目的基因获得

会计学1目的基因获得目的基因获得 三、目的基因的获得三、目的基因的获得限制酶酶切直接分离法限制酶酶切直接分离法PCRPCR扩增法扩增法从从mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA化学合成法化学合成法通过构建基因文库分离法通过构建基因文库分离法第1页/共103页 对对已已克克隆隆在在载载体体中中的的目目的的基基因因，可可根根据据目目的的基基因因两两侧侧的的限限制制酶酶识识别别序序列列，选选择择适当的限制酶酶切，获得目的基因。适当的限制酶酶切，获得目的基因。（一）限制酶酶切直接分离法（一）限制酶酶切直接分离法注意：目的基因内部不能有该限制酶的切点，否则目的基因会被切成碎片！第2页/共103页Ampr5AOX1HIS4Kanr3AOX1ColE1pPIC9K/hVEGF165EcoR INot IBgl IIhVEGF165Bgl II9.8 KbTTSAmpr5 AOX1HIS4Kanr3 AOX1ColE1 pPIC9K 9.3 KbBgl IIBgl IISnaB IEcoR IAvr IINot ISTTf1oriAmprlacZpGEM-T/hVEGF165hVEGF1653.5 Kb第3页/共103页 （二）（二）PCRPCR法扩增目的基因法扩增目的基因 利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。PCRPCR(p polymerase olymerase c chain hain r reaction)eaction)：第4页/共103页以目的基因为模板，合成互补的新DNA链。双链DNA解链为单链DNA；引物与模板单链DNA的特定互补部位配对、结合；退火：变性：延伸：变性退火延伸第5页/共103页 30th cycle？由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，即Y=2n(n为循环次数)。230(109)copies第6页/共103页PCR技术的发明-DNA操作技术的革命发明人：美国生化学家Kary B.MullisThe Nobel Prize in Chemistry 1993 Mullis KB.The unusual origin of the polymerase chain reaction.Scientific American.1990,262(4):56-61,64-5.1990.04Mullis KB.Dancing naked in the mind fields.1998.04第7页/共103页1983.03 开汽车时的联想：蜿蜒崎岖的山路-DNA双螺旋 行驶的汽车-一小段DNA引物1972 在加州大学伯克利分校获得博士学位1979 进入私人生物技术公司Cetus 1983.08 正式做有关PCR原理的报告1983.09 Mullis开始动手做实验 1984.11 首次取得可信结果1985.01 Randall Saiki加入，结果毋庸置疑 第8页/共103页1985.03 Cetus公司申请专利 1985.12 Saiki RK,Scharf SJ,Faloona FA,Mullis KB,Horn GT,Erlich HA,Arnheim N.Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science.1985,230(4732):1350-4.1986.05 冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会 1987.01 Mullis KB,Faloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction.Methods in Enzymology.1987,155:335-50.第9页/共103页1991.12 Cetus以$3亿将专利卖给Hoffmann-La Roche公司 1986.06 Saiki等将耐热DNA聚合酶-Taq酶引入PCR技术。Saiki RK,Gelfand DH,Stoffel S,Scharf SJ,Higuchi R,Horn GT,Mullis KB,Erlich HA.Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.Science.1988,239(4839):487-91.1988.011989 Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。1986.09 Mullis离开Cetus公司第10页/共103页Eppendorf Bio-rad ABI第11页/共103页PCRPCR法扩增目的基因的前提：法扩增目的基因的前提：已知目的基因全序列或其两侧序列，已知目的基因全序列或其两侧序列，化学合成与模板互补的上、下游引物。化学合成与模板互补的上、下游引物。第12页/共103页 TaqTaq酶酶无无3355外外切切酶酶活活性性，无无阅阅读读校校正正功功能能，在在扩扩增增过过程程中中会会引引起起错错配配，3030次循环次循环TaqTaq酶错配率约酶错配率约0.250.25。措施：问题：问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。可能造成目的基因碱基序列的改变。