之间相连的神经和血管，以便于脑组织顺利挖出。从延脑腹侧(也即勺子从枕骨大孔的上面进入)将采样勺插入枕骨大孔中，插入时采样勺要紧贴枕骨大孔的腔壁，以免损坏延脑组织。采样勺插入的深度约为57厘米(采羊脑时插入深度约为4厘米)，然后向上一扳勺子手柄，同时往外抠出脑组织和勺子，延脑便可完整取出。注意：尽量保护好延脑“三叉口”处(脑闩部)组织的完整性。第五节 病死畜禽的解剖与病变组织脏器的采集及技术要求（12）作狂犬病的尼格里氏体检查的脑组织，取样应较大，一部分供在载玻片上作触片用，另一部分供固定，用Zenker氏固定液固定(重铬酸钾36克、氯化高汞54克、氯化钠60克、冰醋酸50毫升、蒸馏水950毫升)。作其他包涵体检查的组织用氯化高汞甲醛固定液(氯化高汞饱和水溶9份、甲醛溶液1份)。为监测环境卫生或调查疫病，从遗弃物、通风管、下水道、孵化厂或屠宰场采集自然样品。将固体平面培养基暴露静置于空气中，采集空气中的微生物。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（1）一、采样记录 采样同时，填写采样单，包括场名、畜种、日龄、联系人、电话、规模、采样数量、样品名称、编号、免疫情况、临床表现等(结合疫情监测上报系统填写)。采样单应用钢笔或签字笔逐项填写(一式三份)，样品标签和封条应用签字笔填写，保温容器外封条应用钢笔或签字笔填写，小塑料离心管上可用记号笔做标记。应将采样单和病史资料装在塑料包装袋中，并随样品送实验室。样品信息至少应包括以下内容：第六节 样品的记录、保存、包装和运送（1）1.畜主姓名和畜禽场地址；2.畜禽(农)场里饲养动物品种及数量；3.被感染动物或易感动物种类及数量；4.首发病例和继发病例的日期；5.感染动物在畜禽群中的分布情况；6.死亡动物数、出现临床症状的动物数量及年龄；7.临床症状及其持续时间，包括口腔、眼睛和腿部情况，产奶或产蛋记录，死亡情况和时间，免疫和用药情况等；8.饲养类型和标准，包括饲料；9.送检样品清单和说明，包括病料种类、保存方法等；10.动物治疗史；11.要求做何种试验或监测；12.送检者的姓名、地址、邮编和电话；13.送检日期；14.采样人和被采样单位签章。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（3）二、样品包装要求 装载样品的容器可选择玻璃的或塑料的，可以是瓶式、试管式或袋式。容器必须完整无损，密封不漏出液体。装供病原学检验样品的容器，用前彻底清洁干净，必要时经清洁液浸泡，冲洗干净后以干热或高压灭菌并烘干。如选用塑料容器，能耐高压的经高压灭菌，不能耐高压的经环氧乙烷熏蒸消毒或紫外线距离20厘米直射2小时灭菌后使用。根据检验样品性状及检验目的选择不同的容器，一个容器装量不可过多，尤其液态样品不可超过容量的80，以防冻结时容器破裂。装入样品后必须加盖，然后用胶布或封箱胶带固封，如是液态样品，在胶布或封箱胶带外还须用熔化的石蜡加封，以防止外泄。如果选用塑料袋，则应用两层袋，分别用线结扎袋口，防止液体漏出或入水污染样品。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（4）每个样品应单独包装，在样品袋或平皿外粘贴标签，标签应注明样品名、样品编号、采样日期等。装拭子样品的小塑料离心管应放在特定塑料盒内。血清样品装于小瓶时应用铝盒盛放，盒内加填塞物避免小瓶晃动，若装于小塑料离心管中，则应置于塑料盒内。包装袋、塑料盒及铝盒应贴封条，封条上应有采样人签章，并注明贴封日期，标注放置方向。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（5）三、样品的保存 病料正确的保存方法，是病料保持新鲜或接近新鲜状态的根本保证，是保证监测结果准确无误的重要条件。(一)血清学检验材料的保存 一般情况下，病料采取后应尽快送检，如远距离送检，可在血清中加入青霉素、链霉素防腐败。除了做细胞培养和试验用的血清外，其他血清还可加008叠氮钠、05石炭酸生理盐水等防腐剂。