发酵工程讲课.ppt

发酵工程在医药研究和生产中的应用 1微生物发酵工程与医药 1.1抗生素的微生物合成 v 抗 生 素 原 指 微 生 物 产 生 的 、 能 在 低 浓 度 杀 死 或 抑制 细 菌 或 真 菌 等 微 生 物 的 物 质 ， 也 包 括 天 然 产 生的 抗 生 素 经 化 学 方 法 改 造 所 得 的 半 合 成 抗 生 素 ，并 且 将 能 抑 制 肿 瘤 、 原 虫 等 微 生 物 产 物 也 归 入 抗生 素 类 。 抗 生 素 的 化 学 结 构 种 类 繁 多 ， 主 要 有 糖类 、 肽 类 、 蛋 白 质 类 、 核 苷 类 、 多 烯 类 、 多 醚 类 、内 酰 胺 类 、 大 环 内 酯 类 、 四 环 类 、 安 莎 类 等 。 抗生 素 主 要 用 于 治 疗 微 生 物 感 染 和 抗 癌 。 v目 前 ， 已 找 到 的 抗 生 素 有 数 千 种 ， 其 中 具 有临 床 效 果 并 已 利 用 发 酵 法 大 量 生 产 和 广 泛 应用 的 多 达 百 余 种 。 在 已 发 现 的 抗 生 素 中 ， 由真 菌 产 生 的 约 占 13 ， 由 地 衣 产 生 的 在 1 以下 ,由 细 菌 产 生 的 约 占 12 ， 由 放 线 菌 产 生 的约 占 67 。 在 放 线 菌 所 产 生 的 抗 生 素 中 ， 约90 是 由 链 霉 菌 产 生 的 。 临床主要应用的抗生素v头 孢 菌 素 类 抗 生 素 已 发 展 到 第 四 代 ， 主 要 研 究 动 向 是 提 高 抗革 兰 阳 性 菌 、 铜 绿 假 单 胞 菌 和 厌 氧 菌 活 性 。对 金 葡 菌 等 革 兰 阳 性 球 菌 的 作 用 强 于 第 三 代 ，对 头 孢 菌 素 酶 （ AmpC） 的 稳 定 性 也 优 于 第 三代 ， 因 产 AmpC酶 而 对 第 三 代 头 孢 菌 素 耐 药 的肠 杆 菌 属 、 柠 檬 酸 菌 属 、 普 罗 菲 登 菌 属 及 沙雷 菌 属 仍 对 第 四 代 头 孢 菌 素 敏 感 ； 头孢噻吩头孢替安拉氧头孢 v碳 青 霉 烯 类 抗 生 素 (亚 胺 培 南 /西 司 他 丁 、 美罗 培 南 和 帕 尼 培 南 /倍 他 米 隆 ) 抗 菌 谱 最 广 的 一 类 -内 酰 胺 类 抗 生 素 ，抗 菌 活 性 强 ， 对 -内 酰 胺 酶 （ 包 括 产 ESBLS和 AmpC酶 ） 高 度 稳 定 。 对 铜 绿 假 单 胞 菌 外 膜的 透 过 性 强 ， 最 低 抑 菌 浓 度 （ MIC） 与 最 低 杀菌 浓 度 （ MBC） 非 常 接 近 ， 对 革 兰 阴 性 菌 也 有一 定 的 抗 菌 后 效 应 （ PAE） 。 v 氨 基 糖 苷 类 抗 生 素 v 大 环 内 酯 类 抗 生 素 近 年 来 开 发 的 新 品 种 有 罗 红 霉 素 、 克 拉 霉 素 、 阿奇 霉 素 、 乙 酰 麦 迪 霉 素 、 罗 他 霉 素 等 ， 在 药 效 学 、药 动 学 特 性 以 及 不 良 反 应 等 方 面 较 沿 用 品 种 均 有 所改 进 。 对 胃 酸 的 稳 定 性 增 加 ， 生 物 利 用 度 高 ， 血 药浓 度 和 组 织 浓 度 增 高 ， 半 衰 期 延 长 ， 每 日 的 给 药 剂量 及 给 药 次 数 减 少 ， 胃 肠 道 等 不 良 反 应 也 明 显 减 轻 ，临 床 适 应 证 有 所 扩 大 。 