蛋白质芯片技术

蛋 白 质 芯 片 技 术 一 蛋 白 质 芯 片 技 术 产 生 的 背 景二 蛋 白 质 芯 片 的 概 念三 蛋 白 质 芯 片 的 主 要 特 点四 蛋 白 质 芯 片 的 分 类五 蛋 白 质 芯 片 技 术 的 简 要 操 作 步 骤六 蛋 白 质 芯 片 的 应 用 随 着 人 类 和 其 他 生 物 的 全 基 因 组 序 列 的完 成 ， 人 们 开 始 认 识 到 基 因 仅 仅 是 生 物 体 遗传 信 息 的 载 体 ， 而 生 命 活 动 的 执 行 者 、 表 观性 状 的 体 现 者 则 由 基 因 编 码 的 产 物 蛋 白 质所 行 使 。 基 因 只 是 一 种 编 码 ， 由 它 指 导 细 胞合 成 蛋 白 质 ， 而 几 乎 所 有 的 生 物 化 学 反 应 均发 生 在 复 杂 的 蛋 白 质 分 子 之 间 或 有 蛋 白 质参 与 ， 所 有 的 外 在 表 现 均 由 种 类 繁 多 的 蛋 白质 所 决 定 。 随 着 分 子 生 物 学 技 术 的 发 展 ， 生 物 芯片 技 术 研 究 工 作 不 断 深 入 ， DNA芯 片 技术 被 逐 渐 用 于 对 生 物 样 品 中 核 酸 序 列表 达 的 检 测 和 比 较 研 究 。随 着 DNA芯 片 技 术 的 不 断 成 熟 ， 以 及 基因 研 究 所 取 得 的 令 人 瞩 目 的 成 果 ， 进一 步 推 动 蛋 白 质 功 能 的 研 究 及 相 关 技术 的 发 展 ， 蛋 白 质 芯 片 技 术 因 此 应 运而 生 。 蛋 白 质 芯 片 是 将 各 种 微 量 纯 化 的 蛋 白 质阵 列 在 一 种 高 密 度 的 固 相 载 体 上 ， 并 与待 测 样 品 杂 交 ， 以 测 定 相 应 蛋 白 质 的 性质 、 特 征 以 及 蛋 白 质 与 生 物 大 分 子 之 间的 相 互 作 用 的 方 法 。 1.高 通 量2.灵 敏 度 较 高3.重 复 性 好4.操 作 自 动 化 u按 蛋 白 质 性 质 分 类1.无 活 性 芯 片 ： 将 已 经 合 成 好 的 蛋 白 质 以 高 密 度 阵列 点 样 在 芯 片 上 ， 进 行 杂 交 反 应 。2.有 活 性 芯 片 ： 把 生 物 体 直 接 点 在 芯 片 上 ， 并 原 位表 达 蛋 白 质 。u按 形 式 分 类1.玻 璃 载 玻 片 芯 片 （ 在 玻 璃 表 面 构 建 ）2.3-D胶 芯 片 （ 在 多 孔 凝 胶 垫 上 构 建 ）3.微 孔 芯 片 （ 在 微 孔 板 上 构 建 ） 类 别 特 点玻 璃 表 面 构 建 的蛋 白 质 芯 片 可 以 与 基 因 芯 片 的 制 作 和 检 测 工 具 配 套 使 用 ；很 容 易 蒸 发 ； 不 适 合 用 于 多 步 反 应 ； 造 价 便宜 ； 容 量 较 小 ； 容 易 发 生 交 叉 污 染多 孔 微 胶 垫 上 构建 的 蛋 白 质 芯 片 可 以 与 基 因 芯 片 的 制 作 和 检 测 工 具 配 套 使 用 ；不 易 蒸 发 ； 可 以 用 于 多 步 反 应 ， 但 是 有 其 较固 定 的 缓 冲 条 件 ； 造 价 昂 贵 ； 容 量 