动物细胞与组织培养

讲课教师讲课教师:刘哲刘哲黑龙江八一农垦大学黑龙江八一农垦大学第一节第一节动物组织细胞培养基础动物组织细胞培养基础一、一、动物细胞特点动物细胞特点1.动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比进化程度更高，结构、成分更复杂，功能比进化程度更高，结构、成分更复杂，功能更全面。更全面。2.动物细胞的连接：动物细胞的连接：封闭连接：封闭连接：紧密连接紧密连接、间壁连接、间壁连接锚定连接：粘合带与粘合斑，桥粒与半桥粒锚定连接：粘合带与粘合斑，桥粒与半桥粒通讯连接：间隙连接，胞间连丝，化学突触通讯连接：间隙连接，胞间连丝，化学突触3.动物细胞的特点及生长特性动物细胞的特点及生长特性动物细胞动物细胞大，无细胞壁大，无细胞壁动物细胞生长缓慢，倍增时间长，易受污染动物细胞生长缓慢，倍增时间长，易受污染需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感动物细胞间主要以聚集体形式存在动物细胞间主要以聚集体形式存在原代细胞一般繁殖原代细胞一般繁殖5050代即退化死亡代即退化死亡一些不同形状的人体细胞一些不同形状的人体细胞Hepatocytes(肝肝)血液凝块细胞与细胞巨噬细胞白血球巨噬细胞纤灭癌细胞细胞与细胞免疫细胞树突细胞树突细胞:嗜中性粒细胞吞噬志贺杆菌巨核细胞巨核细胞骨细胞骨细胞成骨细胞破骨细胞破骨细胞(紫色紫色)胶质细胞正常衰老细胞正常衰老细胞（红色）和死亡细胞细胞凋亡的核变癌症细胞大片自由基和被其污染至病的细胞细胞变异，增大的癌症细胞乳腺癌细胞脑部细胞癌变由于营养过剩导致的细胞和由此导致死亡病死的肌细胞SEM of retina of eye showing rod cells(photoreceptors）扫描电镜的眼睛显示视网膜视杆细胞Scanningelectronmicrographofahumanspermcontactingahamsteregg.人上皮细胞培养人上皮细胞培养7d尿路上皮细胞小鼠胚胎成纤维细胞小鼠胚胎成纤维细胞体外培养的间充质干细胞体外培养的间充质干细胞黑色素细胞黑色素细胞第二节动物细胞与组织培养第二节动物细胞与组织培养基本概念基本概念一一分类分类:动动物物细细胞胞与与组组织织培培养养：(Cell and TissueCulture)指的是从动动物物组组织织或或细细胞胞从从体内取出，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。细胞培养细胞培养(CellCulture)培养物是单个细胞和细胞群。器器官官培培养养（OrganCulture）培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。ClassificationofCellCulturesPrimaryCultureCellstakendirectlyfromatissuetoadish原代培养：原代培养：直接取自动植体的组织或细胞直接取自动植体的组织或细胞的培养。的培养。SecondaryCultureCellstakenfromaprimarycultureandpassedordividedin vitro.传代培养：传代培养：从原代培养的细胞的继续转接从原代培养的细胞的继续转接培养称为传代培养。培养称为传代培养。Thesecellshavealimitednumberofdivisionsorpassages.Afterthelimit,theywillundergoapoptosis.ApoptosisisprogrammedcelldeathContact inhibitionWhen cells contact each other,they cease their growth.Cells arrest in G0 phase of the cell cycleTransformed cells will continue to proliferate and pile upon each otherPrimary Cultureretentionofthe3Dshapeoutgrowthandmigrationofcells细胞细胞系系(cell line)：原代细胞经第一次传代原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。单一类型的细胞群体。二二发展历史发展历史动物细胞组织培养的奠基人是美国生物学动物细胞组织培养的奠基人是美国生物学家家哈里森哈里森，1907年盖玻片覆盖凹窝玻璃悬年盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法。滴培养法。1923年，年，法国学者卡勒尔法国学者卡勒尔（Carrel）设计设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。1951年，年，厄尔厄尔（Earle）发明了体外培养发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。动物细胞的人工合成培养基。卡瑞尔卡瑞尔把无菌技术带到组织培养中。把无菌技术带到组织培养中。三动物细胞培养的应用a.生物制品的生产b.转基因动物的培养c.检测有毒物质d.医学研究四四 培养细胞培养细胞按生长方式分按生长方式分:（一（一）贴附型细胞）贴附型细胞（1）成纤维细胞型细胞：）成纤维细胞型细胞：（2）上皮型细胞）上皮型细胞:（3）游走型细胞）游走型细胞（4）多形型细胞）多形型细胞（二）非贴附型细胞（二）非贴附型细胞(悬浮型悬浮型)但有些细胞既可贴附生长，也可悬浮生长。但有些细胞既可贴附生长，也可悬浮生长。（一（一）贴附型细胞贴附型细胞贴附生长是大多数细胞在体内生长的基本贴附生长是大多数细胞在体内生长的基本存在方式。贴附型细胞在培养时能贴附在存在方式。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。支技物表面生长。如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤成纤维型细胞和上皮细胞生长维型细胞和上皮细胞生长。（1）成纤维细胞型细胞：）成纤维细胞型细胞：长梭形或不规则，长梭形或不规则，细胞在支持物表面呈梭形或不规细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-32-3个长短不同的突起，个长短不同的突起，生长时呈放射状、漩涡状生长时呈放射状、漩涡状走向。走向。成纤维型细胞成纤维型细胞在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名得名.除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。人胚肺细胞人胚肺细胞在显微镜下呈现为典型的成纤在显微镜下呈现为典型的成纤维细胞型。维细胞型。成纤维细胞成纤维细胞（2）上皮型细胞）上皮型细胞:此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平状，扁平状，细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时彼此紧密连接成单层细胞。生长时彼此紧密连接成单层细胞。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。Hela细胞细胞呈现为典型的上皮细胞型。呈现为典型的上皮细胞型。上皮型细胞上皮型细胞主动脉血管内皮细胞（100倍）（3）游走型细胞）游走型细胞本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或伪足或突起，呈活跃的游走或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不变形运动，速度快且不规则。规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。