v 四 环 素 类 抗 生 素v 糖 肽 类 抗 生 素 万 古 霉 素 、 去 甲 万 古 霉 素 与 替 考 拉 宁 是 控 制 MRSA等革 兰 阳 性 菌 重 症 感 染 “ 王 牌 ” 药 物 。 新 糖 肽 类 抗 生素 (1)Oritauancin AUC比 万 古 霉 素 大 10倍 ， 对 耐 万古 霉 素 肠 球 菌 （ VRE） MRS与 耐 青 霉 素 肺 炎 链 球 菌（ PRSP） 有 较 强 活 性 ； （ 2） 雷 莫 拉 宁 ： 能 抑 制 细胞 壁 肽 聚 糖 合 成 ， 但 作 用 位 点 不 同 于 万 古 霉 素 。 对需 氧 性 与 厌 氧 性 革 兰 阳 性 细 菌 有 强 大 杀 菌 作 用 ， 对耐 万 古 霉 素 的 屎 肠 球 菌 也 有 作 用 。 抗生素作用机理 v寻 找 新 的 抗 生 素 仍 然 是 很 重 要 的 任 务 。 以 抗肿 瘤 、 抗 病 毒 、 抗 真 菌 、 抗 原 虫 、 广 谱 和 抗耐 药 菌 的 抗 生 素 为 主 要 研 究 方 向 。 1.2维生素类药物的微生物生产 v -胡 萝 卜 素v维 生 素 Cv维 生 素 E v 国 内 用 真 菌 三 孢 布 拉 霉 生 产 -胡 萝 卜 素 的 产 量 达2.0 g/L， 国 外 已 达 到 (3 3.5) g/L.粘 红 酵 母 、 布拉 克 须 霉 、 丛 霉 等 真 菌 也 具 有 生 产 -胡 萝 卜 素 的能 力 。 除 真 菌 外 ， 如 球 型 红 杆 菌 、 瑞 士 乳 杆 菌 等 某些 细 菌 也 具 有 发 酵 生 产 类 胡 萝 卜 素 的 能 力 。v Vc的 微 生 物 发 酵 法 早 已 取 得 重 要 突 破 ， 利 用 “ 大 小菌 落 ” 菌 株 混 合 培 养 生 产 VC的 工 艺 已 经 成 熟 ， 进 入产 业 化 。 v 目 前 利 用 氧 化 葡 萄 糖 杆 菌 与 一 种 蜡 状 芽 孢 杆 菌 混 合菌 共 固 定 化 发 酵 技 术 ， 可 将 Vc的 收 率 提 高 到 80%以上 ， 生 产 周 期 比 传 统 工 艺 缩 短 1/3。v 日 本 研 究 人 员 发 现 一 种 纤 细 裸 藻 能 同 时 生 产 Vc、 VE和 -胡 萝 卜 素 ,藻 体 生 物 量 产 量 可 达 每 升 培 养 液20 g， 从 中 提 取 Vc和 VE量 为 60 mg/L, -胡 萝 卜 素40 mg/L. 1.3多烯脂肪酸的微生物生产v -亚 麻 酸 (GLA) :人 体 不 能 合 成 而 又 必 需 的 多 烯 脂肪 酸 ， 缺 乏 时 会 导 致 机 体 代 谢 的 紊 乱 而 引 起 多 种 疾病 ， 如 高 血 压 、 糖 尿 病 、 癌 症 、 病 毒 感 染 以 及 皮 肤老 化 等 。 因 此 ， 体 内 补 充 GLA已 成 为 治 疗 疾 病 和 抗衰 老 的 重 要 手 段 。v GLA在 体 内 转 化 为 二 高 -亚 麻 酸 (DGLA)和 花 生 四 烯酸 (AA)， 两 者 再 分 别 合 成 前 列 腺 素 类 物 质 而 发 挥 对人 体 生 理 功 能 的 重 要 调 节 作 用 。v 深 黄 被 孢 霉 可 用 于 生 产 -亚 麻 酸 。 