较 大 ； 不易 发 生 交 叉 污 染微 孔 板 上 构 建 的蛋 白 质 芯 片 可 以 与 基 因 芯 片 的 制 作 和 检 测 工 具 配 套 使 用 ；不 易 蒸 发 ； 适 用 于 多 步 反 应 ； 造 价 便 宜 ； 容量 较 大 ； 不 易 发 生 交 叉 污 染 操 作 步 骤 提 出 生 物 学 问 题（ 实 验 目 的 ） 样 品 预 处 理（ 重 组 蛋 白 ， 制 备 一 、 二 级 抗 体 ，荧 光 标 记 ， 配 蛋 白 印 记 缓 冲 液 ）生 化 反 应 化 学 偶 合 ， 加 底 物 ，反 应 温 度 和 时 间 ，冲 洗 条 件检 测（ 荧 光 和 比 色 扫 描 或 拍 照 ，参 数 设 置 ）数 据 分 析 和 建 模（ 图 象 量 化 ， 标 准 化 ，采 集 蛋 白 信 息 ， 建 立 模 型 ） 3 蛋 白 质 芯 片 制 备6 1 一 固 相 载 体 及 其 处 理载 体 （ 滴 定 板 、 滤 膜 、 凝 胶 、 载 玻 片 ）二 蛋 白 质 的 预 处 理选 择 具 有 较 高 纯 度 和 完 好 生 物 活 性 的 蛋 白 进 行 溶 解三 点 制 微 阵 列可 使 用 点 制 基 因 微 阵 列 的 商 品 化 点 样 仪 或 喷 墨 法 等四 固 定 微 阵 列 上 的 蛋 白 样 点膜 为 载 体 ： 芯 片 放 入 湿 盒 ,37 C 1h载 玻 片 为 载 体 ： 化 学 修 饰 产 生 醛 基 固 定 蛋 白五 微 阵 列 的 封 闭主 要 封 闭 试 剂 ： BSA 1 化 学 性 固 定化 学 性 配 基 包 括 疏 水 基 团 、 阴 离 子 、 阳 离 子 、 金 属离 子 、 混 合 离 子 等 2 生 物 性 固 定生 物 性 配 基 包 括 受 体 、 配 体 、 酶 、 抗 体 -抗 原 等 1 抗 体由 于 具 有 高 度 的 特 异 性 和 亲 和 性 ， 单 克 隆 抗 体 是 比 较 好 的 一种 探 针 蛋 白 质 。 用 其 构 筑 的 芯 片 可 用 于 检 测 蛋 白 质 的 表 达 丰度 及 确 定 新 的 蛋 白 质 。2 寡 聚 核 苷 酸适 配 体 ,即 寡 聚 核 苷 酸 能 够 作 为 捕 获 分 子 用 于 连 接 蛋 白 质 ，并 且 有 很 高 的 特 异 性 和 亲 和 力 。 3 肽 样 寡 聚 体鉴 于 多 肽 具 有 小 分 子 和 蛋 白 质 的 双 重 优 势 ， 在 蛋 白 质 芯 片 系统 中 ， 多 肽 是 另 一 种 具 有 发 展 前 景 的 捕 获 分 子 。 4 小 分 子 配 体制 备 捕 获 分 子 最 为 有 效 的 方 式小 分 子 配 体 的 鉴 定 主 要 通 过 组 合 文 库 的 方 法 进 行5 重 组 蛋 白纯 化 或 重 组 蛋 白 是 另 一 种 类 型 的 捕 获 分 子 ， 特 别 是 应 用 于 在蛋 白 质 功 能 分 析 方 面 ， 如 蛋 白 质 相 互 作 用 、 翻 译 后 修 饰 、 蛋白 质 -小 分 子 间 相 互 作 用 和 自 身 抗 体 。 重 组 蛋 白 可 以 以 融 合蛋 白 的 形 式 ， 从 体 外 表 达 的 细 菌 系 统 中 分 离 纯 化 。 