原因：选择高保真Taq酶，如Pfu。第13页/共103页因因TaqTaq酶对酶对dATPdATP具有优先聚合活性。具有优先聚合活性。55AAAAPCRPCR扩增产物扩增产物55 由由TaqTaq酶酶扩扩增增的的PCRPCR产产物物，33末末端端总总是是带带有有一一个个非非模模板板依依赖赖型型的的突突出出碱碱基基，而而这这个个碱碱基基几几乎乎总是总是A A，TT载体载体TTTT5555TT77laclacZZMCMCSSorioriAmpAmprr可用T载体克隆。第14页/共103页 （三）从（三）从mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA 以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，然后在Klenow酶作用下合成双链cDNA。第15页/共103页 此法适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白mRNA的比例占总mRNA的90%以上。第16页/共103页 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%。高丰度mRNA：低丰度mRNA：第17页/共103页步骤：dNTdNTPP 逆转录酶逆转录酶primerprimer逆转录酶催化合成cDNA第一链 mRNA mRNA cDNA cDNA钓取目的基因的mRNA mRNAmRNA逆转录酶逆转录酶逆转录酶去除mRNA-cDNA杂交链中的mRNA链 cDNA cDNAKlenowKlenow酶酶dNTP dNTP Klenow酶合成cDNA第二链 cDNA cDNA cDNA cDNA第18页/共103页钓取目的基因的mRNA：与oligo(dT)碱基互补的mRNA结合到柱上，非mRNA(tRNA、rRNA）流走。总mRNAoligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤维素柱oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)oligo(dT)纤维素柱总RNA1 1）提提 取取 特特 定定 组组 织织 或或 细细 胞胞 的的 总总 RNARNA，用用oligo(dT)oligo(dT)纤纤维素柱分离总维素柱分离总mRNAmRNA。第19页/共103页2）根据已知基因序列合成DNA探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化特定mRNA。与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特定mRNA 探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA纤维素柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA纤维素柱总mRNA第20页/共103页克隆平端双链克隆平端双链cDNAcDNA的方法：的方法：平端直接与载体连接；平端直接与载体连接；平端接同聚尾；平端接同聚尾；加装人工接头加装人工接头(adapter)(adapter)；加装衔接物加装衔接物(linker)(linker)。第21页/共103页加装同聚物尾：加装同聚物尾：利用TdT，在双链cDNA和载体3端加互补的同聚物尾，退火连接成重组分子。1972年，斯坦福大学P.Labban和P.Kaiser发明。CCCCCCCCCCCCdCTPTdT cDNA53载体53GGGGGGGGGGGGdGTPTdTCCCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGGGT4 DNA ligase第22页/共103页加装人工接头(adapter)1978年，康奈尔大学吴瑞发明。adapter是人工合成的一头具有某种限制酶的粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。GTCG CAGCTTAA53EcoR I adapter第23页/共103页注意：adapter易通过粘端碱基配对形成二聚体。GTCG CAGCTTAA53 AATTCGAC GCTG35 AATTCGAC GCTGGTCGCAGCTTAA 5335T4 DNA ligase 将adapter连接到双链cDNA的两端，直接成为人工粘端。第24页/共103页CIP去除adapter的5-P，使5-P成为5-OH。5 P-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-P533CIP5OH-GTCG-OHOH-CAGCTTAA-OH533措施：第25页/共103页加装衔接物(linker):linker是人工合成的一段由10-12个核苷酸组成、具有一个或多个限制酶识别序列的平末端双链寡核苷酸短片段。EcoR I linker5TGGAATTCCAACCTTAAGGT533第26页/共103页 将双链cDNA与linker连接，再用限制酶酶切，可产生粘性末端。第27页/共103页 （四）化学合成法（四）化学合成法19791979年，成功合成年，成功合成E.coliE.coli酪氨酸酪氨酸tRNAtRNA基因。基因。-ScienceScience1976年，H.G.Khorana提出用化学方法合成 基因的设想；第28页/共103页已知目的基因的DNA序列。