线虫的分类鉴定

线虫的分类鉴定线虫的分类鉴定一、植物线虫分类的基本概念和内容一、植物线虫分类的基本概念和内容植物线虫分类的目的和内容主要包括以下几个方面植物线虫分类的目的和内容主要包括以下几个方面:(1)(1)鉴定：鉴定：研究区分和确定植物线虫的各个种类，按照国际动物命名法研究区分和确定植物线虫的各个种类，按照国际动物命名法规予以命名，并加以描述，提供正确识别和辨别线虫种类规予以命名，并加以描述，提供正确识别和辨别线虫种类的知识和资料。的知识和资料。(2)(2)分类：分类：根据线虫种类之间的异同及亲缘关系，确定其所属的分类根据线虫种类之间的异同及亲缘关系，确定其所属的分类 阶元层次，制定分类系统。阶元层次，制定分类系统。(3)(3)系统学：系统学：探寻线虫种类的起缘及其之间的亲缘关系，追溯其进化探寻线虫种类的起缘及其之间的亲缘关系，追溯其进化过程。过程。(4)(4)分类学分类学：狭义的植物线虫分类学是研究植物线虫分类的方法和理论，狭义的植物线虫分类学是研究植物线虫分类的方法和理论，广义的植物线虫分类学就是研究上述诸内容的一门科学。广义的植物线虫分类学就是研究上述诸内容的一门科学。2 植物线虫分类的基本概念和内容植物线虫分类的基本概念和内容 植物线虫分类学：植物线虫分类学：是运用是运用比较、分析比较、分析和和归纳归纳等方法，等方法，依依据线虫表达系统发育关系的性状或性状组合，对植物线虫据线虫表达系统发育关系的性状或性状组合，对植物线虫进行鉴定、命名和排序进行鉴定、命名和排序，制定可以反映植物线虫进化过程，制定可以反映植物线虫进化过程或阐明各类群内在关系的分类系统，进而或阐明各类群内在关系的分类系统，进而揭示植物线虫的揭示植物线虫的起源及各种群之间的亲缘关系起源及各种群之间的亲缘关系，同时不断探索新的分类方，同时不断探索新的分类方法和理论。法和理论。3 植物线虫分类鉴定的依据植物线虫分类鉴定的依据形态学形态学生物化学生物化学细胞遗传学细胞遗传学鉴别寄主鉴别寄主分子生物学分子生物学4二、植物线虫的形态分类特征二、植物线虫的形态分类特征形态特征形态特征是最直观、最常用的分类特征。是最直观、最常用的分类特征。但仅仅依靠形态特征难以区别一些种类，特别是一些近但仅仅依靠形态特征难以区别一些种类，特别是一些近缘种。缘种。所以有必要使用形态以外的其他性状特征，如所以有必要使用形态以外的其他性状特征，如遗传学性遗传学性状、生理生化性状、分子性状状、生理生化性状、分子性状以及以及生态、行为、地理等生态、行为、地理等性状性状都已开始应用于植物线虫的分类鉴定。都已开始应用于植物线虫的分类鉴定。形态性状往往明显地反映生物进化、反映物类形态性状往往明显地反映生物进化、反映物类(或物种或物种)的的亲缘关系及生活关系，所以目前植物线虫分类，主要还亲缘关系及生活关系，所以目前植物线虫分类，主要还是以形态性状为基础的形态分类是以形态性状为基础的形态分类。5 植物线虫的形态分类特征植物线虫的形态分类特征目前，植物线虫形态分类所依据的特征，主要是目前，植物线虫形态分类所依据的特征，主要是外部和内外部和内部形态特征。部形态特征。外部形态特征外部形态特征主要包括主要包括体形、角质层结构、头部体形、角质层结构、头部和和尾部特尾部特征征，内部形态特征内部形态特征主要包括主要包括消化系统消化系统和和生殖系统结构特征生殖系统结构特征等。等。植物线虫各发育时期的形态以及雌、雄虫的形态均有差异，植物线虫各发育时期的形态以及雌、雄虫的形态均有差异，分类定种，多数是分类定种，多数是依据成熟雌虫的形态依据成熟雌虫的形态，异形虫的年青雌，异形虫的年青雌虫形态也是重要定种依据。虫形态也是重要定种依据。幼虫和雄虫形态一般不作为定种的主要依据幼虫和雄虫形态一般不作为定种的主要依据，只作为参考，只作为参考和辅助依据。和辅助依据。6 植物线虫的形态分类特征植物线虫的形态分类特征在植物线虫的分类鉴定中，在植物线虫的分类鉴定中，数量特征数量特征和和质量特征质量特征均用于均用于种种的鉴定上；的鉴定上；属及其以上高级阶元属及其以上高级阶元的鉴定一般主要依据的鉴定一般主要依据质量特征质量特征。