v 二 十 碳 五 烯 酸 (EPA)和 二 十 二 碳 六 烯 酸 (DHA) 是 很有 价 值 的 医 药 保 健 产 品 ， 在 海 洋 冷 水 鱼 中 含 量 颇 丰 ，也 可 用 发 酵 工 程 的 方 法 生 产 。v 细 小 球 藻 中 EPA含 量 高 达 总 油 量 的 99%， 等 鞭 藻 的DHA含 量 为 5.4 mg/g干 藻 体 。v 网 粘 菌 SR21， DHA含 量 为 其 干 菌 体 脂 质 含 量 的 30%40%， 通 过 发 酵 生 产 ， 每 升 培 养 液 产 量 为 4.5 。 1.4医用酶制剂的发酵生产 v 心 脑 血 管 病 医 用 酶 (链 激 酶 、 葡 萄 糖 激 酶 、 金 葡 激酶 )： 上 海 医 科 大 学 获 高 表 达 链 激 酶 , 这 种 重 组 链激 酶 一 进 入 中 试 生 产 后 , 在 我 国 作 为 第 一 个 拥 有 自主 知 识 产 权 的 一 类 生 物 技 术 新 药 进 人 商 品 化 , 成 为挽 救 急 性 心 肌 梗 塞 和 脑 血 栓 形 成 等 疾 病 的 特 效 药 。v 心 脑 血 管 病 保 健 用 酶 ： 中 国 根 霉 产 新 的 溶 血 栓 酶 ，纳 豆 激 酶 和 天 酷 激 酶 。 v酶 与 帕 金 森 氏 症 ( 酪 氨 酸 酶 )： 一 种 假 单 胞菌 具 有 高 产 酪 氨 酸 酶 的 能 力 ， 为 微 生 物 酶 法生 产 多 巴 创 造 了 先 决 条 件 。 弗 氏 柠 檬 杆 菌 在一 酪 氨 酸 诱 导 下 具 有 高 效 表 达 酪 氨 酸 酶 的 催化 活 性 , 可 获 得 多 巴 产 量 9.5克 /升 , 其 他 技术 如 ， 固 定 化 包 埋 假 单 胞 菌 、 术 建 构 含 有 酪氨 酸 酶 基 因 的 苏 云 金 芽 胞 杆 菌 等 。 v酶 与 高 歇 氏 病 (葡 萄 糖 脑 苷 脂 酶 )： 利 用 转 基因 技 术 将 编 码 葡 萄 糖 脑 苷 脂 酶 的 基 因 转 入 烟草 植 物 取 得 成 功 , 含 有 基 因 的 转 基 因 烟 草 植物 获 得 有 效 表 达 , 即 可 从 该 “ 工 程 烟 草 植 物 ” 烟 叶 中 提 取 这 种 酶 蛋 白 。 1.5紫杉醇的微生物合成 v 真 菌 安 德 烈 紫 杉 菌 v 小 孢 盘 多 毛 孢 菌 v 将 紫 杉 醇 合 成 酶 基 因 转 入 紫 杉醇 产 生 菌 中 ， 有 可 能 建 构 高 产紫 杉 醇 的 “ 工 程 菌 ” 。 1.6基因工程制药工业v 促 红 细 胞 生 成 素 （ EPO） ， 集 落 刺 激 因 子 （ CSF） ，表 皮 生 长 因 子 （ EGF） ， 人 生 长 激 素 ， 干 扰 素 ， 白 介素 ， 各 种 疫 苗 ， 单 克 隆 抗 体 等 。v 免 疫 抑 制 剂 ， 免 疫 激 活 剂 ， 糖 苷 酶 抑 制 剂 ， 脂 酶 抑制 剂 ， 类 固 醇 激 素 等 。 2细胞组织培养与药物 2.1细胞培养技术生产中药有效成份v 中 药 的 有 效 成 份 主 要 是 细 胞 次 生 代 谢 产 物 ， 因 此 利用 培 养 细 胞 代 谢 产 物 的 研 究 是 生 物 技 术 在 中 药 生 产中 应 用 较 早 的 一 个 方 面 .