2013动物细胞工程

一、动物细胞培养一、动物细胞培养1 1、选材：、选材：瓶盖不拧紧瓶盖不拧紧为什么选用胚胎或幼龄动物为什么选用胚胎或幼龄动物第二节第二节 动物细胞工程动物细胞工程2 2、营养、营养:3 3、条件：、条件：4 4、过程、过程5、结果：、结果：原理原理无菌操作无菌操作无毒培养无毒培养转转入入培培养养液液中中进行进行原代培养原代培养贴贴满满瓶瓶壁壁的的细细胞胞用用胰胰蛋蛋白白酶酶处处理理分散成单个细胞，制成细胞悬液分散成单个细胞，制成细胞悬液取动物组织块取动物组织块剪碎组织剪碎组织制成细胞悬液制成细胞悬液培养基成分？培养基成分？状态？状态？放入放入COCO2 2培养箱中培养箱中放入放入COCO2 2培养箱中培养箱中用胰蛋白酶处理用胰蛋白酶处理分散成单个细胞分散成单个细胞接触抑制分分瓶瓶转转入入培培养养液液中中进进行行传传代代培养培养产物：产物：细胞群细胞群（细胞株、细胞系）（细胞株、细胞系）过过程程检测目的基因产物？检测目的基因产物？二、动物细胞融合与单克隆抗体的制备二、动物细胞融合与单克隆抗体的制备（一）动物细胞融合：（一）动物细胞融合：取材取材、原理、促融方法、最常用的用途、原理、促融方法、最常用的用途（二）（二）单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 产生抗体的细胞？产生抗体的细胞？能否增殖？能否增殖？无限增殖的细胞？无限增殖的细胞？大量的同种抗体大量的同种抗体大量的同种效应大量的同种效应B B细胞细胞一个效应一个效应B B细胞细胞（单克隆抗体单克隆抗体）分泌分泌分裂（克隆）分裂（克隆）何种细胞能何种细胞能无限增殖？无限增殖？怎样获得既怎样获得既能无限增殖能无限增殖又又能产生一种抗体能产生一种抗体的细胞？的细胞？假设：假设：单克隆抗体单克隆抗体.swf一种效应一种效应B B细胞只能产生一种抗体细胞只能产生一种抗体什么细胞？什么细胞？为何选用小鼠的？为何选用小鼠的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞灭活的病毒或灭活的病毒或PEG诱导融合诱导融合脾中含有多种脾中含有多种B细胞细胞多种细胞？多种细胞？筛选出能产生特异抗筛选出能产生特异抗体的体的一个一个杂交瘤细胞杂交瘤细胞取材取材基本步骤：基本步骤：两次筛选：两次筛选：单抗单抗 笔记笔记单克隆抗体单克隆抗体.swf家用早早孕诊断家用早早孕诊断治疗：生物导弹治疗：生物导弹应用应用19751975年年KohlerKohler和和MilstinMilstin成功获得单克隆抗体，由于单克隆抗体与成功获得单克隆抗体，由于单克隆抗体与血清抗体相比具有非常明显的优点，因而得到广泛的应用。单克隆血清抗体相比具有非常明显的优点，因而得到广泛的应用。单克隆抗体制备技术被誉为抗体制备技术被誉为“免疫学上的一次技术革命免疫学上的一次技术革命”。下列有关单克。下列有关单克隆抗体的叙述中错误的是隆抗体的叙述中错误的是 A A、组成单克隆抗体的基本单位是氨基酸、组成单克隆抗体的基本单位是氨基酸B B、单克隆抗体仅特异地针对同一抗原决定簇进行免疫反应、单克隆抗体仅特异地针对同一抗原决定簇进行免疫反应C C、生物导弹就是一种单克隆抗体、生物导弹就是一种单克隆抗体 D D、单克隆抗体可以广泛应用于疾病的诊断、治疗、单克隆抗体可以广泛应用于疾病的诊断、治疗C C由单克隆抗体研制而成的由单克隆抗体研制而成的“生物导弹生物导弹”由两部分组成，一是由两部分组成，一是“瞄瞄准装置准装置”，二是杀伤性，二是杀伤性“弹头弹头”，下列对此描述不正确的是，下列对此描述不正确的是 A A“瞄准装置瞄准装置”是由识别肿瘤的单克隆抗体构成是由识别肿瘤的单克隆抗体构成B B“弹头弹头”是由放射性同位素、化学药物和毒素等物质构成是由放射性同位素、化学药物和毒素等物质构成C C“弹头弹头”中的药物有选择杀伤肿瘤细胞的功能中的药物有选择杀伤肿瘤细胞的功能D D“生物导弹生物导弹”是利用细胞工程制备出来的是利用细胞工程制备出来的C C肠上皮细胞肠上皮细胞胚胎胚胎三、动物细胞核移植技术三、动物细胞核移植技术是有性生殖是有性生殖的后代吗？