精子功能检测的进展

精子功能检测的进展精子功能检测的进展一、精子功能检测的概要和意义二、精液常规显微镜检查三、精子获能和精子受精功能检测四、精子核成熟度和精子染色体非整倍性检测五、精子凋亡检测六、精子功能流式细胞仪检测的发展七、总结及展望内 容4.精子在女子生殖道获能及运送1.数量2.活力3.形态5.精卵识别6.顶体反应7.释放蛋白水解酶9.男子生殖核的形成 一、精子功能检测的概要和意义8.穿透透明带WHO检查指标：1、精液外观2、精液量3、酸碱度4、液化时间5、粘稠度6、精子聚集与凝集7、精子浓度8、精子活动率9、圆细胞浓度及分类10、精子形态学染色分析二、精液常规显微镜检查精液常规检查中容易忽略的几个问题：1、精液标本的采集方式和患者的情绪会影响样本采集的完整性。2、如果比较两次的精液常规检查结果，必须考虑相同的禁欲时间和患者相同的状态。3、粘稠度高不等同于液化异常。不液化的精液标本呈现非均质粘稠，而粘稠度高的精液标本所呈现的是均质性粘性，并且其粘稠度不随时间而变化。4、精子总数可以衡量睾丸产生精子的能力和男性输精管道畅通的程度，精子浓度受精囊腺和前列腺分泌液量的影响（Eliasson et al.,1975），不是衡量睾丸功能的特异性指标。5、圆细胞浓度检测和分类的重要性 精液中的白细胞和不成熟的生精细胞统称为圆细胞。正常精液中，有90%的圆细胞为未成熟生精细胞，并且数量很少。临床检测圆细胞浓度超过1x106/ml时，就需要进一步通过染色进行分类，并且准确测定它们的浓度，这对诊断不育病因十分重要。常用的染色方法有：区分不成熟生精细胞可以用瑞-吉染色；区分白细胞可以用白细胞过氧化物酶染色和全白细胞（CD45）免疫细胞化学染色。精液中脱落生精细胞的形态示意图（曹兴午，精液生精细胞检查与临床意义，中华检验医学杂志2006年10月第29卷第10期）白细胞过氧化物酶染色的白细胞示意图（棕色）全白细胞（CD45）免疫细胞化学染色结果示意图研究研究样本情况本情况睾丸活睾丸活检病理病理结果果精液精液脱落脱落细胞学胞学检查结果果15例自愿者（均为妻子怀孕待产）可见各级生精细胞及精子1、能见少量各级生精细胞及大量精子者1例，占6.7%；2、见到少量初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和大量精子者3例，占20%；3、见到少量次级精母细胞、精子细胞和大量精子者10例，占66.7%；4、仅见少量精子细胞和大量精子者1例，占6.7%。12例少精子症者可见少量精原细胞、精母细胞、次级精母细胞，有少数晚期精子细胞1、检查出包括精原细胞在内的大量各级生精细胞2例，占16.7%；2、有大量初级精母细胞、次级精母细胞、少量晚期精子细胞和精子8例，占66.7%；3、有大量精子细胞和极少量精子2例，占16.7%。10例原发性睾丸功能障碍1、仅见精原细胞、支持细胞6例；2、睾丸曲细精管生精细胞完全缺失，生精上皮仅支持细胞组成者4例。1、见有少量精原细胞、支持细胞及生殖道上皮细胞6例；2、见有支持细胞、生殖道上皮细胞4例。结论：精液脱落细胞学检查与睾丸活检的病理结果具有一致性。（黄宇峰，精液脱落细胞的研究与临床应用，临床检验杂志1996年第14卷第1期）目前还没有来自有生育力男性精液中过氧化物酶阳性细胞的参考范围，WHO第四版精液分析手册中确定的精液白细胞症临床诊断标准为1x106/ml。Cooper 通过研究证实现有的过氧化物酶染色方法很难精确到1x106/ml这个标准，所以白细胞精液症临界值的确定一直存在诸多分歧，因此临床迫切需要建立新的标准和更可靠快速的检测方法学。（Cooper,Improving Precision in the Assessment of Round Cell Numbers in Human Semen,2010）6、精子形体学分析必须按照严格标准进行评估 所谓严格标准，是指严格评估精子形态（细分为头部、颈部和中段以及尾部）和过多残留胞浆，只有以上标准都正常的精子才认为是正常的。使用严格标准，精子头部形状比大小更重要。