目 前 已 经 从 400多 种 植 物 建立 了 组 织 和 细 胞 培 养 物 ， 从 中 分 离 出 600多 种 代 谢产 物 ， 其 中 40多 种 化 合 物 在 产 量 上 超 过 或 等 于 原 植物 ， 为 利 用 细 胞 培 养 技 术 工 业 化 生 产 医 药 奠 定 了 基础 。 v 通 过 筛 选 高 产 细 胞 系 ， 改 进 培 养 条 件 和 技 术 ， 设 计适 合 植 物 培 养 细 胞 的 发 酵 罐 等 手 段 ， 对 烟 草 、 紫 草 、长 春 花 、 丹 参 、 红 豆 杉 、 三 尖 杉 、 洋 地 黄 、 人 参 、三 七 、 西 洋 参 、 毛 地 黄 、 茜 草 、 黄 连 和 彩 叶 紫 苏 的多 种 植 物 细 胞 进 行 了 大 规 模 悬 浮 培 养 的 试 验 ， 以 生产 烟 碱 、 紫 草 宁 、 长 春 藤 碱 、 丹 参 酮 、 紫 杉 醇 、 三尖 杉 酯 碱 、 洋 地 黄 碱 、 人 参 皂 、 毛 地 黄 碱 、 茜 草 素 、黄 连 素 和 紫 苏 素 等 药 物 .发 酵 罐 规 模 已 达 到 (1075) L， 其 中 紫 草 宁 、 茜 草 素 和 人 参 皂 已 商 业 化 .近年 来 ， 紫 杉 醇 含 量 已 经 比 原 植 物 提 高 了 100多 倍 ，达 到 153 mg/L。 2.2遗传转化器官的培养与药物生产v 由 农 杆 菌 感 染 植 物 组 织 形 成 的 “ 畸 形 芽 ” 和 “ 毛 状根 ” 是 继 细 胞 培 养 后 又 一 重 要 培 养 系 统 。 中 药 许 多有 效 成 分 的 形 成 与 器 官 分 化 过 程 密 切 相 关 ， 而 在 培养 细 胞 中 有 效 成 分 不 存 在 或 含 量 极 少 .与 细 胞 培 养相 比 ， 毛 状 根 培 养 有 明 显 优 点 ： 生 长 速 度 快 、 分 枝多 ， 弱 向 地 性 ； 毛 状 根 处 于 器 官 化 水 平 ， 其 生 理 生化 、 遗 传 特 性 稳 定 ， 具 有 稳 定 的 次 生 代 谢 物 合 成 能力 ， 毛 状 根 培 养 系 统 对 根 类 中 药 材 中 有 效 成 分 的 生产 更 为 重 要 。 v 毛 状 根 (hairy roots)是 发 根 农 杆 菌（ Agrobacterium rhizogenes） 感 染 双 子 叶植 物 后 ， 其 Ri质 粒 上 的 TDNA片 断 整 合 进 植物 细 胞 核 基 因 组 中 诱 导 产 生 的 一 种 特 殊 表 现型 ， 近 10年 来 已 发 展 成 一 种 新 的 培 养 系 统 。 v上 海 中 医 药 大 学 对 黄 芪 毛 状 根 的 大 规 模 培 养技 术 和 化 学 成 分 与 药 理 活 性 进 行 了 深 入 研 究 ，在 3 L、 5 L、 10 L培 养 器 中 经 21d培 养 ， 有 效成 分 产 量 可 达 10 g/L (干 重 )， 而 且 黄 芪 毛 状根 中 皂 甙 、 黄 酮 、 多 糖 、 氨 基 酸 等 含 量 近 似于 药 用 黄 芪 ， 其 作 用 效 价 也 与 药 用 黄 芪 基 本一 致 。 v 我 国 从 黄 花 蒿 中 分 离 鉴 定 出 的 青 蒿 素 是 抗 疟 有 效 单体 ， 对 脑 型 和 抗 氯 喹 性 疟 疾 有 特 效 ， 成 为 WHO推 荐产 品 .