生化试验设计

会计学1生化试验设计生化试验设计最熟悉 而又最而又最陌生陌生 血红蛋白血红蛋白的分离、纯化，鉴定的分离、纯化，鉴定和定量和定量第1页/共26页试验报告单试验报告单实验目的实验原理实验试剂实验步骤实验结果临床意义第2页/共26页实验目的实验目的1，掌握自主设计实验的步骤与方法；，掌握自主设计实验的步骤与方法；2,血红蛋白的分离、纯化、鉴定和定量的方血红蛋白的分离、纯化、鉴定和定量的方法；法；3,熟悉血红蛋白分离提纯的原理。熟悉血红蛋白分离提纯的原理。第3页/共26页实验原理实验原理血红蛋白概况血红蛋白概况 血红蛋白是红细胞的主要成分，在血红蛋白是红细胞的主要成分，在血红蛋白是红细胞的主要成分，在血红蛋白是红细胞的主要成分，在正常情况下，每个红细胞均含有一正常情况下，每个红细胞均含有一正常情况下，每个红细胞均含有一正常情况下，每个红细胞均含有一定量的血红蛋白。血红蛋白是由珠定量的血红蛋白。血红蛋白是由珠定量的血红蛋白。血红蛋白是由珠定量的血红蛋白。血红蛋白是由珠蛋白和亚铁血红素组成的结合蛋白蛋白和亚铁血红素组成的结合蛋白蛋白和亚铁血红素组成的结合蛋白蛋白和亚铁血红素组成的结合蛋白质。血红蛋白除能与氧结合形成氧质。血红蛋白除能与氧结合形成氧质。血红蛋白除能与氧结合形成氧质。血红蛋白除能与氧结合形成氧合血红蛋白外，还能与某些物质作合血红蛋白外，还能与某些物质作合血红蛋白外，还能与某些物质作合血红蛋白外，还能与某些物质作用形成多种血红蛋白衍生物。它们用形成多种血红蛋白衍生物。它们用形成多种血红蛋白衍生物。它们用形成多种血红蛋白衍生物。它们具有特定的色泽和吸光谱，在临床具有特定的色泽和吸光谱，在临床具有特定的色泽和吸光谱，在临床具有特定的色泽和吸光谱，在临床上，可用以诊断某些变性血红蛋白上，可用以诊断某些变性血红蛋白上，可用以诊断某些变性血红蛋白上，可用以诊断某些变性血红蛋白血症和血红蛋白的定量测定。血症和血红蛋白的定量测定。血症和血红蛋白的定量测定。血症和血红蛋白的定量测定。第4页/共26页实验原理实验原理基本原理基本原理n n根据蛋白质各种特性的差异，如蛋白质的理化性质、形状、大小、电荷性质和多少、吸附性质、亲和力、溶解度等等，可以用来分离不同种类的蛋白质第5页/共26页试验原理试验原理不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不一样，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不一样。凝胶电泳法原理凝胶色谱法原理透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留袋内，以达到清除小分子杂质的目的。透析法原理当不同蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶的内部通道，而相对分子质量较大的蛋白质无法进入内部通道只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。标准比色法原理在一定量的血液中，在一定量的血液中，血红蛋白经少量的盐血红蛋白经少量的盐酸的作用，使亚铁血酸的作用，使亚铁血红素变成高铁血红素。红素变成高铁血红素。呈现较稳定的棕色，呈现较稳定的棕色，用水稀释后与标准色用水稀释后与标准色比较，即可得出每比较，即可得出每100ml100ml血液中的含量血液中的含量第6页/共26页实验试剂实验试剂1、0.9%的氯化钠溶液2、蒸馏水 3、有机溶剂（甲苯）4、磷酸缓冲液 5、柠檬酸钠 6、凝胶色谱柱实验所需用品凝胶色谱柱实验所需用品7、SDS-PAGE实验所需用品8、血红蛋白计、0.1mol/L盐酸溶液、载玻片、刺血针第7页/共26页实验步骤实验步骤样品处理样品处理a、洗涤红细胞：在采血容器、洗涤红细胞：在采血容器中加入适量中加入适量柠檬酸钠柠檬酸钠，取血后，取血后，进行低速短时间离心，将离心进行低速短时间离心，将离心后的血液静置片刻，待分层明后的血液静置片刻，待分层明显后，用胶头吸管吸出上层黄显后，用胶头吸管吸出上层黄色透明血浆，然后用五倍体积色透明血浆，然后用五倍体积的质量分数为的质量分数为0.9%的氯化钠的氯化钠溶液洗涤，低速短时间离心，溶液洗涤，低速短时间离心，重复重复4-5次，直至上清液中没次，直至上清液中没有黄色，表明已洗净。有黄色，表明已洗净。第8页/共26页实验步骤实验步骤样品处理样品处理n nb b、血红蛋白的、血红蛋白的、血红蛋白的、血红蛋白的释放：加蒸馏水释放：加蒸馏水释放：加蒸馏水释放：加蒸馏水到原血液体积，到原血液体积，到原血液体积，到原血液体积，再加再加再加再加40%40%体积的体积的体积的体积的甲苯甲苯甲苯甲苯，置于磁力，置于磁力，置于磁力，置于磁力搅拌器上充分搅搅拌器上充分搅搅拌器上充分搅搅拌器上充分搅拌拌拌拌1010分钟。分钟。分钟。分钟。