最好不加另外，还应避免使样品接触高温和阳光，同时严防容器破损。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（6）(二)微生物检验材料的保存 1.液体病料黏液、渗出物、胆汁、血液等，最好收集在灭菌的小试管或青霉素瓶中，密封后用纸或棉花包裹，装入较大的容器中，再装瓶(或盒)送检。用棉拭蘸取的鼻液、脓汁、粪便等病料，应将每支棉拭剪断或烧断，投入灭菌试管内，立即密封管口，包装送检。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（7）2.实质脏器 在短时间内(夏季不超过20小时，冬季不超过2天)能送到检验单位的，可将病料的容器放在装有冰块的保温瓶内送检。短时间不能送到的，供细菌检查的，放于灭菌流动石蜡或灭菌的30甘油生理盐水中保存；供病毒检查的，放于灭菌的50甘油生理盐水中保存。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（8）(三)病理组织检验材料的保存 采取的病料通常使用10福尔马林固定保存。冬季为防止冰冻可用90酒精，不可以固定液用量要以浸没固定材料为适宜。如用10福尔马林溶液固定组织时，经24小时应重新换液一次。神经系统组织(脑、脊髓)需固定于10中性福尔马林溶液中，其配制方法是在福尔马林液的总容积中加510碳酸镁用PBS配制即可。在寒冷季节，为了避免病料冻结，在运送前，可将预先用福尔马林固定过的病料置于含有3050甘油的10福尔马林溶液中。不会吧，采取保温措施即可。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（9）(四)毒物中毒检验材料的保存 检样采取后，内脏、肌肉、血液可合装一清洁容器内，胃内容物与呕吐物合装一容器内，粪、尿、水、饲料等应分别装瓶，瓶上要贴有标签，注明病料名称及保存方法等。然后严密包装，在短时间内应尽快送实验室检验或派专人送指定单位检验。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（10）四、样品的运送 所采集的样品以最快最直接的途径送往实验室。如果样品能在采集后24小时内送抵实验室，则可放在4左右的容器中运送。只有在24小时内不能将样品送往实验室并不致影响检验结果的情况下，才可把样品冷冻，并以此状态运送。根据试验需要决定送往实验室的样品是否放在保存液中运送。要避免样品泄漏。装在试管或广口瓶中的病料密封后装在冰瓶中运送，防止试管和容器倾倒。如需寄送，则用带螺口的瓶子装样品，并用胶带或石蜡封口。将装样品的并有识别标志的瓶子放到更大的具有坚实外壳的容器内，并垫上足够的缓冲材料。空运时，将其放到飞机的加压舱内。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（11）制成的涂片、触片、玻片上注名号码，并另附说明。玻片固定后用硫酸纸隔离包装后用绳固定，再用纸包好，或放在玻片盒内在保证不被压碎的条件下运送。所有样品都要贴上详细标签。各种样品送实验室后，应按有关规定冷藏或冷冻保存。须长期保存的样品应置超低温冷冻(,2-70。C或以下为宜)保存，避免反复冻融。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（12）附录A 待检样品保存液的配制 A.1 阿氏液(Alsevers)葡萄糖 2.05克 柠檬酸钠(Na3C6H507.2H20)0.80克 柠檬酸 O.055克 氯化钠 O.42克 加蒸馏水至100毫升，溶解后调ph 7.61后分装，70千帕15分钟灭菌，冷却后4冰箱中保存备用。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（13）A.2 30甘油盐水缓冲液 甘油 30毫升 氯化钠(NaCl)42克 磷酸二氢钾(KH2P04)1.O克 磷酸氢二钾(K2HP04)3.1克 0.02酚红 1.5毫升蒸馏水(或无离子水)加lOO毫升，加热溶化，校正pH为7.6，100千帕15分钟灭菌，冷却后4C冰箱中保存备用。