体外培养的体外培养的游走型细胞具有类似巨噬游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。细胞样的特征。主要是：单核巨噬细主要是：单核巨噬细胞系统的细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。胞系统的细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。单 核 巨 噬 细 胞1、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；片、形成群落；2、细胞胞质常伸出伪足和突起。、细胞胞质常伸出伪足和突起。3、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、方向不规则。方向不规则。4、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。（4）多形型细胞）多形型细胞形态上不规形态上不规则的细胞，则的细胞，一般分胞体一般分胞体和胞突两部和胞突两部分分,如神经组如神经组织细胞织细胞.（二）（二）非附型细胞非附型细胞悬浮生长细胞：血液白细胞、淋巴组织细悬浮生长细胞：血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。胞系等。这类细胞特点：胞体始终是球形、密度较这类细胞特点：胞体始终是球形、密度较高，培养效率高、易大规模生产。高，培养效率高、易大规模生产。五五.影响细胞形态学特征的因素影响细胞形态学特征的因素血清成分、培养基成分、添加成分、培养血清成分、培养基成分、添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。基的酸碱度、气相环境、温度等。如如,Hela细胞原本是一种上皮型癌细胞细胞原本是一种上皮型癌细胞,但但在过酸或过碱的条件下培养在过酸或过碱的条件下培养,可以呈现梭形可以呈现梭形,当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。第三节第三节动物组织细胞培养动物组织细胞培养要求要求一一体外培养特点体外培养特点:大多数动物细胞要附在物体上表面生长，大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。求更高。二二培养工具培养工具:培养瓶、培养皿、培培养瓶、培养皿、培养管、养管、多孔培养板多孔培养板等。等。细胞培养以玻璃器皿为主。细胞培养以玻璃器皿为主。器皿应选择透明度好、无毒、器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。中性硬度玻璃制品。l根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。ll三三、培养条件培养条件细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。【讨论讨论】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环和气体环境。境。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。提示：无菌、无毒的环境。1）恒定的温度恒定的温度:37，维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为的标准温度为36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，时，细胞代谢与温度成正比；细胞代谢与温度成正比；人体细胞在人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；有恢复可能；当温度在当温度在43以上以上1小时，细胞全部死亡。小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率低温下会使细胞代谢速率降低降低2）PHPH：7.2-7.7.2-7.当当PHPH低于低于6 6或高于或高于7.67.6时的生长会受到影响，时的生长会受到影响，甚至死亡。甚至死亡。用来检测PH的变化：红色-pH7.4，橙色-pH7.0，黄色-pH6.5，蓝红色-pH7.6，紫色-pH7.8。3)气体：气体：有调节有调节PH的作用。的作用。气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。4）营养）营养培养基：培养基：在保证细胞渗透压的情况下，培养在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。生长。动物细胞的培养基一般分为天然、合动物细胞的培养基一般分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。还需要一些常用的溶液。合成合成培养基培养基1951年厄尔开发了供动物细胞体外生年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基的合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便于种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。普遍的作法是加入小牛血清。人工合成培养基，如人工合成培养基，如109培养液、培养液、DMEM、199、RPMI-1640，IMEM，MEM培养液等。培养液等。天然天然培养基培养基直接采用取自动物体液或从组织中提取直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。取液、鸡胚汁等。血清是天然培养基中最有效和最常用的血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维持细胞生长繁培养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。知成分。使用最普遍的天然培养基是血清，基使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。硕利增殖生长。常用的动物血清主要有牛血清和马血清。常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为牛血清分为胎牛血清和犊牛血清胎牛血清和犊牛血清，前者来，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。白质主要是白蛋白和球蛋白。氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中氨基酸中有有1212种是细胞本身不合成的，种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子增殖刺激因子(MSA)MSA)、类胰岛素生长因子类胰岛素生长因子(IGFlIGFl、IGF2)IGF2)等。等。水解乳蛋白、胶原水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成粉末状，富含氨基酸。一般配制成0 05 5溶液，微酸溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。性促使其附着生长的作用。无血清培养基无血清培养基动物血清成分复杂，各种生物大小分子混动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。限制了它的大量使用。无血清培养基不加动物血清，在基础培无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。养基中加入细胞生长有效因子，激素等。