精子头部形态异常往往和DNA碎片的增加（Gandini et al.,1988）、染色质结构异常（Lee et al.,1996）、不成熟染色质（Dadoume et al.,1988）和非整倍体（Devillard et al.,2002）相关。卷尾可能提示附睾功能障碍（Pelfrey et al.,1982）。过多的残留胞浆与精子的发育相关，并有研究显示，活性氧(ROS)与过量的残留胞浆小滴呈正相关（Esfandiari N et al.,2003）。精子形态学分类标准(Kruger&menkfeld)精液显微镜检查技术的发展：1、计算机辅助精液常规分析系统（CASA）由相差显微镜、恒温装置、专用记数板、摄像系统、计算机分析处理系统及输出系统组成。2、精子DNA荧光染色CASA系统3、活动精子细胞器形态学检查(MSOME)技术和胞质内形态学选择精子注射(IMSI)技术 MSOME：高倍数光学显微镜，加上微分干涉相位差的光学技术，将精子放大到6 300倍进行观察，可以筛选出精子核、顶体后致密板、顶体、线粒体、颈部及尾部都正常的精子。IMSI：与常规ICSI比较，有更高的妊娠率和抱子回家率，而受精率、卵裂率和胚胎形态没有明显区。该技术需时较长，设备昂贵，加上需要有经验的胚胎学家操作，胚胎学家的主观性评判限制了其应用。总结：1、显微镜精液检查技术可以获得比较直观精子形态数据，但无法揭示内在的原因；2、检测过程受主观因素影响较大，结果不稳定；3、评估的精子数量有限，检测的准确性有待商榷；4、无法满足临床自动化和批量化检测的需要。精子获能检测精子的顶体反应三、精子获能和受精功能检测三种检测精子顶体反应的方法：1、钙离子载体诱发精子顶体反应试验；2、孕酮诱发精子顶体反应试验；3、人卵透明带诱发精子顶体反应试验。其中，最准确的是人卵透明带诱发精子顶体反应试验，其它两种方法检测的结果与卵透明带诱发的顶体反应不相关（Liu&Baker,1996）。精子诱发顶体反应(PSA-FITC标记)（:发生顶体反应精子）20精子受精功能检测精子与人卵透明带相互结合与反应试验（Liu DY&Baker HWG，1992）该试验被认为是至今为止最能准确预测IVF受精结局的试验方法，但是由于需要使用人的卵子作为试验载体，因而未能在临床得到广泛的使用。+透明带诱发顶体反应2 hrs吸管精子-透明带穿透试验 精子-透明带结合试验精子与人卵透明带相互结合与反应试验研究样本（600例）精子-透明带结合异常透明透明带诱发顶体反体反应低下低下精液常规检查正常的不育患者13%28%中等精子畸形患者21%38%严重精子畸形患者31%48%少精子症患者28%69%无论是精子透明带结合缺陷还是透明带诱发精子顶体反应缺陷都会导致精子透明带穿透能力的低下。将精子能结合透明带但不发生顶体反应，当然也不能穿透透明带称之为“透明带诱发精子顶体反应缺陷症（DZPIAR）”。这类患者在IVF治疗中的平均受精率35%，大多数为完全受精失败。通过实施ICSI会提高他们生育的机会。（Liu DY&Baker HWG et al.,Clinical application of sperm-oocyte interaction tests in in vitro fertilization embryo transfer and intracytoplasmic sperm injection programs,FERTILITY AND STERILITY VOL.82,NO.5,NOVEMBER 2004）在精子核成熟过程中，由初期的组蛋白转换成鱼精蛋白，是精子核成熟的重要标志，也是最终形成高度浓缩的精子特异性染色质的重要前提。精子核蛋白组型转换障碍可能会干扰和阻碍鱼精蛋白与DNA的相互作用，从而导致染色质缩合异常，进而引发核内空泡、顶体异常等精子形态的异常。四、精子核成熟度和精子染色体非整倍性检测检测精子核成熟度的方法有：1、苯胺蓝染色法：操作简单，为定性试验。以核不成熟精子/核成熟精子+不成熟精子来反映精子核的成熟度。2、电泳法：操作复杂，为定量试验。以总组蛋白/总精蛋白（TH/TP）以及人鱼精蛋白1/人鱼精蛋白2+人鱼精蛋白3（HP1/HP2+HP3）的比值来评价精子核蛋白的成熟度。