化学合成法的前提：第29页/共103页小片段粘接法小片段粘接法补钉延长法补钉延长法大片段酶促法大片段酶促法 战略：战略：化学合成的DNA片断一般局限在200bp以内。第30页/共103页1 1）小片段粘接法：）小片段粘接法：分别合成分别合成12-1512-15bpbp的单链的单链DNADNA小片段。小片段。混合退混合退火火T4 DNA ligaseT4 DNA ligase 片断之间有互补区，混合退火形成有断点的双链，再由T4 DNA ligase连接成完整双链。第31页/共103页2 2）补钉延长法：）补钉延长法：混合退混合退火火 片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用KlenowKlenow酶酶延伸成完整双链。延伸成完整双链。T4 DNAT4 DNA ligaseligase KlenowKlenow 分别合成分别合成12-1512-15bpbp的单链的单链DNADNA小片段及小片段及20-3020-30bpbp的单链的单链DNADNA中片段。中片段。第32页/共103页3 3）大片段酶促法：）大片段酶促法：分别合成分别合成40-5040-50bpbp的单链的单链DNADNA大片段。大片段。混合退混合退火火T4 DNAT4 DNA ligaseligase Klenow Klenow 片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整双链。第33页/共103页化学合成的份额较大，成本较高。化学合成的份额较大，成本较高。大片段化学合成的收率极低，如合成50bp的DNA单链大片段的总收率仅7.7%。三种方法各有利弊：三种方法各有利弊：小片段粘接法：小片段粘接法：大片段酶促法：化学合成化学合成DNADNA的单链片段愈短，收率愈高；的单链片段愈短，收率愈高；化学合成的份额较小，成本较低；第34页/共103页 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。第35页/共103页 DNA合成仪是根据固相亚磷酰胺三酯法原理设计的。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。第36页/共103页DNA合成仪 基因合成一般都是自己设计序列，交给商业公司合成。第37页/共103页DNADNA化学合成的用途：化学合成的用途：合成天然基因修饰改造基因设计新型基因合成测序或PCR引物制备寡核苷酸探针制备人工接头(adaptor)和衔接物(linker)第38页/共103页合成天然基因：合成天然基因：有些组织特异性有些组织特异性mRNAmRNA含量很低，很难用含量很低，很难用cDNAcDNA法克隆。法克隆。有些基因比较短，化学合成费用较低。有些基因比较短，化学合成费用较低。如：生长激素释放抑制激素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等。第39页/共103页合成寡核苷酸探针合成寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)(oligonucleotide probe)：根据已知核酸序列，用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，作为探针使用。若未知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸序列倒推出核酸序列，但需考虑 密码子的简并性。第40页/共103页大多数氨基酸拥有简并密码子。某段连续的氨基酸序列:Cys Met Asp Glu Met Lys可能的DNA序列:TGTATGGACGAAATGAAA C T G G 设计系列探针:TGTATGGACGAAATGAAATGTATGGACGAGATGAAATGTATGGATGAAATGAAATGTATGGATGAGATGAAATGTATGGACGAAATGAAGTGTATGGACGAGATGAAGTGTATGGATGAAATGAAGTGTATGGATGAGATGAAGTGCATGGACGAAATGAAATGCATGGACGAGATGAAATGCATGGATGAAATGAAATGCATGGATGAGATGAAATGCATGGACGAAATGAAGTGCATGGACGAGATGAAGTGCATGGATGAAATGAAGTGCATGGATGAGATGAAG第41页/共103页 （五）通过构建基因文库分离目的基因五）通过构建基因文库分离目的基因基因库基因库 (gene pool)gene pool)基因文库基因文库 (gene library or gene(gene library or gene bank)bank)基本概念基本概念:第42页/共103页是特定生物体全基因组的集合是特定生物体全基因组的集合（天然存在天然存在）。）。基因库基因库 ：第43页/共103页 是从特定生物个体中分离的全部基因，是从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆形式存在这些基因以克隆形式存在（人工构建人工构建）。）。