Pyrosequencing技术及其应用guangzhou

Pyrosequencing Technology-PyroMarkTM ID DNA分析系统Jiabing CaoApplication DepartmentGene Company Ltd关于关于BiotagePyrosequencing这项专利技术完全由Biotage公司拥有Biotage的前身即Pyrosequencing AB 成立于1997年，总部位于瑞典第三大城市Uppsala2003年并购另外两家公司后更名为Biotage AB 公司通过直接销售部门及代理商已向全世界40多个国家提供了超过600套Pyrosequencing系统随着Pyrosequencing技术应用领域的不断拓展，近两年来，其市场也呈现快速增长的趋势作为一家高技术公司，强大的技术支持队伍是我们引以为傲的资源超过30的职员从事客户与技术支持工作A New Light on Genetic Analysis一种全新的基于酶级联反应的新型遗传定量分析技术一套完整的实验方案；诸多领域的广泛应用 挑战你的极限想象力Pyrosequencing遗传分析技术遗传分析技术PyrosequencingTM technologyPPiATPlighttime C G TT CC A CC T N 相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况N 峰高与掺入的核苷酸数量成正比N 多余的dNTP在加入下一种dNTP前就被降解PyrogramPyrosequencing焦磷酸测序技术的特点焦磷酸测序技术的特点J唯一得到定量序列结果的技术J极高的准确性Built-In QCJ重现性极佳，接近100%J通用型技术平台功能多样，应用领域极广可以用于任何遗传多态性的分析甲基化研究的最佳平台高通量、低成本,快速临床微生物诊断手段J实验设计灵活J自动化程度高，操作简单As easy as PCR，as reliable as sequencingJ强大的技术支持E S G C T A G T A G A GC/CE S G C T A G T A G A GT/TE S G C T A G T A G A GC/TWhat are”Inbuilt Controls”?Since Pyrosequencing shows polymorphisms with sequence context,you can always trust the validity of the data.1分子的dNTP掺入，释放出1分子的PPi，生成1分子的ATP，产生单位强度的光信号T GG CC GGG T C A C G A GG CCC TA.Triple DoubleSingleWhy Pyrosequencing is quantitative？1.00.00.50.50.01.0Expected1.09 0.050.550.560.021.05Average0.02 n.d.0.030.03n.d.0.03CVC/CC/GG/Gn=190PyrosequencingPyrosequencing：Quantitative Accuracy TestQuantitative Accuracy TestPyrosequencingPyrosequencing：facilityfacility&convenienceconvenience实验设计方便，使用Assay Design SW方便快速设计反应的最佳引物。实验快速，96个样本，SNP反应10分钟左右，SQA测序反应1小时左右，2分钟完成数据结果分析。实验准确性好，重复性高：准确性接近99重复性接近100l高通量，一次可以完成96个不同样本的反应和分析。l自动化程度高，准备好PCR单链后，反应和结果分析软件自动进行，利于标准化。l操作简单，方便学习和使用。As easy as PCR，as reliable as sequencingPyrosequencing 的运用遗传变异方面遗传变异方面What Pyrosequencing can do in Genetic Variation AnalysisJ SNP AnalysisJ Insertion and DeletionJ Mutation AnalysisJ Allele Frenquency DeterminationJ CpG Methylation Estimation JGene Copy NumberJTranscription EstimationPyrosequencingPyrosequencingTMTM 技术运用于技术运用于SNPSNP与突变的研究与突变的研究SNPDiscoverySNPConfirmationAlleleFrequencySNPRelevanceSNPDiagnosticsVerify SNP as true SNPFrequencyof SNP inpopulationsValidate SNPas marker for phenotypeUtilization of SNP markers由于PyrosequencingTM技术可以通过光信号强度来定量，所以除了可以进行双等位点分析外，还可以用于三等位、四等位位点的分析，而且能准确判断纯合与杂合软件设计周到，具备强大的数据处理能力，可以通过一个反应来分析多个相邻位点准确性好，重现性高优势优势lSNPSNP位点在不同人群中的分布频率，是群体遗传位点在不同人群中的分布频率，是群体遗传学研究中的一项重要内容学研究中的一项重要内容l这些位点在正常人群与病人群体中的等位型的这些位点在正常人群与病人群体中的等位型的分布差异分布差异,更是流行病学、分子病理学乃至分子更是流行病学、分子病理学乃至分子诊断的一项重要课题诊断的一项重要课题lPyrosequencingPyrosequencingTMTM 技术结合技术结合PoolingPooling方法运用于方法运用于等位频率分析等位频率分析准确灵敏：定量范围5%-95%甚至更高简便：反应结束后软件自动给出每个样品的等位频率,无需人工进行统计快速：只需其他方法十乃至千分之一的时间低耗：降低时间消耗的同时，成本百倍下降Pyrosequencing：Accurate