第9页/共26页实验步骤实验步骤样品处理样品处理n nc c、离心：将搅拌好的混合液、离心：将搅拌好的混合液、离心：将搅拌好的混合液、离心：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以转移到离心管内，以转移到离心管内，以转移到离心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心的速度离心的速度离心1010分钟，分钟，分钟，分钟，试管中的溶液会分为四层：最试管中的溶液会分为四层：最试管中的溶液会分为四层：最试管中的溶液会分为四层：最上层为无色透明的甲苯层；中上层为无色透明的甲苯层；中上层为无色透明的甲苯层；中上层为无色透明的甲苯层；中上层为白色薄层固体的脂溶性上层为白色薄层固体的脂溶性上层为白色薄层固体的脂溶性上层为白色薄层固体的脂溶性物质的沉淀层；中下层为红色物质的沉淀层；中下层为红色物质的沉淀层；中下层为红色物质的沉淀层；中下层为红色透明的血红蛋白的水溶液层；透明的血红蛋白的水溶液层；透明的血红蛋白的水溶液层；透明的血红蛋白的水溶液层；最下层为暗红色其他杂质的沉最下层为暗红色其他杂质的沉最下层为暗红色其他杂质的沉最下层为暗红色其他杂质的沉淀层。淀层。淀层。淀层。第10页/共26页实验步骤实验步骤样品处理样品处理n nd d、分离血红蛋白溶、分离血红蛋白溶、分离血红蛋白溶、分离血红蛋白溶液：用滤纸过滤，液：用滤纸过滤，液：用滤纸过滤，液：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，除去脂溶性沉淀层，除去脂溶性沉淀层，除去脂溶性沉淀层，在分液漏斗中静置在分液漏斗中静置在分液漏斗中静置在分液漏斗中静置片刻后片刻后片刻后片刻后，分离出分离出分离出分离出下层红色透明液下层红色透明液下层红色透明液下层红色透明液体。体。体。体。第11页/共26页粗分离粗分离n n取取取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入透析袋中，将透析袋放入透析袋中，将透析袋放入透析袋中，将透析袋放入盛有盛有盛有盛有300ml300ml的物质的量浓度的物质的量浓度的物质的量浓度的物质的量浓度为为为为20mmol/L20mmol/L的的的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液磷酸缓冲液磷酸缓冲液中，中，中，中，pHpH为为为为7.07.0，透析，透析，透析，透析1212小时，小时，小时，小时，目的是除去样品中分子量目的是除去样品中分子量目的是除去样品中分子量目的是除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样较小的杂质或用于更换样较小的杂质或用于更换样较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液。透析袋一品中的缓冲液。透析袋一品中的缓冲液。透析袋一品中的缓冲液。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又般用硝酸纤维素制成，又般用硝酸纤维素制成，又般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。称玻璃纸。称玻璃纸。称玻璃纸。第12页/共26页纯化纯化a、凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔底塞的制作：打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。（注意事项：底目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。（注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。离不彻底。顶塞的制作：打孔顶塞的制作：打孔安装玻璃管。）安装玻璃管。）组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安安装其他附属结构。装其他附属结构。第13页/共26页n nb b、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填n n凝胶的选择：凝胶的选择：材料：交联葡聚糖凝胶（材料：交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。n n凝胶的前处理凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。n n凝胶色谱柱的装填方法凝胶色谱柱的装填方法：A A、固定：将色谱柱装置固定在支、固定：将色谱柱装置固定在支架上。架上。B B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。n n注意注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。第14页/共26页c c、样品加入与洗脱：、样品加入与洗脱：调节缓冲液面调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。