的后代吗？与与体细胞核移植体细胞核移植产生的后代的区别产生的后代的区别？19521952年年重组细胞重组细胞？用用胚胎细胞、胚胎细胞、用用肠上皮细胞（体细胞）肠上皮细胞（体细胞）的细胞核进行移植，的细胞核进行移植，哪种更容易成功？哪种更容易成功？哪种细胞哪种细胞数目多、易获得？数目多、易获得？克隆羊克隆羊核移植技术核移植技术动物细胞培养技术动物细胞培养技术胚胎移植技术胚胎移植技术BACC证明了证明了？具有全能性具有全能性电脉冲处理电脉冲处理促使细胞分裂促使细胞分裂1 14 43 31 12 25 5早期胚胎早期胚胎为何克隆羊实验的成功为何克隆羊实验的成功如此引人注目如此引人注目？19971997年年哺乳动物哺乳动物如果克隆人的技术实如果克隆人的技术实现，能有哪些现，能有哪些应用？应用？克隆牛、羊、兔、克隆牛、羊、兔、大熊猫有什么意大熊猫有什么意义义?1 1、用于核移植的细胞一般都选用传代、用于核移植的细胞一般都选用传代1010代以内的细胞，代以内的细胞，为什么？为什么？2 2、核移植产生的克隆动物，是、核移植产生的克隆动物，是100%100%的复制吗？的复制吗？3 3、克隆羊多利的培育过程，是人为地将乳腺细胞的核植入去核的、克隆羊多利的培育过程，是人为地将乳腺细胞的核植入去核的卵细胞内，使其发育为新的个体，它的成功证明了动物的卵细胞内，使其发育为新的个体，它的成功证明了动物的A A、受精卵具有发育为新个体的全部遗传信息、受精卵具有发育为新个体的全部遗传信息B B、卵细胞具有发育为新个体的全部遗传信息、卵细胞具有发育为新个体的全部遗传信息C C、体细胞的细胞核几乎具有发育为新个体的全部遗传信息、体细胞的细胞核几乎具有发育为新个体的全部遗传信息D D、各种体细胞在一定条件下都具有发育为新个体的潜能、各种体细胞在一定条件下都具有发育为新个体的潜能C C细细胞胞工工程程动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养微生物培养微生物培养培养基培养基物理性质物理性质培养基培养基成分成分植物体细胞杂交和动物细胞融合比较植物体细胞杂交和动物细胞融合比较植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合细胞融合的原理的原理变异类型变异类型融合前融合前步骤步骤诱导方法诱导方法融合后融合后步骤步骤用途用途植物细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程技术手段技术手段植物组织培养植物组织培养 植物体细植物体细胞杂交胞杂交动物细胞培养和融合动物细胞培养和融合 单抗单抗制备等制备等特殊处理特殊处理酶解法去除细胞壁酶解法去除细胞壁胰蛋白酶处理制备细胞悬浮胰蛋白酶处理制备细胞悬浮液液融合方法融合方法物理方法物理方法 化学方法化学方法物理方法物理方法 化学方法化学方法 生物生物方法方法典型应用典型应用人工种子人工种子 种间杂交等种间杂交等单克隆抗体的制备等单克隆抗体的制备等培养液区别培养液区别植物激素诱导脱分化和再植物激素诱导脱分化和再分化分化动物血清提供必需营养动物血清提供必需营养某同学学习细胞工程时，列表比较了动植物细胞工程的有关内容某同学学习细胞工程时，列表比较了动植物细胞工程的有关内容你认为有几处错误：你认为有几处错误：A A1 B1 B0 C0 C2 D2 D3 3B B科学家将人体皮肤细胞改造成了多能干细胞科学家将人体皮肤细胞改造成了多能干细胞 iPSiPS 细胞细胞”，人类人类“iPSiPS 细胞细胞”可以形成神经元等人体多种组织细胞。