1 人 工 制 备 芯 片 主 要 有 两 种 ,即 手 工 点 样 和 免 疫 打 点 印 迹 装 置 。 存 在 着 的 明 显 问 题 是 不 能 够 建 立 高 密 度 芯 片 、 样品 和 捕 获 分 子 消 耗 大 和 敏 感 性 较 低2 微 阵 列 制 备 仪主 要 有 直 接 接 触 式 和 非 接 触 式 两 种 类 型 ,也 是 目 前 市场 上 常 用 的 两 种 方 法 1 酶 标 记常 用 的 标 记 酶 有 辣 根 过 氧 化 物 酶 (HRP) 、 碱 性 磷 酸酶 (AP)等 .2 荧 光 物 标 记荧 光 免 疫 分 析 中 常 用 的 荧 光 物 质 有 异 硫 氨 酸 荧 光 素 、丹 磺 酰 氯 、 罗 丹 明 -异 硫 氰 酯 等 。 1 以 质 谱 技 术 为 基 础 的 直 接 检 测 法如 表 面 增 强 激 光 解 析 离 子 化 飞 行 时 间 质 谱 技 术 (SELDI-TOF-MS),可 以 使 吸 附 在 芯 片 表 面 的 靶 蛋 白 离 子 化 ,在 电 场 力 的 作用 下 飞 行 ,通 过 检 测 离 子 的 飞 行 时 间 计 算 出 质 量 电 荷 比 ,用 以分 析 蛋 白 质 的 分 子 量 和 相 对 含 量 。2 蛋 白 质 标 记 法常 用 的 芯 片 信 号 检 测 是 将 芯 片 置 入 芯 片 扫 描 仪 中 ,通 过 采 集各 反 应 点 的 荧 光 位 置 、 荧 光 强 弱 ,再 经 相 关 软 件 分 析 图 像 ,即可 以 获 得 有 关 生 物 信 息 。 1 用 于 蛋 白 质 -蛋 白 质 、 蛋 白 质 -核 酸 、蛋 白 质 -脂 类 等 相 互 作 用 研 究 ； 特 异 性蛋 白 质 的 筛 选 ； 功 能 蛋 白 质 组 研 究 。 例 如 ， 应 用 酵 母 蛋 白 质 芯 片 进 行 钙 调 蛋白 的 研 究 ； 应 用 磷 脂 酰 肌 醇 来 筛 选 磷脂 酰 肌 醇 的 结 合 蛋 白 。 2 疾 病 诊 断 的 研 究 。 目 前 ， 临 床 上 应 用 的 蛋 白 质 芯片 主 要 是 用 于 检 测 肿 瘤 标 志 物 的 蛋 白 质 芯 片 。 它的 应 用 范 围 主 要 在 以 下 几 个 方 面 ：（ 1） 用 于 肿 瘤 患 者 的 辅 助 诊 断 、 疗 效 判 断 、 病 情 监测 、 预 后 评 估 及 判 断 肿 瘤 有 无 复 发 和 转 移 等 。（ 2） 用 于 肿 瘤 高 危 人 群 的 定 期 筛 查 。 高 危 人 群 主 要是 指 45岁 以 上 的 人 群 、 患 各 种 慢 性 炎 症 和 各 种 慢性 疾 病 的 患 者 、 有 肿 瘤 家 族 史 和 肿 瘤 高 发 区 居 民等 。（ 3） 用 于 肿 瘤 分 子 流 行 病 学 调 查 及 肿 瘤 生 物 学 研 究 。 3 抗 体 筛 查 。 例 如 ， 对 噬 菌 体 抗 体 库 一次 可 对 上 万 个 不 同 的 抗 体 克 隆 进 行 检测 。4 药 物 筛 选 、 药 代 动 力 学 研 究 。5 在 毒 理 学 中 的 应 用 。6 环 境 监 测 。7 食 品 卫 生 安 全 的 监 测 。