QuantifyingRelative peak height=peak1 height peak1 height+peak2 heightAllelefrequency=relative peak height x 100(%)Relative peak heightAllele frequency(%)0,0000,1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,9001,000010203040506070809010015%30%75%Pyrosequencing：结合结合Pooling方法进行等位频率分析的技术方法进行等位频率分析的技术60%10%90%5%0%75%50%25%Pooling方法的优势方法的优势省时、省力、省钱省时、省力、省钱Theoretical example:Association study with 1000 SNPs in 1000 healthy individuals and 1000 patients 2 000 000 analyses.Pooling strategy:1.1000 SNPs in 2 sample pools 2.1000 X 2=2 000 analyses2.Discard SNPs that are not informative(99%)3.Analyze 1%(10 SNPs)in 2000 individuals 20 000 analysesIn total:22000 analyses 可以把分析可以把分析SNPSNP的原理同样运用的原理同样运用于分析突变，插入缺失于分析突变，插入缺失PyrosequencingTM 技术运用于甲基化分析研究在许多基因promotor区域，有一种称为CpG Island的结构，其序列的基本单元为CpG的二聚核苷酸。DNA甲基转移酶可以把S-adenosyl-methionine的甲基转移到CpG的C上基因的甲基化往往会引起相应的基因沉默。许多发育相关的基因，大多数情况下均处于甲基化状态，只有在发育的特殊阶段去甲基化表达。甲基化模式是可遗传的。甲基化研究对于了解基因的调控模式以及疾病的分子生物学机制具有重要意义：它与发育、肿瘤发生、基因印迹、X染色体失活及许多遗传性疾病相关Methylation&DiseasesHow to analyze CpG methylation 2.PCR amplificationTCmCU 1.Bisulfite treatment of denatured DNAmCmCCU 3.Analysis:sequencing,MS-PCR,primer extension,restriction enzyme digestion,hybridization or best of all:Pyrosequencing!在重硫酸盐的作用下，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反应转变成了尿嘧啶，但是5-甲基胞嘧啶不发生转变。J能够对每一个潜在甲基化位点的甲基化程度进行定量分析，无需烦琐的克隆以及大量的测序，J基于序列这黄金标准，每个反应都有周边序列作为正负对照Built-in QC不但能帮助判断Pyro反应的准确性，更能判断前处理的完全与否。J一个反应检测多个甲基化位点，使用最新的Pyro Q-CpG软件可以在一个反应中对连续的20多个甲基化位点进行定量分析。J无须重复试验J结果准确Pyrosequencing在基因甲基化研究中的优势在基因甲基化研究中的优势Why Pyrosequencing?Confidently measure the individual degree of methylation in adjacent CpG sites in one easy analysisPos 1Pos 2Pos 3Pos 4Pos 5%methylation at individual CpG sitesPos 2 Pos 1Pos 3 Pos 4 Pos 5Mean value 6 replicatesCV%60.1256.8566.8555.8763.152.92.62.71.72.9Why Pyrosequencing?Built-in QC through sequence contextSequence:C/TGGGGC/TGAGATTATC/TGTC/TGATAGC/TGGGGGWhy Pyrosequencing?Nature-Born QC for completion of the bisulfite treatmentBefore bisulfite treatment:After bisulfite treatment and PCR:GCGGTCAGTGACGCGATGGAGCGGGCGYGGTTAGTGAYGYGATGGAGYGGGTAny C not followed by a G gives bisulfite QCPyro Q-CpG 软件专门用于甲基化研究的软件结合PyroGold SQA 试剂盒，可以对100bp序列内的20多个甲基化位点进行定量分析。实验设计更方便，特别对多个连续的甲基化位点检测具体巨大优势。需要的PCR引物盒测序引物更少，更加节约试剂，降低实验成本。骨髓增生异常综合征 髓系白血病 PyrosequencingTM 技术运用于临床辅助诊断Pyrosequencing：临床检验的未来临床检验的未来载脂蛋白E（APOE）与脂类转运及脂蛋白代谢密切相关APOE的编码基因有3种最常见的等位基因型：e2，e3和e4三者之间的主要区别在于2个位点的多态性所导致APOE蛋白112位及158位氨基酸替换 3种等位基因在不同的人群中有不同的分布 e3是在人群中分布最为普遍的e4 会提高总胆固醇浓度，增加晚发性家族型及散发性AD的发病风险，提早发病年龄；是胎儿期因碘缺乏引起的智力缺陷的风险因子；还与肾病及糖尿病的发病有关 e2则能够降低总胆固醇及AD的发病几率，同时可能与长寿相关Pyrosequencing：临床检验的未来临床检验的未来SP SNP112 SP SNP158FPRPB-GGACGTG-CCTGCACRCGCCGG-TGCAGAA-ACGTCTTCRCGGAC-Pyrosequencing：临床检验的未来临床检验的未来通过一个Duplex反应，对一段276bp的PCR产物内的这两个SNP位点同时进行分析，以确定受试者的apoe基因型，达到预警及辅助诊断的目的。