7 植物线虫的形态分类特征植物线虫的形态分类特征（一）形态特征测计（一）形态特征测计(数量特征数量特征)关于数量特征的测量计算，关于数量特征的测量计算，De Man(1880)提出一套公式，提出一套公式，后来该公式又得到补充和完善。后来该公式又得到补充和完善。8 植物线虫的形态分类特征植物线虫的形态分类特征（二）形态特征描述（二）形态特征描述(质量特征质量特征)1.外部形态结构外部形态结构(1)体形和死态体形和死态(2)角质层角质层 环纹环纹：细、粗、中等，表面光滑或有外生附着物；：细、粗、中等，表面光滑或有外生附着物；侧区侧区：纵线或刻线数，是否有网纹，网纹所在部位、宽度及：纵线或刻线数，是否有网纹，网纹所在部位、宽度及其占虫体宽的比例；其占虫体宽的比例；纵脊或纵线纵脊或纵线：侧区以外是否有纵脊或纵线。：侧区以外是否有纵脊或纵线。9 植物线虫的形态分类特征植物线虫的形态分类特征(3)(3)头部头部 总的形态总的形态：球形、半圆形、圆锥形等，前缘平、平圆、圆等，高、低环纹：球形、半圆形、圆锥形等，前缘平、平圆、圆等，高、低环纹数等；数等；与体部有无明显界限与体部有无明显界限：无缢缩：无缢缩(连续连续)、微缢缩、缢缩；、微缢缩、缢缩；唇区结构及形态唇区结构及形态：唇区位于头部前端，其模式结构是两个侧唇瓣、两个亚：唇区位于头部前端，其模式结构是两个侧唇瓣、两个亚背唇瓣和两个亚腹唇瓣；呈辐射状排列，唇区的形态特征是重要的依据；背唇瓣和两个亚腹唇瓣；呈辐射状排列，唇区的形态特征是重要的依据；头架头架：角质化或骨化或硬化的程度：角质化或骨化或硬化的程度(强、弱或显著、不显著强、弱或显著、不显著)；侧器侧器：口腔两侧各有一个侧器，侧器口的形状也是重要的分类依据。：口腔两侧各有一个侧器，侧器口的形状也是重要的分类依据。10 植物线虫的形态分类特征植物线虫的形态分类特征 (4)(4)乳突乳突(papilla)(papilla)：头乳突、颈乳突、：头乳突、颈乳突、交配乳突、泄殖腔唇乳突和尾乳突等是交配乳突、泄殖腔唇乳突和尾乳突等是常用的鉴定特征。常用的鉴定特征。(5)(5)尾部尾部(tail)(tail)尾部长度尾部长度：长、短；：长、短；尾形尾形：细或宽圆筒形、细或宽圆：细或宽圆筒形、细或宽圆锥形锥形(对称或不对称对称或不对称)、丝状、棒状、杆、丝状、棒状、杆状等；状等；尾末端形态尾末端形态：锐尖、尖、细尖、：锐尖、尖、细尖、钝尖、平、平圆、半圆，光滑、有环纹钝尖、平、平圆、半圆，光滑、有环纹等；等；尾端上有无附着结构尾端上有无附着结构：尾突：尾突(尾末尾末端上突起端上突起)、尾尖突、尾尖突(尾突上的突起或很尾突上的突起或很细的尾突细的尾突)及其形态和个数等；及其形态和个数等；尾腹环数尾腹环数：尾部较短并且环纹清：尾部较短并且环纹清楚的类群常要数尾腹部环纹数。楚的类群常要数尾腹部环纹数。11 植物线虫的形态分类特征植物线虫的形态分类特征2.2.内部结构内部结构(1)(1)消化系统消化系统(digestive system)口针口针：粗、细，有无基部球及基部球形态：粗、细，有无基部球及基部球形态(球形、凸缘状、郁金香形、锚状等球形、凸缘状、郁金香形、锚状等)。食道食道：食道类型及结构在高级阶元的分类上非常重要。：食道类型及结构在高级阶元的分类上非常重要。食道腺开口食道腺开口：滑刃目线虫背食道腺开口位于中食道球，垫刃目线虫背食道腺开口：滑刃目线虫背食道腺开口位于中食道球，垫刃目线虫背食道腺开口位于口针基部球后的食道前体部，这两类线虫的位于口针基部球后的食道前体部，这两类线虫的2 2个亚腹食道腺开口位于中个亚腹食道腺开口位于中食道球，垫刃目线虫的背食道腺开口与口针基部球的距离是一些种、属的重食道球，垫刃目线虫的背食道腺开口与口针基部球的距离是一些种、属的重要鉴定特征。要鉴定特征。肠肠：在分类鉴定中意义不大。：在分类鉴定中意义不大。肛门肛门：常描述的是该处体宽，有的肛门略凸起，也只作为描述特征，不作为鉴定：常描述的是该处体宽，有的肛门略凸起，也只作为描述特征，不作为鉴定检索特征。