5)细胞细胞培养溶液培养溶液平衡盐水（平衡盐水（BSSBSS）：）：Hanks Hanks 液和液和EarleEarle液是常用液是常用的的BSSBSS基础溶液。基础溶液。PH调整液：调整液：NaHCO3溶液溶液、HEPES溶液溶液（二羟乙基哌二羟乙基哌嗪乙烷磺酸嗪乙烷磺酸）细胞消化液细胞消化液:胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液EDTAEDTA溶液胶原酶溶液溶液胶原酶溶液抗生素溶液：抗生素溶液：1)1)青、链霉素青、链霉素:每毫升培养液含每毫升培养液含100100U U青霉素和青霉素和100100ugug链霉素链霉素.2)2)卡那霉素：终浓度为卡那霉素：终浓度为5050ug/mlug/ml培养液。培养液。3 3）制霉菌素：浓度制霉菌素：浓度2525U/mlU/ml，小瓶分装，每瓶小瓶分装，每瓶一次用完。一次用完。6)、无污染环境、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。四细胞培养设施细胞培养设施1、实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。细胞培养实验室细胞培养实验室1.准备室准备室2.缓冲室缓冲室准备室风淋3.培养室培养室培养室培养室专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣间、缓冲间、操作间。间、缓冲间、操作间。内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设施。施。操作间放置净化工作台及操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、二氧化碳培养箱、离心机及倒置显微镜等。离心机及倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无菌物品等菌物品等风淋室风淋室：风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋口方向可调，风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。超净工作台超净工作台n也称净化工作台，分也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外为侧流式、直流式和外流式三大类。流式三大类。CO2培养箱培养箱哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样,需要在恒足温度下才能生存需要在恒足温度下才能生存,温差变化一般温差变化一般不应超过不应超过0.5度，因此培养箱对温度应具有度，因此培养箱对温度应具有较高灵敏度。较高灵敏度。CO2培养箱的优点在于能恒定地供应一培养箱的优点在于能恒定地供应一定量定量的的CO2,一般一般5%即可即可维持培养维持培养液液PH值值稳定稳定。冰箱冰箱细胞培养的冰箱应特别注意清洁，细胞培养的冰箱应特别注意清洁，防止污染。防止污染。水纯化装置水纯化装置细胞培养对水的质量要求较高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各种培养用液。过滤装置过滤装置各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。微化滤膜滤器是目前应用最广泛的过滤装置。细胞冷冻贮存细胞冷冻贮存器器细胞冷冻贮存具有经济、省力和较好保持细胞生物学特性的优点，目前各实验室主要使用液氮容器贮存细胞。培养器皿培养器皿培养器皿包括各种规格的玻璃、塑料培养瓶，培养皿，吸管，离心管等。洗刷消毒间：洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸馏水处理器及酸缸等。等。分析间：分析间：显微镜、计算机及显微镜、计算机及打印机等。打印机等。无菌操作的要领无菌操作的要领由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。超净工作台消毒超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒2030分钟，然后关闭分钟，然后关闭紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台可保持无菌环境。工作台可保持无菌环境。洗手洗手操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用洗到肘部，然后用0.2%新洁尔灭或新洁尔灭或75%的酒精棉球擦拭。的酒精棉球擦拭。火焰消毒火焰消毒所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼,否则会烧焦形成炭膜否则会烧焦形成炭膜,再用时会将有害物质带再用时会将有害物质带入培养液。入培养液。合理布局合理布局右手使用方便的用品放右侧，左手使用右手使用方便的用品放右侧，左手使用方便的用品放左侧。方便的用品放左侧。酒精灯置于中央，打开的培养液、培酒精灯置于中央，打开的培养液、培养瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开养瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口直立口直立,易增加落菌机会）。易增加落菌机会）。吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。五五)、培养细胞形态分析、培养细胞形态分析培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有的，结构不明显。细胞在生长期常有1-21-2个个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脂滴和腔泡等，表明脂滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。细胞代谢不良。动物细胞培养中血清的作用：（1）提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。（2）提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白，并通过与上述物质的结合而起到稳定和调节上述物质的作用。此外结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。（3）提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子。（4）提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。（5）提供PH缓冲物质，调节培养基PH。（6）影响培养系统中的某些物理特性如：剪切力、黏度、渗透压和气体传递速度等。血清可能引发的问题（1）所有的血清都是一种成分不确定的混合物，批与批血清之间的组分存在差异；（2）血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用。(血清来源于动物，有可能携带传染源，包括病毒和有毒物质，对正在生长的细胞系或者制品带来风险)（3）血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等细胞产品的分离纯化带来很大困难。(4)培养液营养的不足，细胞密度低、活力低，影响了细胞表达，导致疫苗等生物制品的生产效率和产量低。celllin细胞系或细胞株的命名 HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫宫-743：宫颈癌上皮细胞，：宫颈癌上皮细胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每建立；每3天传代，每次接种天传代，每次接种3105细胞毫升。细胞毫升。