Pyrosequencing：临床检验的未来临床检验的未来e4/e4e2/e2e3/e4e2/e3Pyrosequencing：检测试剂盒：检测试剂盒Pyrosequencing：临床检验的未来临床检验的未来F 用Pyrosequencing技术分析RET基因Exon10、11、13、14、16中的共9个突变位点F 对217个MEN2阴性及230个MEN2阳性患者进行检测F 阴性符合率100%，阳性符合率99.6%Conclusion：Pyrosequencing technology offers an accurate,nonisotopic,simple,and rapid method for the analysis of DNA from patients suspected of having MEN2.多发性内分泌腺瘤病 Pyrosequencing与与HLA分型分型PyrosequencingTM 技术运用于药物基因组学研究Different alleles Variability in enzyme activity Individualized drugs/dose?Pyrosequencing Application：CYP450 Variation&CYP450 Variation&PharmacogeneticsPharmacogeneticsCYP是一个超基因家族目前已知的基因数目超过2400个所有基因均源于同一个ancestor gene (before euc/proc div.)其产物通常都包含一个Heme group,催化多种代谢反应CYP与绝大多数临床使用的药物的代谢均密切相关，尤其是CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19 Application：CYP450 Variation&CYP450 Variation&PharmacogeneticsPharmacogeneticsMajor alleles covered,more in pipelineGCACAGG.A2549del(allele 3)TGC/TG.C2850T(allele 2)ACA/CTCCGGA2935C(allele 7)Theretical outcome NormalNormalHeterozygous allele 3A/-Heterozygous allele 2C/TApplication：CYP2D6 Multiplex assay(alleles 2,CYP2D6 Multiplex assay(alleles 2,3,73,7)CAGTGGGTG.T1707del(allele 6)TCCG/TGT.G1758T(allele 8)AG/AGACGCCC.G1846A(allele 4)Theoretical outcome NormalNormalHomozygous allele 4A/AHeterozygous allele 6T/-Application：CYP2D6 Multiplex assay(alleles CYP2D6 Multiplex assay(alleles 4 4,6,86,8)TCCC/TGGG.G681A(allele 2)ATC/TCAGGGGG.G636A(allele 3)GCTTCAA/GTGG.A1G(allele 4)Normal*1*2C/T*1*4G/ATheoretical outcome for NormalApplication：CYP2C19CYP2C19 Multiplex assay(alleles Multiplex assay(alleles 2 2,3,43,4)N基因印记与遗传性疾病基因印记与遗传性疾病 西拉综合症，贝-威，普-威/安格尔曼综合症N癌症癌症 基细胞及鳞状上皮细胞癌，腺瘤型息肉，乳癌，结肠/直肠癌，皮肤癌，白血病，前列腺癌，恶性黑色素瘤，纤维神经瘤，vulvar cancer，再生障碍性贫血，何杰金病，肺癌，宫颈癌，卵巢癌，子宫内膜癌N心血管疾病，冠心病心血管疾病，冠心病N阿尔海默兹综合症阿尔海默兹综合症N自体免疫失调自体免疫失调 爱迪生氏病，即肾上腺性青铜性皮肤病，关节银屑病，系统性红斑狼疮，风湿性关节炎，重症肌无力 N血液学血液学 血色素紊乱，血小板凝集增强，某些因子的缺陷，May-Hegglin anomaly（一种血小板减少性疾病）/Fechtner syndrome，慢性骨髓性白血病，移植后的排斥，HLA分型 N神经病学及神经病遗传学神经病学及神经病遗传学 癫痫，肌强直性营养不良，多样性硬化，良性（家族）新生儿（初期）癫痫，脑梗塞，帕金森，神经管缺陷，肌萎缩性脊索侧索硬化，进行性核上眼神经麻痹症，神经退行性共济失调，精神分裂症，皮克症，孤独症频谱异常，惊恐障碍，痴呆症，忧郁症N其它：其它：What Pyrosequencing can do in Genetic Variation AnalysisMicrobiology AnalysisMicrobiology Analysis微生物分析微生物分析 DNA sequence from the P3 region of the rnpB gene in Streptococcus pneumoniaePyrosequencing在微生物领域的应用在微生物领域的应用l细菌综合鉴定分型l病毒的鉴定分型l真菌的鉴定分型l微生物抗药性分析Conventional vs Molecular methodsL传统方法传统方法表型测试表型测试需要培养耗时长受环境的影响，变数多判断困难，有时需倚仗经验，有主观性有一些微生物培养上很复杂，难以鉴定J分子方法分子方法无需培养快速准确即便是死样本也可以进行分型PyroMark