基因文库：基因文库：第44页/共103页根据构建方法的不同，基因文库分为：基因组文库基因组文库 (genomic DNA library)(genomic DNA library)cDNAcDNA文库文库 (cDNA library)(cDNA library)第45页/共103页基因组文库：基因组文库：cDNAcDNA文库：文库：含全部基因含全部基因。含全部蛋白质编码的结构基因。含全部蛋白质编码的结构基因。鸟枪法构建；鸟枪法构建；材料来自染色体材料来自染色体DNADNA；cDNAcDNA法构建；法构建；材料来自材料来自mRNAmRNA；第46页/共103页1、基因组文库 将将某某种种生生物物基基因因组组DNADNA经经超超声声波波或或限限制制酶酶部部分分酶酶切切处处理理后后，与与载载体体连连接接，转转化化宿宿主主细胞，得到细胞，得到含全部基因含全部基因的克隆群体。的克隆群体。第47页/共103页1 1、基因组、基因组DNADNA的制备：的制备：制制备备的的DNADNA分分子子量量越越大大，切切割割后后含含不不规规则则末末端端DNADNA片片段段的的比比率率越越低低，重重组组率率和和完备性越高。完备性越高。基因组文库的构建基因组文库的构建 为为最最大大限限度度保保证证基基因因的的完完整整性性，基基因因组组DNADNA在分离纯化操作中应在分离纯化操作中应避免过度断裂避免过度断裂。第48页/共103页 常规方法制备的染色体DNA长度一般100kb，如先将细胞固定在低熔点琼脂糖凝胶，再置于含SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1,000kb的DNA片段。第49页/共103页 一般采用一般采用超声波超声波和和限制酶部分酶切限制酶部分酶切法。法。保证保证DNADNA片段大小均一。片段大小均一。2 2、基因组、基因组DNADNA的切割：的切割：目的：目的：保证保证DNADNA片段之间存在部分重叠区；片段之间存在部分重叠区；第50页/共103页超声波处理：超声波处理：处理后处理后的的DNADNA片段呈平末端，片段呈平末端，需加装人工接头。需加装人工接头。第51页/共103页产产生生粘粘性性末末端端，可可与与常常用用克克隆隆位位点点（如如BamBamH IH I、Bgl Bgl II II）连接连接。部分酶切法：部分酶切法：部部 分分 酶酶 切切 片片 段段 大大 小小 可可 控控，可可 得得 到到 15-15-45kb45kb的随机片断；的随机片断；选用选用4 4bpbp识别序列的限制酶，如识别序列的限制酶，如SauSau3A3A。第52页/共103页3 3、载体和受体的选择、载体和受体的选择构建大型基因组文库（动植物和人类），选构建大型基因组文库（动植物和人类），选择择BACBAC或或YACYAC。根据载体，选择E.coli、Yeast。常选常选-DNA-DNA或或CosmidCosmid；受体：载体：载体：第53页/共103页第54页/共103页第55页/共103页在基因组文库构建中，最应引起重视的问题：在基因组文库构建中，最应引起重视的问题：尽量提高载体与外源尽量提高载体与外源DNADNA片段的连接效率！片段的连接效率！根据载体的装载量，将根据载体的装载量，将DNADNA片段片段分级分离分级分离；利用利用CIPCIP，去除载体的，去除载体的5-P5-P；利用利用TdTTdT，在，在DNADNA片段的片段的3-OH3-OH加同聚尾。加同聚尾。措施：措施：第56页/共103页基因文库的完备性：基因文库的完备性：是指在构建的基因文库中任一基因存在的是指在构建的基因文库中任一基因存在的概率概率P P，与基因文库最低所含克隆数，与基因文库最低所含克隆数NN的关系：的关系：NN=ln(1=ln(1P P)/ln(1)/ln(1f f)P P=基因文库的完备性（某一基因被克隆的概率）基因文库的完备性（某一基因被克隆的概率）f f=克隆片段平均大小克隆片段平均大小/生物基因组大小生物基因组大小 第57页/共103页N N=ln(1=ln(1P P)/ln(1)/ln(1f f)如如：人人单单倍倍体体DNADNA长长2.92.9 10106 6kbkb，克克隆隆片片段段平平均均大大小小1515kbkb，构构建建完完备备性性0.90.9的的基基因因文文库库，至至少少需需4545万万个个克克隆隆；当当完完备备性性提提高高至至0.99990.9999时时，至至少少需需180180万万个克隆。个克隆。即即：为为保保证证某某一一基基因因以以99.99%99.99%的的机机率率至至少少被被克克隆隆1 1次次，需需构构建建含含180180万万个个不不同同重重组组克克隆隆的的基基因因文库，这时克隆片段总和为整个基因组的文库，这时克隆片段总和为整个基因组的 倍。倍。9.3第58页/共103页即：为保证某一基因以99.99%的机率至少被克隆1次，需构建含180万个不同重组克隆的基因文库，若1个基因文库的插入片段总和为整个基因组的10倍以上，就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。第59页/共103页基因文库的质量标准：基因文库的质量标准：除除尽可能高的完备性尽可能高的完备性外，理想的基因文库还应具备：外，理想的基因文库还应具备：重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。