以下有可以形成神经元等人体多种组织细胞。以下有关说法正确的是关说法正确的是A.A.iPSiPS 细胞分化为神经细胞的过程体现了细胞的全能性细胞分化为神经细胞的过程体现了细胞的全能性B.B.iPSiPS 细胞有细胞周期，它分化形成的神经细胞一般不具细胞细胞有细胞周期，它分化形成的神经细胞一般不具细胞周期周期 C.C.iPSiPS 细胞可分化形成多种组织细胞，说明细胞可分化形成多种组织细胞，说明“iPSiPS 细胞细胞”在分在分裂时很容易发生突变裂时很容易发生突变 B B哪些生物技术属于哪些生物技术属于“克隆克隆”？克隆的概念？克隆的概念？那些层次？那些层次？营养生殖（扦插、嫁接）营养生殖（扦插、嫁接）植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养动物个体的克隆动物个体的克隆（应用了体细胞核移植）（应用了体细胞核移植）单克隆抗体单克隆抗体DNADNA扩增扩增扦插扦插克隆克隆-个体水平（植物）个体水平（植物）嫁接嫁接增殖增殖克隆克隆-细胞水平细胞水平 克隆克隆分子水平分子水平 1 1、英国科学家维尔穆特首次用羊的体细胞（乳腺细胞）成功地培、英国科学家维尔穆特首次用羊的体细胞（乳腺细胞）成功地培育出一只小母羊，取名育出一只小母羊，取名“多利多利”，这一方法被称之为，这一方法被称之为“克隆克隆”，以，以下四项中与此方法在本质上最相近的是下四项中与此方法在本质上最相近的是A A、将兔的早期胚胎分割后，分别植入两只母兔的子宫内，并最终、将兔的早期胚胎分割后，分别植入两只母兔的子宫内，并最终发育成两只一样的兔子发育成两只一样的兔子B B、将人的抗病毒基因嫁接到烟草、将人的抗病毒基因嫁接到烟草DNADNA分子上，培育出具有抗病毒能分子上，培育出具有抗病毒能力的烟草新品种力的烟草新品种C C、将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞、将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞D D、将人的精子与卵细胞在体外受精，待受精卵在试管内发育到囊、将人的精子与卵细胞在体外受精，待受精卵在试管内发育到囊胚期时，再植入女性子宫内发育成胚期时，再植入女性子宫内发育成“试管婴儿试管婴儿”A A育种技术小结育种技术小结名称名称原理原理关键步骤关键步骤特点特点杂交育种杂交育种基因工程基因工程多倍体多倍体单倍体单倍体植物体细胞植物体细胞杂交杂交诱变育种诱变育种生长素育种生长素育种2 2、图中、图中A A至至D D方向所示的育种方式，方向所示的育种方式，（1 1）ABCABC的育种方式，这两种育种方式中后者的优越性主要表的育种方式，这两种育种方式中后者的优越性主要表现在现在_。B B常用的方法为常用的方法为_ _（2 2）E E方法所用的原理是方法所用的原理是_，所用的方法如，所用的方法如_、_。（3 3）C C、F F过程中最常采用的药剂是过程中最常采用的药剂是_，其作用的原理，其作用的原理_。