首个人工细菌细胞

一种由化学合成基因所控制的细菌细胞的创造我们从被 数字化的 染色体序 列信息开 始报告 1.08-Mbp 丝状 支原体 JCVI-syn1.0 染色体和它的移植的设计、综合和装配入支原体接收细胞创造是由 综合性染色体仅控制的新的支原体山羊支原体细胞。 在细胞的唯一的脱氧核糖 核酸是被设计的综合性脱氧核糖核酸在建造过程期间获取的序列，包括“水印” 序列和其他被设计的基因删除和多形性和变化。 新的细胞期待显形物产并且有 能力在连续的自已复制上。在1977年桑格和同事决定了噬菌体(p X174完整的基因代码，第一个DNA 基因组完全测序。18年后, 在 1995年, 我们的团队能够读了第一个完整的基因编 码的一种能自我复制的细菌、流感嗜血杆菌(2)。阅读的遗传密码范围广泛的物 种成倍增加了从这些早期的研究。我们的基因组信息进行数字化处理能力迅速增 长了超过8个数量级的在过去的 25年里，(3)。努力去理解这一切新的基因组信 息已经引发了众多的新计算和实验范式， 但我们仍然是非常有限的。基因组知识 没有一种单一的蜂窝系统中理解它的所有基因的生物学方面的角色。即使在简单 的细菌细胞， 做染色体含有整个遗传曲目?如果是这样的话， 会有一完整基因系统 开始被复制化学合成DNA序列，仅用数字化包含在计算机吗？我们感兴趣的大DNA分子的合成和染色体中诞生出我们的努力在过去的15 年建成一个最小的细胞，它只包含必需基因。这些工作都是在1995年，当时我们 举行落成典礼测序基因组从找出让生殖道黴浆菌与最小，补充任何已知的生物的 基因， 因为有能力独立生长在实验室。超过 100名485 蛋白质编码基因的尿道支 原体是可有可无当中断(4 - 6)最后。我们开发了一个策略，并对装配病毒性大小的块产生大的DNA分子,让我们 得以装配一个合成尿道支原体基因组DNA的化学合成了四个阶段,即从磁带平均 约6 kb的大小。通过结合完成了体外和体内的重组酶的方法在酵母。582,970 整个人造的基因组(bp)是稳定增长的酵母着丝点质粒(YCp)(7)。在几个障碍是克服移植和表达一种化学合成染色体接受者细胞。我们需要改 进方法从酵母中提取接触染色体。我们还需要学习如何移植到接收这些基因组的 细菌细胞， 建立一个细胞控制只有在人造的基因组。由于他事实尿道支原体有着 极其缓慢的经济增长速度，我们转到两个增长最快的物种,M肺炎支原体(GM12亚 种)作为供体愿望，和M丝状支原体亚种支原体(CK)作为受体。建立的条件和程序， 人造的基因组的移植方法， 研制出酵母作为整个细菌染 色体着丝点克隆质体在酵母、包括一个土生土长的丝状支原体基因组(8、9)。然 而， 进入尾声， 丝状支原体提取基因组从酵母和移植到山羊支原体失败了。我们发 现， 捐献者和接受者支原体共享一个共同的约束制度。甲基化的捐献者基因组的 本土丝状支原体细胞,因此是防止限制在移植从一个土生土长的供体细胞(10)。 然而,未甲基化的细菌基因组生长在酵母的而不是由单一约束制度保护细胞的接 受者。我们能够克服这一限制障碍的供者的 DNA 氧或粗用纯净水甲基化酶丝状支 原体、山羊支原体提取物、或收件人或通过简单地破坏细胞的约束制度(8)。我们现在有联合我们所有的以前建立的程序和报告的合成、组装、克隆，和 成功的移植1.08-Mbp丝状支原体JCVI-synl.O基因组中，创造出了一个新的细 胞控制这个人造的基因组。结果人造的基因组设计丝状支原体设计是基于JCVI-synl.O基因组的高度精确的完成两项实验室 菌株的基因组序列，并将GM12 m 的支原体亚种(8、9)(11)。一是拉蒂格供体所 使用的基因组的基因资讯资料库)加入学组。CP001621(10)。另一种是应变由 移植的基因组内已经克隆及工程在酵母、YCpMmycl.l- A typelllres CP001668,基因资讯资料库)加入(8)。该项目被批判性地依赖于这些序列的准 确性。