检索特征。12 植物线虫的形态分类特征植物线虫的形态分类特征(2)(2)生殖系统生殖系统：线虫的生殖系统很发达，是分类：线虫的生殖系统很发达，是分类上重要性状。上重要性状。雌虫生殖系统的描述：雌虫生殖系统的描述：生殖腺单个生殖腺单个(前伸或后伸前伸或后伸)、1 1对对(对伸或前伸对伸或前伸)；单个生殖腺的是否有后阴子宫囊，后单个生殖腺的是否有后阴子宫囊，后阴子宫囊长度；阴子宫囊长度；生殖腺的长、短；生殖腺的长、短；卵巢卵巢直伸或转折直伸或转折(1(1、2 2或多个转折或多个转折)；卵母细胞卵母细胞单行、双行或多行排列；单行、双行或多行排列；受精囊有或无；受精囊有或无；子宫：是否有卵、卵的多少、长度子宫：是否有卵、卵的多少、长度(较少较少描述描述)；阴道：长度阴道：长度(占阴门处体宽的比占阴门处体宽的比)，垂直体中轴或斜向前，垂直体中轴或斜向前(后后)伸；伸；阴门：位阴门：位置，阴门形态：横裂、纵裂、孔状。置，阴门形态：横裂、纵裂、孔状。13 植物线虫的形态分类特征植物线虫的形态分类特征雄虫生殖系统的描述：雄虫生殖系统的描述：生殖腺单或双，长度，若单生殖生殖腺单或双，长度，若单生殖腺则其前伸或后伸腺则其前伸或后伸(一般前伸一般前伸)，是，是否转折；否转折；贮精囊是否明显；贮精囊是否明显；交合刺形态：瑰玫刺状、新月状、交合刺形态：瑰玫刺状、新月状、镰刀状等；镰刀状等；引带有无；引带有无；交合伞有无及其长度，与尾的位交合伞有无及其长度，与尾的位置关系。置关系。贮精囊贮精囊14 植物线虫的形态分类特征植物线虫的形态分类特征(3)(3)排泄系统排泄系统：排泄孔的位置，排泄孔的位置，有时要描述排泄管角质化程有时要描述排泄管角质化程度。度。(4)(4)神经系统神经系统：侧尾腺是线虫侧尾腺是线虫高级阶元的重要分类特征，高级阶元的重要分类特征，在纽带科中，侧尾腺口的形在纽带科中，侧尾腺口的形态和位置也是种、属的重要态和位置也是种、属的重要鉴定特征；雄虫泄殖腔前后鉴定特征；雄虫泄殖腔前后的乳突统称生殖乳突，也是的乳突统称生殖乳突，也是重要的分类鉴定特征；神经重要的分类鉴定特征；神经环和半月体通常作为描述特环和半月体通常作为描述特征，有时也作为种的鉴定特征，有时也作为种的鉴定特征。征。15 植物线虫的其他鉴定方法植物线虫的其他鉴定方法l1.1.生物化学鉴定法（生物化学鉴定法（雌虫的同功酶雌虫的同功酶图谱）图谱）16 植物线虫的其他鉴定方法植物线虫的其他鉴定方法l 2.鉴别寄主方法：方法：鉴别寄主反应：鉴别寄主反应：烟草、棉花、辣椒、烟草、棉花、辣椒、西瓜、西瓜、花生、番茄等。花生、番茄等。鉴别寄主鉴别寄主Differential Differential hosthost烟草烟草TobaccoTobacco棉花棉花CottonCotton辣椒辣椒PepperPepper西瓜西瓜WatermelonWatermelon花生花生PeanutPeanut番茄番茄TomatoTomato结果结果ResultsResults+-+-+鉴别寄主反应鉴别寄主反应 注：注：“+”表示该植物能被侵染；表示该植物能被侵染；“-”表示该植物不能被侵染表示该植物不能被侵染17 植物线虫的其他鉴定方法植物线虫的其他鉴定方法l3.分子生物学方法 （1）PCR（2）rDNA-ITS（3）PCR-RFLP（4）RAPD（5）SSR-PCR （6）分子杂交）分子杂交18n近年来，越来越多的分子生物学技术应用到植近年来，越来越多的分子生物学技术应用到植物病原线虫学研究领域物病原线虫学研究领域,在植物线虫病害诊断、在植物线虫病害诊断、分类以及流行学调查方面得到广泛应用，下面分类以及流行学调查方面得到广泛应用，下面详细介绍详细介绍PCRPCR、PCR-RFLPPCR-RFLP、RAPDRAPD、分子杂交等、分子杂交等目前常用的分子技术。目前常用的分子技术。