苯胺蓝染色结果示意图1050例男性不育患者精子核蛋白组型分析结论：精子核蛋白检测有可能成为临床评估男性生育力的重要指标。（陈晖等,1050例不育男性精子碱性核蛋白的分析,生殖医学杂志2005年6月第14卷第3期）国内学者研究了精子核蛋白成熟度与IVF结局之间的关系，发现精子核蛋白不成熟度与IVF受精率和正常受精率呈负相关性（r=-0.343、-0.253，P均0.05）（江莉等,精子核成熟度与体外受精结局的关系,山东医药2012年第52卷第19期）。有学者对315例自然流产妇女的配偶精子进行核蛋白成熟度检测研究，发现精子核蛋白不成熟是孕早期自发性流产、胚胎停育的男性危险因素，但经药物治疗精子不成熟度得以改善后，可明显减少女方自发流产胚胎停育率和提高分娩率。（刘瑜等,孕早期自发性流产与胚胎停育男性因素病例对照研究,中国男科学杂志2010年第24卷）精子染色体非整倍体是精子发生过程中减数分裂缺陷造成的细胞染色体数目异常。荧光原位杂交（FISH）是检测精子染色体非整倍体的主要方法之。研究表明，不育男性染色体非整倍体的发生率比可育男性高10倍。精液常规检查参数下降也会导致非整倍体精子发生率增加（VegettiW et al.,2000）。回顾性研究表明，非整倍体精子与非整倍体儿的出生（或妊娠）相关（BlancoJ et al.,1998；Martinez et al.,1999；Carrell DT et al.,2001）。前瞻性研究表明，非整倍体精子含量高的男性产生非整倍体胚胎、非倍体胎儿或 IVF失败的风险增加（Martin RH et al.,1986；Nagvenkar P et al.,2005；Gianaroli L et al.,2005）。复发性流产也与非整倍体精子的增加相关（Rubio C et al.,1999）。细胞凋亡是细胞受遗传机制控制，出现一系列形态功能的改变而自行结束生命的现象，是机体清除那些形态功能异常细胞的重要手段。根据凋亡的过程可分为早期、中期和晚期凋亡，相应的检测指标有：1、早期凋亡：细胞膜磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)的翻转和线粒体膜电位去极化（MMP）；2、中期凋亡：Caspase（天门冬氨酸特异性蛋白酶,CP）酶系统的活化；3、晚期凋亡：DNA的碎片化（DNA Fragment,DF）。五、精子与生精细胞凋亡检测细胞凋亡机制示意图 研究表明，正常生精过程中自发性和受到各种外来因素影响而诱发生精细胞减少大多与凋亡过程有关。（Vigier M et al.,2004;Kilinc F et al.,2004;J Moretti E et al.,2007;Theas MS et al.,2006;Assinder S et al.,2007）。生精细胞凋亡发生在三个阶段：首先是在A型精原细胞的有丝分裂阶段；其次是精母细胞的减数分裂阶段；最后是精子的形成阶段。生精细胞凋亡的意义在于维持精子发生过程的动态平衡，维持支持细胞与生精细胞的最佳比例，清除异常生殖细胞，调节生精过程中精子的数量和质量。在病理状态下，生精细胞凋亡则导致少精子或无精子症发生。（Kilinc F et al.,2004;J Moretti E et al.,2007;Theas MS et al.,2006;Assinder S et al.,2007）成熟精子的凋亡主要发生在精子离开睾丸后的阶段。诱发精液中精子凋亡的主要因素是活性氧（ROS）损伤。人精液中的活性氧物质由精子和白细胞产生。精子内源性的活性氧物质主要来自线粒体分泌的过氧化氢，外源性活性氧物质主要是超氧阴离子。（Aitken&West,1990;Alvarez et al.,1987;Iwasaki&Gagnon,1992）现有的研究表明精液中精子凋亡率与精子浓度、精子前向活动率、精子形态呈显著负相关性，而与精子的活率无显著相关性，是少精子症、弱精子症和畸形精子症形成的重要因素（Gandini L et al.,2000;Chen Z et al.,2006;Zhang HB et al.,2008;Lv YiQing et al.,2009）较高的凋亡指标检测水平已经被证实与精子穿透卵母细胞的能力呈负相关性。