克隆总数不宜过大，克隆总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；以减轻筛选工作的压力；载体的装载量必须大于基因的长度；载体的装载量必须大于基因的长度；含有相邻含有相邻DNADNA片段的重组克隆之间，需存在足够长度的重叠区，片段的重组克隆之间，需存在足够长度的重叠区，以利于克隆排序；以利于克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；第60页/共103页基因组文库的保存基因组文库的保存基因组文库的保存基因组文库的保存影印滤膜保存法影印滤膜保存法保存文库于液体培养基中保存文库于液体培养基中保存单个克隆子于液体培养基中保存单个克隆子于液体培养基中第61页/共103页1）影印滤膜保存法：第62页/共103页2 2）保存文库于液体培养基中）保存文库于液体培养基中 从平板上挑取全部克隆，接种于含适当抗生素的液体培养基中，混合的细菌生长数代后，加入终浓度25%的甘油，-70保存。缺点：由于文库菌落生长的不均匀性，可能导致文库中某些特定序列过多或过少。第63页/共103页3 3）保存单个克隆子于液体培养基中）保存单个克隆子于液体培养基中 从平板上挑选单个克隆，接种于含适当抗生素的液体培养基中，菌体生长至一定浓度时，加入终浓度25%的甘油，-70保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。第64页/共103页从从基因组基因组文库中筛选目的基因文库中筛选目的基因 大型基因组文库由数十万甚至上百万个重组克隆组成，除一些具特殊功能的蛋白质编码基因（如抗药性基因）可用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选）直接筛选外，一般均需多轮操作步骤。第65页/共103页密集铺板（密集铺板（1-101-10万）万）杂杂交交挖挖取取铺铺板板目的重组克隆目的重组克隆铺铺板板根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选第66页/共103页通过构建基因组文库获取目的基因的问题：该方法仅适用于原核基因的分离，较少采用。不能除去真核生物目的基因的内含子结构。工作量大，需了解目的基因的背景知识；不能获得最小长度的目的基因；第67页/共103页“鸟枪法(shotgun)”：又称“散弹法”用限制酶部分酶切染色体DNA将酶切片段克隆入载体转化受体细胞并扩增分离带有目的基因的DNA片段筛选目的重组子第68页/共103页用“鸟枪法”获取目的基因：缺点：操作简便。工作量大；具有一定的盲目性。优点：第69页/共103页优点：保证目的基因的完整性，提高目的重组子 的出现频率，简化操作。鸟枪法操作的改进：-使用特定限制酶完全酶切染色体DNA。前提：已知目的基因的酶切图谱。策略：用目的基因两端的限制酶完全酶切染色体 DNA，然后与载体拼接。第70页/共103页2.0 kb1.6 kb1.8 kb如：如：已已 知知 目目 的的 基基 因因 位位 于于1.81.8kbkb的的Sal Sal I I片片段段中中，将将染染色色体体DNADNA用用Sal Sal I I切切开开，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳分分离离，切切下下 1.6-2.0kb1.6-2.0kb区区 域域 内内 的的 凝凝胶胶块块，从从此此凝凝胶胶中中回回收收DNADNA片段，与载体连接。片段，与载体连接。第71页/共103页基因组文库重组克隆的排序基因组文库重组克隆的排序 构构建建大大型型基基因因组组文文库库技技术术上上并并不不困困难难，若若文文库库插插入入片片段段总总和和为为基基因因组组的的1010倍倍以以上上，就就能能从其中调出任何一段从其中调出任何一段DNADNA序列。序列。然然而而基基因因文文库库的的克克隆隆是是随随机机序序列列，必必须须将将所所有有克克隆隆排排列列成成一一个个像像天天然然染染色色体体DNADNA上上所所表表现出的信息顺序。现出的信息顺序。-这项工作的工作量远大于文库构建。这项工作的工作量远大于文库构建。第72页/共103页酶切片段末端标记法酶切片段末端标记法随机探针联合杂交法随机探针联合杂交法染色体走读法染色体走读法基因组文库重组克隆的排序方法：第73页/共103页酶切片段末端标记法：酶切片段末端标记法：1 1、将将单单一一YACYAC克克隆隆插插入入DNADNA片片段段用用限限制制酶酶均均匀匀地水解成若干片段，末端标记同位素。地水解成若干片段，末端标记同位素。HHHH载体载体DNADNA克隆克隆DNADNA第74页/共103页22、然后用、然后用SauSau3A3A将末端标记的将末端标记的DNADNA片段降解成碎片，片段降解成碎片，PAGEPAGE电泳，每电泳，每1010个个YACYAC克隆走在一块板上，形成克隆走在一块板上，形成1010个克隆的特征性个克隆的特征性DNADNA指纹图谱。指纹图谱。SSSSSSS SSS SSSSSSS SS1010克隆指纹图谱克隆指纹图谱1 2 3 4 5 6 7 8 9 10第75页/共103页33、电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆、电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNADNA的指纹图谱有部分相同，二者就有互相重叠的可能性，在染色体上则可能是排列一起的。的指纹图谱有部分相同，二者就有互相重叠的可能性，在染色体上则可能是排列一起的。1010克隆指纹图谱克隆指纹图谱1 2 3 4 5 6 7 8 9 10第76页/共103页随机探针联合杂交法：随机探针联合杂交法：1 1、将将若若干干YACYAC克克隆隆固固定定在在薄薄膜膜上上，复复制制2020份份薄薄膜膜；合成合成2020种不同序列的短探针（序列随机）。