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（14）A.3 肉汤 牛肉膏 3.5克 蛋白胨 10克 氯化钠 5克 充分混合后，加热溶解，校正pH为7.27.4，用流通蒸汽加热 30分钟，滤纸过滤，分装于试管或烧瓶中，以100千帕20分钟灭菌，冷却后4冰箱中保存备用。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（15）A.4 pH7.4的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)氯化钠(NaCl)8.0克 磷酸二氢钾(KHzP04)0.2克 磷酸氢二钠(NaHPO4.12H20)2.9克 氯化钾(KCl)0.2克 将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水溶解后，再定容至1 000毫升，调pH至7.4，高压消毒灭菌112千帕20分钟，冷却后，保存于4冰箱中备用。第六节 样品的记录、保存、包装和运送（16）A.5 棉拭子用抗生素PBS(病毒保存液)取上述PBS液，按要求加入下列抗生素：喉气管拭子用PBS液中 加入青霉素(2 000国际单位毫升)、链霉素(2毫克毫升)、丁胺卡那霉素(1 000国际单位毫升)、制霉菌素(1 000国际单位毫升)。粪便和泄殖腔拭子所用PBS中抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后应调pH至74。采样前分装小塑料离心管，每管中加PBS1.0毫升，采粪便时在青霉素瓶中加PBS 0.115毫升，采样前冷冻保存。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（1）做好兽医生物安全的目的意义：兽医生物安全有二方面的含义。一是减少或消除兽医工作人员受到感染和污染的可能性，在采样、检测过程中，接触的动物或样品有可能带有人畜共患病原，如牛羊布鲁氏菌、狂犬病病毒等，时刻威胁着工作人员的健康。如果没有个人防护知识、必要的防护措施和良好的操作技术规范，很可能造成人员的感染。二是采样、检测过程中的废弃物处理、无害化处理等，保护环境安全，否则都可能引起散毒。因此，必须高度重视动物采样过程的生物安全工作。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（2）一、采样生物安全隐患与措施在兽医科研和诊断检测工作中，动物试验和样品采集是不可缺少的必须进行的工作。（一）采样生物安全隐患1活体采样时动物的自身活动可能产生新的危害，如抓咬伤工作人员。2工作人员操作不小心或正在使用的器材设备等引起，如刀片割破、针头刺伤等。3动物中也可能有隐性感染病，可污染环境，工作人员和其他有关人员不知不觉地吸入动物发散的气溶胶，都有可能造成严重后果。4病死动物所带病原的复杂性、未知性，解剖采样过程中可能会对工作人员构成威胁，对环境造成污染(污水、血液)及对周围的动物构成威胁。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（3）（二）采样的生物安全措施为了保护工作人员、合作者和当地公众免于受到感染，严谨的操作技术规范是必不可少的。尽管我们不断面对新出现的疾病，并且由于一些21世纪新技术的使用，使疾病可能出现了新的传播方式，但是接触传染性因子的基本途径以及这些传染性因子进入人类身体的方式并没有改变。病原体只能以相对来说很少的途径侵入人类身体。将这些侵入位点保护起来，是实现生物安全和控制感染的预防性方法。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（4）1重大动物疫病没有允许禁止采样，怀疑炭疽时首先采耳尖血涂片检查，确诊后禁止剖检。