与正常能穿透卵母细胞的精子相比，低穿透能力的精子往往含有很高的凋亡率（Grunewald et al.,2008）。精子凋亡指标的流式细胞仪检测方法：PS翻转：Annexin V-FITC/PI检测MMP：JC-1检测阴性对照阳性结果凋亡中期：CP3活化率检测凋亡晚期（精子DNA碎片化）：1、TUNEL（脱氧核糖核酸N末端标记法）检测2、SCSA（精子染色质结构分析法）检测SCSA检测结果示意图（Evenson PD et al.,Sperm Chromatin Structure Assay:Its Clinical Use for Detecting Sperm DNA Fragmentation in Male Infertility and Comparisons With Other Techniques,Journal of Andrology,2002）SCSA评估精子DNA碎片化的指标：1、HDS：精子DNA高染性指数，代表精子染色质结构的致密性。HDS10%，表示染色质结构不致密，精子DNA容易损伤，与核蛋白的组型转换相关。2、DFI：精子DNA碎片化指数，代表精子DNA的损伤率。DFI15%：表示DNA碎片含量低，具有生育的潜能；16%DFI30%：表示DNA碎片含量中等，存在一定的不育风险；DFI30%：表示DNA碎片含量高，生育潜能低下。精子DNA碎片化检测的意义：1、不育、自发流产、胚胎停育病因分析2、妊娠结局的预测3、辅助生殖助孕方式的选择（Lara Tamburrino et al.,Mechanisms and clinical correlates of sperm DNA Damage,Asian Journal of Andrology(2012)14,2431）近几年国外对精子DNA碎片化研究情况汇总表46精子精子DNA碎片检测与碎片检测与ART选择选择46精子DNA碎片与IVF/ICSI关系47 我中心采用SCSA方法对经体外密度梯度离心纯化前后的精子DFI和HDS进行了研究，发现处理后HDS明显降低，而DFI在HDS5%时，会明显升高。说明体外精子优化处理对精子DNA损伤的程度因精子染色质致密程度不同而不同。因此在实施IVF或者ICSI时，应检测精子的DFI和HDS。对于那些不成熟较高的精子，应考虑使用其它的体外优化方法，以免对精子DNA产生损伤，降低流产风险。DFI正常结果示意图DFI异常结果示意图南方医科大学华银检验中心SCSA结果示意图诱发精子凋亡因素的流式细胞仪检测1、精子ROS损伤流式细胞仪检测：二氯荧光乙酰乙酸盐（DCFH-DA）是一种可以通过细胞膜的染色剂，一旦被过氧化氢等氧化，便产生荧光。通过DCFH-DA与PI配套使用，可以鉴别活精子的ROS损伤程度。2、精液全白细胞（CD45）流式细胞仪检测：采用FITC标记鼠抗人CD45单克隆抗体，可以特异性检测精液中全部的白细胞。通过加入等量的已知浓度的荧光计数微球可以实现对精液白细胞群的绝对计数，并能区分活力白细胞与死亡白细胞。多参数联合检测是精子功能流式细胞仪检测技术发展的方向。我们在参考大量国外文献的基础上，创立了多指标联合检测精液的FCM技术，并引入精子顶体特异性标记物CD46，从而实现了对精子浓度、凋亡、质膜完整性和顶体完整性的同步联合检测。我们称之为精子受精能力FCM检测技术。六、精子功能流式细胞仪检测的发展精子受精能力FCM检测结果示意图。Q4-1为质膜完整的活力精子群，Q1-1为死亡精子群，Q3-1为早期凋亡的精子群，Q2-1为晚期凋亡的精子群，Q4为发生自发顶体反应的活力精子群，Q2为顶体外膜消失的死亡精子群。1、精子凋亡的研究，为临床诊断男性不育的病因、研究治疗路径开辟了新的方向。2、流式细胞学检测技术在男科学领域的应用，使得传统以形态学检查为主的男性精液分析步入了细胞分子生物学水平。3、多激发光、多参数联检的新流式细胞术，必将为未来的男科学研究提供更广阔的视野。七、总结与展望谢 谢！联系电话：13823752861联系邮箱：