种不同序列的短探针（序列随机）。0101 02 02 03 03 04 04 05 05 06 06 07 07 08 08 09 09 10 101111121213131414151516161717181819192020AA BB C C DD EE FFGG第77页/共103页2 2、用用2020种种探探针针随随机机定定位位杂杂交交（1 1对对1 1）2020份份YACYAC克克隆隆薄薄膜膜。若若某某2 2个个克克隆隆同同时时对对同同一一种种探探针针呈呈现现杂交阳性反应，则这杂交阳性反应，则这2 2个克隆有可能相互重叠。个克隆有可能相互重叠。01 01 02 02 03 03 04 04 05 05 06 06 07 0708080909 10 101111121213131414151516161717181819192020AA BB C C DD EE FFGG20个随机探针第78页/共103页3 3、若若将将杂杂交交阳阳性性结结果果记记为为“1”“1”，可可清清晰晰地地列列成成一张表，最终排出上述一张表，最终排出上述YACYAC克隆的排列顺序。克隆的排列顺序。01010202030304040505060607070808090910101111121213131414151516161717181819192020DDAABBCCEEFFGG111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111第79页/共103页01010404121206061313141402021414070719191111151505050808161603031010090920201818DDAABBCCEEFFGG111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111FFCCAADDGGEEBB第80页/共103页1 1、从从基基因因文文库库中中任任取取1 1个个克克隆隆作作为为染染色色体体走走读读的的起起点点，将将其其两两端端序序列列分分别别亚亚克克隆隆，亚亚克克隆隆片片段在段在0.50.5-2.0kb-2.0kb范围内。范围内。染色体走读法染色体走读法(chromosome walking)(chromosome walking)：走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列第81页/共103页22、以亚克隆、以亚克隆DNADNA片段为探针，与基因文库杂交，阳性克隆中的插入片段为探针，与基因文库杂交，阳性克隆中的插入DNADNA片段必定与起点克隆所含的片段必定与起点克隆所含的DNADNA片段连锁在一起。片段连锁在一起。走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列亚克隆旁测序列 探针标记探针标记第一轮杂交第一轮杂交阳性克隆阳性克隆阳性克隆阳性克隆第82页/共103页3 3、再再以以阳阳性性克克隆隆片片段段的的两两端端序序列列为为探探针针，进进行行第二步走读，直至线型染色体第二步走读，直至线型染色体DNADNA的端点。的端点。阳性克隆阳性克隆阳性克阳性克隆隆第二轮杂第二轮杂交交第二轮杂交第二轮杂交第83页/共103页走读的起点克隆片段走读的起点克隆片段第84页/共103页 将某种生物基因组转录的全部mRNA通过反转录合成cDNA，与载体连接，转化宿主细胞，得到含全部表达基因的克隆群体。2、cDNA文库第85页/共103页信息量远小于基因组文库，容易构建；具有时空性和组织细胞特异性。cDNA文库的特点：不含内含子序列；可以在细菌中直接表达；包含该生物全部蛋白质编码的结构基因；第86页/共103页 在高度分化的生物体中，不同组织或细胞在相同时段、相同环境背景下，mRNA种类、表达水平也不同。同一组织或细胞在不同时段、不同环境背景下，mRNA种类、表达水平不同。具有时空性和组织细胞特异性：第87页/共103页 cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此具有时空性和组织细胞特异性。第88页/共103页cDNA文库的构建总 RNA提取mRNA的分离纯化cDNAcDNA第一链的合成第一链的合成cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成第89页/共103页1）总RNA提取：商业化试剂盒。第90页/共103页 利用mRNA含polyA尾，将其从总RNA中分离纯化，mRNA只占总RNA的1-2%。2）mRNA的分离纯化：商业化oligo(dT)纤维素柱。哺乳动物mRNA长度为0.5-8.0kb，大部分为1.5-2.0kb。