2采样人员必须是兽医技术人员。具备动物传染病感染、传播流行与预防的相关知识，熟练掌握各种动物的保定技术和各种采样技术。3采样协助人员培训：当相关工作人员在与动物接触时，应该学会避免不必要的风险，工作人员应根据其工作地点具有的风险性接受相应的培训，所有的人员也都必须了解采样的动物可能带有疫病与人畜共患病，以及可能的感染与传播方式。工作过程中出现的异常情况处置，以及个人卫生和其他方面的知识。4操作规范：可以做为一条规则的是，生物安全是建立在接受过培训的人员认真履行安全准则的基础上的。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（5）健康采样与免疫基本相近，但与动物接触时间更长、更密切，如果是病死动物的采样，感染和扩散的风险更大，防护、操作更要严格。同时还要保护样品质量和生物安全。(1)健康采样时遵守出入养殖场(户)的隔离消毒措施，防止通过免疫人员的活动造成疫病传播，由于各养殖场动物的免疫、抵抗力不同，可能在一个场有动物隐性带毒不发病，一旦人为机械带入另一个养殖场，可能引起动物感染发病和流行。因此，出入养殖场必须更换隔离服和手套并做好胶靴消毒。如果是发病场更应严格。(2)进入养殖场，首先观察动物是否健康，一是动物发生某些疫病时，可能产生对人的攻击行为，如奶牛狂犬病、疯牛病等。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（6）(3)尽可能使用物理限制设备，保定动物，既保证人的安全，也保证样品的质量。(4)做好采样器械的消毒，避免样品的交叉污染。(5)对动物进行保定，做好人员防护，防止出现针刺伤风险。(6)尖锐物品处理，注射用针头、刀片一旦使用完毕，必须立刻投人尖锐物品箱内以待处理。(7)病死动物要在隔离区(下铺塑料布)或实验室剖检、采样，采样后的动物尸体、废弃物等进行烧毁或深埋等无害化处理。(8)采样结束，采样人员需更衣消毒，对采样的环境进行清洁消毒。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（7）二、样品保存、运输过程中的生物安全(一)动物样品的分类 动物样品包括动物分泌物、血液、排泄物、组织、组织渗出液等。农业部第503号公告高致病性动物病原微生物菌(毒)种或者样本运输包装规范规定要在此类物品包装上贴有相关标志。国际航空运输协会特别指出此类物品不包括感染的活体动物。列入国际航空运输协会危险品管理条例的诊断样品分类如下：已知含有或有理由怀疑含有风险级别2、3或4的病原物品和极低可能含有风险级别4病原的物品。此类物品在联合国2814号条例(感染人的病原)或者联合国2900号条例(感染动物的病原)都有详细说明。用于此类病原初诊或确诊的样品属于此级别(PI602)。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（8）(二)样品的包装安全 包装要求有三项基本原则：确保物品，不打碎容器也不漏到容器内。即使在容器打碎的情况下，确保物品不会漏出。贴标签(说明何种物品)。1包装 国际运输航空协会要求感染性物品、诊断材料、生物制品都要按照危险物品管理条理中的特别说明进行包装。包装条例主要有P1650和P1602。其中规定必须三层包装、贴标签和文字说明。(1)三层包装 三层包装在国际运输航空协会的危险物品管理条例都有说明。物品包装的第一层容器是防水、防漏和密封性好的。吸水材料缠绕容器(运送固体类物品除外)，以防止容器打碎后，液体的扩散。美国邮政管理局规定容器必须留有足够的空间(液体扩散的空间)，确保在55。C时，容器不会被液体装满。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（9）将第一层容器进行坚固、防水、防漏的第二层包装。可能在单个的第二层包装中不止包装一个第一层容器(依据包装量的有关规定)。美国邮政管理局要求在第一层周围放有快速吸水性材料，而运输部则要求在每个第一层容器缠绕吸水性材料。