刘 春 朝 等 利 用 Ri1601质 粒 转 化 青 蒿 叶 片 筛 选的 高 产 系 ， 进 行 了 青 蒿 毛 状 根 合 成 青 蒿 素 的 培 养 工艺 条 件 研 究 ， 取 得 较 好 结 果 ： 在 优 化 条 件 下 ， 经25 d培 养 ， 青 蒿 素 产 量 达 223.3 mg/L。 目 前 毛 状 根培 养 系 统 的 中 试 装 置 已 达 500 L的 规 模 ， 利 用 20 t发酵 罐 生 产 的 人 参 毛 状 根 已 开 发 成 商 品 投 入 市 场 。 2.3药用植物组织的离体培养 v自 1960年 利 用 组 织 培 养 技 术 将 兰 花 茎 尖 分 生组 织 进 行 离 体 培 养 ， 建 立 无 性 繁 殖 系 并 诱 导分 化 成 植 株 以 来 ， 已 发 现 能 进 行 离 体 分 化 的植 物 有 千 余 种 ， 能 进 行 快 速 繁 殖 的 有 数 百 种 ，能 进 行 规 模 化 和 商 品 化 生 产 的 有 近 百 种 .其 中有 100多 种 药 用 植 物 经 离 体 培 养 分 化 成 植 株 ，对 稀 有 珍 贵 中 药 品 种 的 保 存 、 繁 育 和 纯 化 具有 重 要 意 义 。 v 甜 菊 茎 500 L大 规 模 培 养 结 果 表 明 ， 在 25 、2000 lux光 照 、 15 L/min通 气 量 的 培 养 条 件 下 ， 每批 培 养 小 植 物 数 量 可 达 20万 株 。v 通 过 不 断 过 筛 、 密 度 梯 度 离 心 以 及 培 养 的 方 法 基 本上 解 决 了 胡 萝 卜 体 细 胞 胚 胎 同 步 发 育 的 难 题 ， 实 现了 从 单 细 胞 到 完 整 植 物 发 育 的 同 步 化 ， 为 胡 萝 卜 素的 生 产 开 辟 新 途 径 。v 最 近 进 行 的 从 生 物 反 应 器 中 培 养 青 蒿 小 植 物 生 产 萜类 化 合 物 的 尝 试 ， 为 传 统 中 药 的 大 规 模 培 养 提 供 了先 例 。 2.4生物转化系统与药物生产 v植 物 培 养 细 胞 和 微 生 物 具 有 诸 如 酯 化 、 氧 化 、乙 酰 化 、 还 原 化 、 甲 基 化 、 羟 基 化 和 羰 基 化等 多 种 生 物 转 化 能 力 。 生 物 转 化 实 质 上 是 一种 酶 催 化 反 应 。 某 些 植 物 酶 能 够 催 化 微 生 物和 化 学 合 成 很 难 进 行 的 立 体 专 一 和 区 域 专 一的 反 应 ， 因 此 进 行 自 由 悬 浮 或 固 定 化 细 胞 的生 物 转 化 研 究 就 成 为 植 物 生 物 技 术 的 一 个 重要 研 究 领 域 。 v熊 果 苷 是 人 类 皮 肤 中 黑 色 素 合 成 的 抑 制 剂 ，是 美 容 产 品 的 重 要 添 加 剂 .利 用 毛 曼 陀 罗 、 长春 花 或 蛇 根 木 的 培 养 细 胞 进 行 的 生 物 转 化 取得 了 成 功 ， 其 产 量 分 别 达 到 7.1 g/L、 9.2 g/L和 18 g/L， 已 经 达 到 化 学 合 成 的 产 量 ， 有 希望 进 行 商 业 化 生 产 。 最 近 将 鬼 臼 毒 转 化 成 它的 -葡 萄 糖 甙 也 获 得 成 功 ， 转 化 率 达 到294 mg/L。