（4 4）由）由G G到到J J的过程中涉及的生物工程技术有的过程中涉及的生物工程技术有_和和_ _ K K过程的实现首先要过程的实现首先要_，之后要加，之后要加_等试等试剂诱导融合剂诱导融合 3 3、两个亲本的基因型分别为、两个亲本的基因型分别为AAbbAAbb和和aaBBaaBB，这两对基因按自由组合，这两对基因按自由组合定律遗传定律遗传,要培育出基因型为要培育出基因型为aabbaabb的新品种，最简捷的方法是的新品种，最简捷的方法是A A单倍体育种单倍体育种 B B杂交育种杂交育种 C C人工诱变育种人工诱变育种 D D细胞工程育种细胞工程育种 B B细胞工程本章结构本章结构板书、牢记板书、牢记内容总结内容总结植物组织培养1.原理：细胞全能性 （1）概念：具有发育成完整个体的潜能。（2）原因：具有某种生物全部遗传信息。（3）全能性大小：受精卵全能性最大 受精卵配子体细胞；胚胎干细胞造血干细胞血细胞 （4）多细胞个体内细胞全能性不体现的原因 基因的选择性表达：个体内特定的时间空间条件下，细胞中基因选择性表达出各种蛋白质，进而构成不同的组织器官。（5）激发全能性：离体细胞，各种条件2.步骤离体的组织、细胞 愈伤组织 丛芽、丛根 完整个体3.培养基成分有机营养、无机营养、激素（生长素、细胞分裂素）、琼脂（固体培养基）胚状体 脱分化再分化植物组织培养4.应用：（1）快速繁殖：子代与亲代相同（独立使用不属于育种）；（2）脱毒苗：利用茎尖（含病毒几率小）作为材料；（3）人工种子：胚状体+人工种皮（4）获得代谢产物：只需要培养到愈伤组织即可。植物体细胞杂交植物体细胞杂交（一）过程（一）过程植物细胞植物细胞A种种植物细胞植物细胞B种种原生质体原生质体A原生质体原生质体B纤维素酶和果胶酶纤维素酶和果胶酶融合原生质体融合原生质体再生细胞壁再生细胞壁杂种细胞杂种细胞杂种植株杂种植株一、去除细胞壁一、去除细胞壁二、二、诱导融合诱导融合：物理：离心、振动、电刺激：物理：离心、振动、电刺激 化学：聚乙二醇化学：聚乙二醇三、植物组织培养三、植物组织培养（二）融合原理：膜具有流动性（二）融合原理：膜具有流动性 变异类型：染色体变异变异类型：染色体变异（三）意义：克服不同生物远缘杂交：例：属间，种间杂交（三）意义：克服不同生物远缘杂交：例：属间，种间杂交动物细胞培养（基础技术）动物细胞培养（基础技术）（一）过程（一）过程胚胎、幼龄动物等组织、器官胚胎、幼龄动物等组织、器官剪碎、剪碎、胰蛋白酶胰蛋白酶处理处理单个细胞单个细胞贴壁生长贴壁生长至至接触抑制接触抑制胰蛋白酶胰蛋白酶处理、分至多瓶处理、分至多瓶可培养可培养10代、代、50代，甚至无限传代（癌变）代，甚至无限传代（癌变）原代培养原代培养传代培养传代培养（二）培养条件（二）培养条件 1.无菌、无毒无菌、无毒 2.营养：糖（葡萄糖）、氨基酸、无机盐、水、维生素、血清（或血浆）（液营养：糖（葡萄糖）、氨基酸、无机盐、水、维生素、血清（或血浆）（液体培养基）体培养基）3.pH、温度稳定、温度稳定 4.气体环境：气体环境：O2、CO2（维持（维持pH稳定，需要用稳定，需要用CO2培养箱）培养箱）动物体细胞核移植动物体细胞核移植体细胞（胚胎细胞）体细胞（胚胎细胞）细胞核细胞核去核卵细胞去核卵细胞杂种细胞杂种细胞胚胎移植胚胎移植重组胚胎重组胚胎个体个体过程过程+取出取出体现了动物细胞体现了动物细胞细胞核细胞核的全能性的全能性单克隆抗体一、过程一、过程抗原抗原效应效应B细胞细胞动物动物如小鼠如小鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞聚乙二醇或聚乙二醇或灭活病毒灭活病毒诱导融合诱导融合筛选筛选出出杂