公共卫生署只要求在包装材料每件容积超过50毫升时才要求使用吸水材料。在第二层外面又有一层包装。这最外面的包装要坚固，一般要求使用皱褶的纤维板、木板或者强度与其类似的材料。美国邮政管理局要求最外层包装必须使用纤维板或者运输部规定的材料。此外，还要求对包装做一些测试，比如运输过程中没有内容物的外泄和包装所起保护作用的降低。国际运输航空协会要求外包装坚固，使用纤维板、木板或铁制材料。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（10）(2)基本的防漏包装 基本的防漏包装1：此种类型的包装是为了防漏、防震，防止压力的变化和其他在运输中常见的事故，以免对物品产生不利影响。基本的防漏包装2：美国邮政管理局要求第一层容器必须密封性好，并且在第一层容器放有吸水材料，以防渗漏。第二层包装也要使用防漏材料，这样即使物质从第一层容器漏出，也不会渗漏到环境中。此外，还要使用至少防震和防压材料。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（11）(3)特殊的包装需要 冷冻材料 冰：包装时使用冰作冷冻剂，一定要采取防渗漏措施。干冰：使用干冰作冷冻剂，必须将干冰放入第二层容器内，第二层容器必须用防震材料进行固定，以免干冰挥发后发生松动。美国邮政管理局和运输部要求外包装必须使用透气材料，以便干冰挥发。液氮：包装必须耐受极低的温度并且有可以运输液氮的文件证明。具体包装要求可参照农业部第503号公告高致病性动物病原微生物菌(毒)种或者样本运输包装规范。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（12）(三)运输高致病性动物病原微生物菌(毒)种或样本的安全 1.运输目的、用途和接受单位符合规定。2.运输容器符合规定。3.印有生物危险标识、警告用语和提示用语。4.原则上通过陆路运输，水路也可；紧急情况下，可以通过民用航空运输。5.经过省级以上兽医主管部门批准：省内的由省级批准；跨省或运往国外的，省级初审后，由农业部批准。6.应当有不少于2人的专人护送，并采取防护措施。7.发生被盗、被抢、丢失、泄露的，立即采取控制措施，在2小时内向有关部门报告。第七节 动物采样和运输过程的生物安全（13）(四)病原微生物菌(毒)种保藏的安全 1.要制订严格的安全保管制度。2.做好进出和储存的记录和档案，专人负责。3.依据规定(取得高致病性动物病原微生物相关实验活动的批准文件)，向实验室提供病原微生物菌(毒)种和样本。4.发生被盗、被抢、丢失、泄露的，立即采取控制措施，在2小时内向有关部门报告。第八节 重大动物疫病采样及运输要求（1）一高致病性禽流感二、口蹄疫三、高致病性猪蓝耳病发生高致病性猪蓝耳病后，如何采集分离病原及运送病料样品？样品采集血清样品：采集的血液25mL，在室温下静置2h4h（防止曝晒），待血液凝固后分离血清。若需长时间保存，则将血清置-20以下保存，但要尽量避免反复冻融。实质脏器样品：无菌采集濒死猪扁桃体、肺、脑、心、肝、脾、肾、淋巴结及其他可见病变的组织，放入无菌容器内。每块组织最好单独放在1个容器内（也可置于自封袋中），用记号笔注明日期、组织脏器和动物名称。注意防止组织间相互污染，及时置于低温条件下保存。第八节 重大动物疫病采样及运输要求（2）胚胎样品：选取完整、无腐败的胚胎送检。样品运送：所采集的样品要以最快最直接的途径送往实验室。如果样品能在采集后24小时内送抵实验室，则可放在4左右的容器中运送。在24小时内不能送到实验室时，可将样品冷冻，并维持低温状态运送。样品记录：样品记录应伴随样品送到实验室，且应包括以下内容：畜主的姓名和猪（圈）场的地址，场（圈、户）里饲养的生猪品种及其数量，被感染的猪只种类，首发和继发病例的日期及造成的损失；出现临床症状的猪只数量、死亡猪只数量及其年龄，临床症状及其持续时间，死亡情况和时间，基本病理变化，免疫和用药情况等；送检样品清单和说明，包括病料的种类、保存方法，要求做何种检测，送检者的姓名、地址、邮编和电话，送检日期等。