闭出口。滴加透析样品滴加透析样品：吸管吸：吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱洗脱：小心加入：小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml5ml收集一收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）谱柱制作成功）注意注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸、使吸管管口沿管壁环绕移动。管管口沿管壁环绕移动。第15页/共26页鉴定鉴定（SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳）n n1，安装垂直板，安装垂直板电泳装置电泳装置第16页/共26页鉴定鉴定（SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳）2，制胶：，制胶：（分离胶和浓缩胶）（分离胶和浓缩胶）3，样品预处理，样品预处理上样上样第17页/共26页鉴定鉴定（SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳）n n4，电泳n n +n n 染色n n +n n 脱色第18页/共26页鉴定鉴定（SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳）n n5，分析，分析marker蛋白质相对分子质量的对数蛋白质SDS复合物的迁移率第19页/共26页血红蛋白含量的测定血红蛋白含量的测定n n用滴管加用滴管加0.1mol/L HCl0.1mol/L HCl于血红蛋白稀释管内，到刻于血红蛋白稀释管内，到刻度度1010处。用刺血针刺破指尖采血，血滴宜大些。处。用刺血针刺破指尖采血，血滴宜大些。用血红蛋白吸管的尖端接触血滴，吸血至刻度用血红蛋白吸管的尖端接触血滴，吸血至刻度20ul20ul处（处（0.02ml0.02ml）。用滤纸片或棉球擦净吸管口周）。用滤纸片或棉球擦净吸管口周围的血液，将吸管插入血红蛋白稀释管的盐酸内，围的血液，将吸管插入血红蛋白稀释管的盐酸内，轻轻吹出血液至管底部，反复吸入并吹出稀释管轻轻吹出血液至管底部，反复吸入并吹出稀释管内上层的盐酸，洗涤吸管多次，使吸管内的血液内上层的盐酸，洗涤吸管多次，使吸管内的血液完全洗入稀释管内。摇匀或用小玻璃棒搅匀后，完全洗入稀释管内。摇匀或用小玻璃棒搅匀后，放置放置10min10min，使盐酸与血红蛋白充分作用。，使盐酸与血红蛋白充分作用。n n 把稀释管插入标准比色架两色柱中央的空格把稀释管插入标准比色架两色柱中央的空格中，使无刻度的两侧面位于空格的前后方，便于中，使无刻度的两侧面位于空格的前后方，便于透光和比色。透光和比色。n n 第20页/共26页n n用滴管向稀释管内逐滴加入蒸用滴管向稀释管内逐滴加入蒸馏水，边滴边搅拌边观察颜色，馏水，边滴边搅拌边观察颜色，直至颜色与标准玻璃色柱相同直至颜色与标准玻璃色柱相同为止。稀释管上液面的刻度读为止。稀释管上液面的刻度读数即为每数即为每100ml血液血红蛋白的血液血红蛋白的克数。克数。第21页/共26页实验结果实验结果 血红蛋白参考值 成年男性：成年男性：1.31.5g/L；成年女性：成年女性：1.11.4g/L；儿童：（依年龄而异）儿童：（依年龄而异）1.21.4g/L。第22页/共26页临床意义临床意义 一般来说，在疾病状况下，血红蛋白的增减是与红细胞的改变相平行的，即引一般来说，在疾病状况下，血红蛋白的增减是与红细胞的改变相平行的，即引起红细胞增多的疾病，也会使血红蛋白含量增加。使红细胞减少的疾病，也使血红蛋起红细胞增多的疾病，也会使血红蛋白含量增加。使红细胞减少的疾病，也使血红蛋白含量减少。在贫血时，血液中的红细胞数量和血红蛋白浓度都有不同程度的下降，白含量减少。在贫血时，血液中的红细胞数量和血红蛋白浓度都有不同程度的下降，但不一定按相同的比例变化。有时红细胞数量可以减少很多，而血红蛋白的浓度的降但不一定按相同的比例变化。有时红细胞数量可以减少很多，而血红蛋白的浓度的降低却相对地不那么显著，见于低却相对地不那么显著，见于大细胞性贫血大细胞性贫血，由于单个红细胞所含的血，由于单个红细胞所含的血红蛋白量较正常者为多。相反，也有的红细胞减少得不很多，红蛋白量较正常者为多。相反，也有的红细胞减少得不很多，而血红蛋白浓度却显著降低。例如而血红蛋白浓度却显著降低。例如缺铁性贫血缺铁性贫血，这是由于每个，这是由于每个红细胞的血红蛋白含量比正常明显减少，故血红蛋白减低的程红细胞的血红蛋白含量比正常明显减少，故血红蛋白减低的程度较红细胞减少更为显著。度较红细胞减少更为显著。第23页/共26页临床意义临床意义n n 血红蛋白的增减有生理和病理两种，所以依据检验结果，合理分析病因，做到准确的诊断和治疗是血红蛋白测量的意义所在。第24页/共26页谢谢观赏谢谢观赏第25页/共26页