ID：ApproachN确定研究对象及相关种群N寻找特征 差异基因F16S rRNA,18S,23SFrnpBFrpoBFinlBNAssay Design Software：在目标基因的保守区设计PCR及测序引物N焦磷酸法测定可变区序列NIdentiFire Software：与数据库比对，确定分型结果WorkflowDNA制备样品收集样品收集/培养培养鉴定与分型结果鉴定与分型结果PCR扩增单链模板制备单链模板制备Pyrosequencing数据库搜索数据库搜索/结果比对结果比对15 min40 min 1 min/sample10 min30 min 2 hrsAntibiotic resistance抗药性研究抗药性研究Antibiotic resistance in MycobacteriaRifampicin（利福平）mutations in the rpoB geneIsoniazide（异烟肼）mutations in the katG geneFluoroquinolones（对苯二酚）gyrALinezolide(利奈唑胺)resistance mutations in 23SEthambutol（乙胺丁醇）embBPyroMarkTM IDComplete solution for Clinical MicrobiologyPyrosequencing 系统平台系统平台Assay Design SW Sample Prep PyrosequencingFeaturing Pyro Gold chemistryIdentiFireTM SWPyrosequencing 技术的流程技术的流程PCR试样预处理，获得单链模板P Pyrosequencingyrosequencing序序序序列分析列分析列分析列分析15 min/96 samperSQA:35 min/96 samperSNP:10min/96 samper1-2h/96 samper结果分析结果分析C/TC/T T/TT/T实验设计实验设计Pyrosequencing is Pyrosequencing is worldwidelyworldwidely used usedGenomics CollaborativeNIHUC DavisHarvard Center for Cancer PreventionYale UniversityHoward UniversityHospital for Sick ChildrenMax Planck InstituteBaylor College of MedicineRIKENKarolinska InstituteNCIGerman Armed ForcesNASA AstraZeneca GlaxoSmithKline Merck Schering-Plough Abbott Janssen Pharmaceutica,NV Bayer AG Biogen CuraGen Corporation DuPont Agriculture Lynx Therapeutics Genzyme 第四军医大学全军基因诊断中心 中科院健康中心 上海仁济医院，上海肺科医院 上海CDC，江苏省CDC 南京第二人民医院 上海晶泰生物技术有限公司全球全球 600 customers25 accounts with 2 or more systemsPyrosequencing is worldwidely usedThanks for Your Attention!PyroMark PlatformInstrumentationReagent KitsVacuum prep workstationIdentiFire SoftwareAssay Design SoftwareSoftware实验流程单链的分离纯化Pyrosequencing反应PCR反应反应PCR ReactionPCR产物长度，最好在200bp以内PCR Primer之一标记生物素，使用HPLC纯的生物素标记引物生物素标记的引物量不要过多（10pmol in 50uL PCR reaction），否则会干扰结果50uL体系，做50个循环可以在agarose胶上检测PCR产物，需要得到单一、较强的条带分离纯化单链分离纯化单链-设备Vacuum Prep Workstation膜泵废液缸工作台配有真空计真空开关五个水槽位置两个反应板位置Vacuum Prep ToolFilter probes re-usable at least 100 times准备试剂在使用前让所有试剂达到室温第一次使用kit时，使用18.2M纯水溶解酶和底物，延瓶内壁缓缓加入水，轻轻摇晃使其溶解，不要剧烈，尽量避免产生气泡试剂舱若长期未使用，请重新清洗，并待完全干燥后再使用把试剂加入试剂舱根据每次实验的样品，按软件给出的需要试剂的体积分别加入到试剂舱中，加入试剂时注意：把试剂舱的标签面对自己，按下图所示的孔位置加入，千万不能加错位置。The reagents in CartridgePyrosequencing 测序反应打开仪器，仪器需要预热90min，所以应早点打开打开电脑和软件设定SNP entry，设定的是所分析的序列信息（SNP Simples Entries New Entry)设定SNP Run，设定本次反应的信息，如反应孔以及反应每孔的样品（SNP SNP Run New SNP Run)把经过试样预处理的PSQ96板放置在仪器上，把加好试剂的试剂舱放置在仪器上，试剂舱放置时应把有标签的一面对外测序反应PyroMarkTM ID SNP softwareSNP Entry用户建立SNP/突变序列数据库输入待分析的序列，如：A/GGGCAGATCCTTG.软件自动计算各种基因型的理论结果Set up a runDuring the runQuality assessed dataAfter run立即清洗试剂舱，清洗得当的情况下，可以重复使用20次，在试剂舱标出使用的次数如果两周以上不会再使用仪器的话，则关闭仪器，否则的话，使仪器保持打开状态（关机时注意：先通过软件关机，再关闭仪器上的电源）退出PyroMarkTM ID软件如实验中有液体溅出，请清洁仪器