19（1）多聚酶链式反应（）多聚酶链式反应（PCR）nPCRPCR技术基本原理：类似于技术基本原理：类似于DNADNA的天然复制过程，的天然复制过程，其特其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCRPCR由由变性变性-退火退火-延伸三个基本反应步骤构成：延伸三个基本反应步骤构成：模板模板DNADNA的变性：模板的变性：模板DNADNA经加热至经加热至9393左右一定时间后，左右一定时间后，使之成为单链；使之成为单链；模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：温度降至：温度降至5555左右，引左右，引物与模板物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；20引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA DNA 链互补的半保留复制链。链互补的半保留复制链。重复循环变性重复循环变性-退火退火-延伸三过程，延伸三过程，2 23 3小时就能将小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。待扩目的基因扩增放大几百万倍。21最后这种最后这种DNADNA片段能在普通琼脂糖凝胶上进行片段能在普通琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳。观察琼脂糖凝胶中观察琼脂糖凝胶中DNADNA最常用的方法是利用荧最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，它含有一个可以嵌光染料溴化乙锭进行染色，它含有一个可以嵌入入DNADNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。溴堆积碱基之间的一个三环平面基团。溴化乙锭在标准化乙锭在标准302nm 302nm 紫外光透射仪激发下放射紫外光透射仪激发下放射出橙红色信号，可用凝胶成像处理系统拍摄。出橙红色信号，可用凝胶成像处理系统拍摄。22PCR电泳图电泳图23应用实例：24rDNA-ITS鉴定根结线虫鉴定根结线虫（2 2）rDNA-ITSrDNA-ITS鉴定根结线虫25rDNA-ITS rDNA-ITS 测序后同源性聚类分析的系统进化树测序后同源性聚类分析的系统进化树26（3）PCR-RFLPPCR-RFLP方法方法n聚合酶链式反应聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（PCR-RFLPPCR-RFLP）法的原理是：采用聚合酶链式反）法的原理是：采用聚合酶链式反应（应（PCRPCR）扩增目的）扩增目的DNADNA片段，然后将待检测的片段，然后将待检测的DNADNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱分析此段序列的特进行电泳，再由限制酶图谱分析此段序列的特异切位点，由片段的多样性来比对不同来源基异切位点，由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。因序列的差异性。2728应用实例29（4 4）RAPDRAPD技术技术n随机扩增的多态性随机扩增的多态性DNADNA，RAPDRAPD技术建立于技术建立于PCRPCR技术技术基础上基础上,它是利用一系列它是利用一系列(通常数百个通常数百个)不同的随不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为通常为1010聚聚体体)为引物为引物,对所研究基因组对所研究基因组DNADNA进行进行PCRPCR扩增扩增.聚聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经经EBEB染色或放射性染色或放射性自显影来检测扩增产物自显影来检测扩增产物DNADNA片段的多态性片段的多态性,这些扩这些扩增产物增产物DNADNA片段的多态性反映了基因组相应区域片段的多态性反映了基因组相应区域的的DNADNA多态性。