虽然我们认为，两者都完成了丝状支原体基因组序列，是可靠的，有95个站 点，届时他们不同。我们开始设计前两者的人造基因组序列完成了。因此，大部分 的磁带，设计并合成了基于CP001621序列(11)。当它被完成的时候，我们选择了 用了染色体组序列，在成功移植从酵母(CP001668)作为我们的设计参考(除非我 们保持完好typelllres基因)。所有差异显著，出现了生物学上CP001668磁带和 以往合成之间的匹配进行了修正，它完全地(11)。序列之间的差异，我们合成磁带 和CP001668发生在19个网站出现无害的,而且就不至于修正。这些为19多态之 间的差异 JCVI-syn1.O 人造的基因组 (我们)和自然的 (非合成的 )基因组 (YCpMmyc1.1)，我们还克隆了酵母和使用作为一个标准从酵母基因组移植(8)。为 了进一步区分这人造的基因组与自然的人，(图4水印序列。S1)是设计来取代一 个或多个磁带在区域试验证实(水印11246 bp和2个2005,13(bp)或预测的 bp1109水印3和41222 bp)来不会干扰细胞活力。这些水印序列编码的唯一 标识符而限制他们的翻译成多肽。表S1列举了合成基因族群之间的差异。半合成的基因组组装和移植去帮助每一个100-kb测试的功能基因组、半合成段构造和移植手术。通过 混合天然和合成的，那些碎片合成 1OO-kb 成功建设的每一个议会可以被验证而 无需序列这些中间体。我们自然100-kb总成克隆11重叠在酵母利用先前的模型 描述方法(16)。在11 个平行反应、酵母细胞破碎丝状支原体共同转化与基因组 DNA(YCpMmyc 1.1)，平均 100 个 kb 在长度及放大的聚合酶链式反应向量设计 100-kb重叠的末端插入。维持适当的重叠，这样天然和合成碎片可能会被重组, 放大的聚合酶链式反应向量共生产了具有相同的 40-bp 通过底漆用于克隆 100-kb 重叠合成的组件。建立了半合成基因组之间,包含两岁,一个十岁的 11 个 100-kb合成组件（表1）。生产的可行的生产，ionfirmed移植后殖民地，合成的一 小部分的每一个基因组包含不致命的突变。只有一 100-kb组件,811-900,就不可 行。最初, 一个包含错误的 811-820 克隆被用来制造人造基因组内没有移植。这 是自从误差预计的单一碱基对的删除，创造移码的在DNA, 个重要基因的染色 体的复制。我们以前没有意识到的这种变异。采用半合成基因组的建构策略,我 们能够确定811-900源合成移植给失败的实验。因此,我们开始重新组装一个无 差错811-900召开的联合国大会上，被用作生产的sMmYCp235酵母菌种。唯一的 突变DNA基因组核苷酸则由一 sMmYCp235从人造的基因组中。这是作为一个阴性 对照基因组在我们移植实验。DNA突变也被修复的水平在811-900基因组工程在 酵母（17）。 811-900总成的修复被用在了最后一个阶段装配生产酵母基因组克隆 与修复。这sMmYCP142克隆被命名为“酵母和能够被移植。对基因组的完整清单, 从11块已组装成功移植提供表1。合成的移植描述快速分辨从山羊支原体合成移植或自然支原体两种分析等进行了较深入的 研究。首先，四个底漆的双星具体到每一个的四个水印设计是这样,他们在一个单 一生4种增产物无聚合酶链式反应（表影城S4）。所有四个都是由增产物产生 sMmYCp235移植,但不是YCpMmyc1.1（图4a）。第二，凝胶分析，一年我和BssH（图 二世,上面所描述。3d）,也作了分析。所制得的限制模式符合移植产生的一种合 成的丝状支原体基因组（图 1 - 4b）。一个单一的sMmYCp235移植源自人造基因组测序。我们把这个JCVI-syn1.0 像丝状支原体应变。 该序列匹配既定设计除已知的多态性,8个新的种单核苷酸 多态,大肠杆菌转座子插入和一个85-bp复制（表S1）。转座子插入完全相同的大 小和序列, 转座子 IS1 在大肠杆菌。 