交瘤细胞杂交瘤细胞进一步进一步选出选出产出产出目的抗体目的抗体的的一个一个杂交瘤细胞杂交瘤细胞体外、体内大量增殖体外、体内大量增殖分泌分泌大量大量单克隆抗体单克隆抗体动物细胞培养（克隆细胞）动物细胞培养（克隆细胞）二、优点：特异性、灵敏度高二、优点：特异性、灵敏度高三、应用：检测；生物导弹：单抗三、应用：检测；生物导弹：单抗+药物药物生物导弹生物导弹制备过程应用了动物制备过程应用了动物细胞融合及动物细胞细胞融合及动物细胞培养技术培养技术进行两次筛选进行两次筛选关于关于“克隆克隆”小结小结一、概念：无性繁殖一、概念：无性繁殖二、类型：二、类型：DNA DNA水平（分子水平）水平（分子水平）PCRPCR技术技术 细胞水平细胞水平单克隆抗体、动物单克隆抗体、动物(植物植物)细胞培养、细胞培养、微生物培养微生物培养 个体水平个体水平扦插、嫁接、植物组织培养、核移植、扦插、嫁接、植物组织培养、核移植、胚胎分割胚胎分割植物体细胞杂交和动物细胞融合比较植物体细胞杂交和动物细胞融合比较植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合细胞融合的原理的原理膜具有流动性膜具有流动性变异类型变异类型染色体变异染色体变异融合前融合前步骤步骤去除细胞壁去除细胞壁分散细胞分散细胞诱导方法诱导方法物理（离心、振荡、电激）物理（离心、振荡、电激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法灭活的病毒灭活的病毒融合后融合后步骤步骤植物组织培养植物组织培养细胞培养细胞培养用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养微生物培养微生物培养培养基培养基物理性质物理性质固体固体液体液体固体固体/液体液体培养基培养基成分成分糖、氨基酸、无糖、氨基酸、无机盐、水、维生机盐、水、维生素、血清（血浆）素、血清（血浆）有机营养、有机营养、无机营养、无机营养、激素、激素、琼脂琼脂碳源、氮源、水、碳源、氮源、水、无机盐无机盐动物细胞培养、植物组织培养、微生物培养培养基小结动物细胞培养、植物组织培养、微生物培养培养基小结名称名称原理原理关键步骤关键步骤特点特点杂交育种杂交育种基因重组基因重组杂交、自交、筛选杂交、自交、筛选基因工程基因工程基因重组基因重组1 1、获取目的基因、获取目的基因2 2、构建表达载、构建表达载体体3 3、导入受体细胞、导入受体细胞4 4、目的基因、目的基因检测与鉴定检测与鉴定定向、克服生殖定向、克服生殖隔离隔离多倍体多倍体染色体变异染色体变异秋水仙素处理秋水仙素处理个体大，有机物个体大，有机物多；例：多；例：3N3N，无，无籽西瓜籽西瓜单倍体单倍体染色体变异染色体变异花药离体培养花药离体培养单倍体单倍体秋水仙秋水仙素处理素处理纯合正常倍体纯合正常倍体育种时间短育种时间短植物体细胞植物体细胞杂交杂交染色体变异染色体变异去壁去壁原生质体融合原生质体融合植物组织植物组织培养培养克服远缘生殖隔克服远缘生殖隔离离诱变育种诱变育种基因突变基因突变人工诱变，选择人工诱变，选择产生新基因，提产生新基因，提高突变频率高突变频率生长素育种生长素育种生长素促使生长素促使子房壁发育子房壁发育花蕾期去雄，涂生长素，套袋花蕾期去雄，涂生长素，套袋不可遗传变异不可遗传变异例：无籽番茄例：无籽番茄育种技术小结育种技术小结使用秋水仙素处理：多倍体育种、单倍体育种；使用秋水仙素处理：多倍体育种、单倍体育种；使用植物组织培养：基因工程、单倍体育种、植物体细胞杂交使用植物组织培养：基因工程、单倍体育种、植物体细胞杂交