多态性。30 植物线虫的其他鉴定方法植物线虫的其他鉴定方法M.incognitaM.javanicaM.arenariaRAPD-PCR鉴定根结线虫31应用实例32（5 5）SSR-PCRSSR-PCR技术技术n由于真核生物中富含由于真核生物中富含CACA重复序列，重复序列，SSRSSRPCRPCR就就是针对高度密集的是针对高度密集的CACA微卫星体简单重复序列，微卫星体简单重复序列，设计与之互补的重复设计与之互补的重复CACA碱基作引物扩增其重复碱基作引物扩增其重复片段，从而揭示其多态性。片段，从而揭示其多态性。33（6 6）分子杂交技术）分子杂交技术n核酸的分子杂交核酸的分子杂交(molecular hybridization)(molecular hybridization)技术是目前技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异是定性或定量检测特异RNARNA或或DNADNA序列片段的有力工具。序列片段的有力工具。n它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNADNA之间的之间的氢键被破坏氢键被破坏(变性变性)，双链解开成两条单链。这时加入异，双链解开成两条单链。这时加入异源的源的DNADNA或或RNA(RNA(单链单链)并在一定离子强度和温度下保温并在一定离子强度和温度下保温(复性复性)，若异源，若异源DNADNA或或RNARNA之间的某些区域有互补的碱基之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。34n在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知化的已知RNARNA或或DNADNA序列片段去检测未知的核酸序列片段去检测未知的核酸样品。作为检测工具用的已知样品。作为检测工具用的已知RNARNA或或DNADNA序列片序列片段称为杂交探针段称为杂交探针(probe)(probe)。它常常用放射性同。它常常用放射性同位素来标记。位素来标记。35 三、三、植物线虫的分类地位和分类系统概述植物线虫的分类地位和分类系统概述 线虫是一类两侧对称原体腔无脊椎动物，其归属于动物界线虫是一类两侧对称原体腔无脊椎动物，其归属于动物界中的一个门中的一个门线虫门，根据侧尾腺的有无划分为线虫门，根据侧尾腺的有无划分为2 2个纲：个纲：侧侧尾腺纲尾腺纲和和无侧尾腺纲无侧尾腺纲。目前世界上已记载的植物线虫约有目前世界上已记载的植物线虫约有200200多属多属50005000余种，其余种，其中大多数隶属于侧尾腺纲，少数隶属于无侧尾腺纲。中大多数隶属于侧尾腺纲，少数隶属于无侧尾腺纲。在上述系统中，植物寄生线虫或植物根际线虫主要是在上述系统中，植物寄生线虫或植物根际线虫主要是垫刃垫刃亚目、滑刃亚目、长针科和毛刺科线虫亚目、滑刃亚目、长针科和毛刺科线虫，其他亚目或科中的，其他亚目或科中的线虫，只有极少数与植物有关，而大多数是自由生活线虫或线虫，只有极少数与植物有关，而大多数是自由生活线虫或昆虫寄生线虫，所以，目前植物线虫总的可以概括为这昆虫寄生线虫，所以，目前植物线虫总的可以概括为这4 4大大类。类。36 植物线虫的分类地位和分类系统概述植物线虫的分类地位和分类系统概述 线虫线虫门门侧尾腺口纲侧尾腺口纲无侧尾腺口无侧尾腺口纲纲垫刃目垫刃目滑刃目滑刃目矛线目矛线目三矛目三矛目垫刃科垫刃科 粒线虫科粒线虫科 锥线虫科锥线虫科 刺线虫科刺线虫科 短体线虫科短体线虫科 纽带线虫科纽带线虫科 异皮线虫科异皮线虫科滑刃科滑刃科拟滑刃科拟滑刃科长尾滑刃科长尾滑刃科针咽科针咽科长针科长针科毛刺毛刺科科37Thats all,Thank you for your patience!38结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！39