它很可能是 IS1 10-kb 半成品的受感染后, 其转移到大肠杆菌。这 IS1 直接插入两侧是山羊霉形体序列重复说明:通过换位 插入机制。 85-bp 重复的非同源性的解决的结果,因为这次比赛结束时加入均未 检出我们在10-kb序列分析阶段。这两个插入破坏两个基因明显非必需的。我们 没有找到任何人造的基因组序列的,可以认定为属于山羊支原体。这表明有一个 完整的山羊支原体更换基因组由我们的人造的基因组在移植的过程。这些细胞,仅用人造的基因组是自我复制并且能够生长。对数扫描和透射电 子显微图 （EM） 山羊霉形 JCVI-syn1.0 细胞显示小 , 卵胞质膜细胞所包围。 5c-5f（图）。蛋白质组学分山羊霉形体JCVI-syn1.0和该方法将小波控制（YCpMmycl.l）利用二维凝胶电泳显示的蛋白质斑点几乎相同的模式（图。这些人 都是S4）,明显不同于那些早先报道,为山杨霉形体（10）。14个基因是在m.删除 或中断,但 JCVI-syn1.0 基因组蕈状枝原体出现频率的殖民地,在平皿上的菌落 形态相似（比较图5a和b）。我们所做的是观察细微的差异,差异在于增长率在一 个颜色变化检测法,与 JCVI-syn1.0 单位移植的 MmcyYCp1.1 增长略高于控制应 变。讨论在1995年，产品的质量标准,为了次序被认为是一个错误的测序10000 bp 和微生物基因组需要几个月。今天，精度更高。报道30-50X基因组测序是不寻常 的,只需要几天的时间。然而,便得到了错误的基因组,能够被移植到接收者细胞 并创造了一个新的细胞控制仅由人造基因组复杂,需要许多质量控制步骤。我们 的成功挫败了许多个星期由单一碱基对的基本基因dnaA删除。一个错误的基地, 有超过100万的重要基因在基因组不活跃,而使插入和删除基因组中主要部件的 基因组的非必需的影响没有可见的抗冻性。我们的人造基因组的示威活动,提升 了移植的特点, 山羊霉形体细胞 DNA 序列上意味着基础也不是足够精确能指定 一个活细胞与相应的性质。我们站在合成基因组的方法，形成鲜明对比其他多种方法修改基因组工程， 通过引入自然基因组，替代品，多重插入和删除都（新竹）。这项工作提供了一个证 明基于的原则，为生产细胞的基因组序列，设计在计算机中。细胞的基因组DNA 测序的可以存储的遗传指令为人生就像一个数字文件。而人造基因组进行阐述只 有有限的修改从自然发生的山羊霉形体基因组。然而,该方法我们开发了应适用 的合成和移植更新颖的基因组作为基因组设计进展（23）。我们指的是这样一个细胞控制化学合成基因组碎片组装出的DNA是“合成 细胞”，即使细胞质内的收件人的细胞并不合成的。表型的影响是稀释与蛋白质 受体细胞质和细胞营业额仅载移植的基因组复制。在肾移植和复制一盘形成一个 殖民地（ 30师或稀释），后代的109折叠的蛋白质分子将不包含任何当时在原 来的受体细胞（10，24）。这是我们第一次描述先前体现在基因组移植（10）。细胞 的特性控制的组装的基因组，预计将有同样的感觉，仿佛整个细胞已经生产过了 DNA软件建立综合（它自己的硬件）。茶多酚生产合成细胞的能力所必需的渲染它时，它使合成DNA研究人员构建 和细胞清晰水印他们的工作来区分它从自然发生的DNA和细胞。我们有水印的合 成染色体在这个和我们先前的研究（7）。如果这里描述的方法可推广、设计、合成、组装及移植的合成染色体）将不 再是一种障碍的合成生物学的进展。我们期望的成本合成DNA的将遵循什么事了DNA 测序并继续呈指数下降。结合低成本自动化合成将使广泛的应用对于合成基 因组学研究进展迅速。我们开车开了好久生命合成的伦理讨论从最早的阶段的这一工作(25日、26)。像合成基因组应用的拓展,我们期待着这工作将继续提高哲学问题中有广泛 的社会和伦理问题。我们鼓励继续谈话。参考文献和注解1. 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