第91页/共103页第92页/共103页3 3）cDNAcDNA第一链的合成：第一链的合成：cDNAcDNA第一链第一链mRNAmRNAAAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3TTTTTTTTTTTTTTT 5TTTTTTTTTTTTTTT 5AAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3TTTTTTTTTTTTTTT 5TTTTTTTTTTTTTTT 5引物引物退火退火逆转录逆转录酶酶dNTPdNTPss55pppppp55GG55pppppp55GG55pppppp55GG第93页/共103页4 4）cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成 自身引导法自身引导法置换合成法置换合成法引导合成法第94页/共103页自身引导法：自身引导法：AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA 33TTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTT 55SS11KlenowKlenowdNTPsdNTPsTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 55AAAAAAAAAAAAAA 3AAAAAAAAAAAAAA 3NaONaOHHTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 55OHOH 33AAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 5555pppppp55GG获得的双链获得的双链cDNA cDNA 55端会有几对碱基缺失。端会有几对碱基缺失。第95页/共103页置换合成法：置换合成法：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 55DNA pol IDNA pol IRNaseRNaseHH55 AAAA AAAA 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 55AAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA 33 55pppppp55GGSS11T4-DNA T4-DNA ligaseligase55TTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTT 5533AAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA 33获得的双链获得的双链cDNA cDNA 55端也会有几对碱基缺失。端也会有几对碱基缺失。TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 5 555AAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA 33DNA pol IdNTPs第96页/共103页引导合成法：引导合成法：33 CCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTT 55NaOHNaOHAAAAA AAAAA 33TTTTTTTTTT 5533 55pppppp55GGdCTPdCTPTdTTdTAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCC 3333 CCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTT 5555pppppp55GG获得的双链获得的双链cDNAcDNA能保留完整的能保留完整的55端序列。端序列。33 CCCCCCCCCCCCCCTTTTTTTTTT 5555 GGGGGGG GGGGGGGAAAAAAAAAA 33KlenowKlenowdNTPsdNTPs5 GGGGGGG oligo(dG)第97页/共103页载体和受体的选择载体和受体的选择选择E.coli。选择选择plasmidplasmid。因绝大多数真核生物因绝大多数真核生物的的mRNAmRNA1010kbkb。受体：载体：载体：第98页/共103页从从cDNAcDNA文库中筛选目的基因文库中筛选目的基因根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选根据目的基因特异性表达进行筛选第99页/共103页根特异性表达的目的基因差显杂交筛选法示意图菌落转膜菌落转膜菌落转膜菌落转膜杂交杂交杂交杂交 根总mRNA探针叶总mRNA探针 根cDNA文库叶cDNA文库根cDNA文库叶cDNA文库阴性反应克隆子阳性反应克隆子第100页/共103页总总mRNAmRNA总总mRNAmRNAcDNAcDNA第一链第一链双链双链cDNAcDNA单链单链cDNAcDNA克克隆隆共价交联共价交联上柱上柱正常正常FR3T3FR3T3细胞细胞多瘤病毒感染多瘤病毒感染的的FR3T3FR3T3细胞细胞病毒诱导表达基因病毒诱导表达基因的的cDNAcDNA克隆克隆菌落原位杂菌落原位杂交交标记探针第101页/共103页通过构建通过构建cDNAcDNA文库文库获取目的基因的问题：获取目的基因的问题：仅限于克隆蛋白质编码基因。仅限于克隆蛋白质编码基因。并非所有的并非所有的mRNAmRNA分子都具有分子都具有polyApolyA结构；结构；细菌等原核生物的细菌等原核生物的mRNAmRNA半衰期很短；半衰期很短；mRNAmRNA在细胞中含量少，对酶和碱极敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极敏感，分离纯化困难；分离纯化困难；第102页/共103页