《味精的生产工艺》PPT课件.ppt

味精的制作 一 实验目的 1掌握谷氨酸发酵的原理及发酵过程的控制和操作 2掌握培养基的配制和灭菌的基本技术、谷氨酸菌种制备及种 子扩大培养。 3了解用等电法从发酵液回收谷氨酸的方法。 4掌握由谷氨酸制备谷氨酸钠的方法。 二 实验原理 味精 ,也称味素 ,因味精起源于小麦 ,俗称 麸酸钠、谷氨酸钠 （分 子式 C5H8NO4Na ）。 谷氨酸是由谷氨酸棒杆菌以葡萄糖为原料生 产的一种呈味氨基酸，其代谢机理为：葡萄糖经糖酵解（ EMP） 和单磷酸己糖途径（ HMP）生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脱 羧生成乙酰 CoA，另一方面经 CO2固定作用生成草酰乙酸，两 者合成柠檬酸进入三羧酸循环（ TCA循环），由三羧酸循环的 中间产物 -酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合 成谷氨酸。由于谷氨酸棒杆菌为生物素缺陷型突变株，要在培 养基中添加亚适量（浓度应在 5g/L左右）生物素维持细胞正 常生长和控制细胞膜的透性达到高产谷氨酸的目的。回收的谷 氨酸又称麸酸，并无鲜味，将其进行中和精制得到味精。 等电点法提取谷氨酸原理 谷氨酸具有两性电解质性质，溶于水呈离子状态，解离方式取决 于溶液 pH，在不同 pH溶液中，谷氨酸可解离成 GA+、 GA 、 GA-和 GA2+四种不同离子状态。谷氨酸等电点是 3.22，故当溶 液的 pH为 3.2时，溶液中大部分是 GA 两性离子， 其分子内部正 负电荷相等 ,并含有等量的带不同电荷的阳离子 (GA+)和阴离子 (GA-),因此溶液中总静电荷等于零。由于谷氨酸分子之间相互碰 撞 ,再通过静电引力的作用 ,结合成较大的聚合体而被沉淀析出 , 因而处于 等电点时 GA的溶解度最小 。谷氨酸在不同条件下结晶， 会形成两种不同晶形，一种为 型斜方晶体，颗粒大，容易结晶 析出，纯度高；一种为 型鳞片状结晶，比重轻，不宜沉淀分离， 往往夹有杂质与胶体结合，浮于液面或母液中，纯度低。等点操 作中应尽量控制 型晶体的形成。 又由于温度对 GA的溶解度影响 很大 ,温度越低溶解度越小 ,生产上多采用 0 4 。 三 实验用品 一）仪器：试管、三角烧瓶、纱布、吸管、接种 环、试管、烧杯、 752（ 7200）分光光度计、高 压灭菌锅、电子天平、超静工作台、 10L自动发 酵罐、高压灭菌锅、生化培养箱、摇床、旋转蒸 发仪等 二）菌种 谷氨酸棒杆菌 （实验室提供） 三）培养基 1.斜面培养基（ g/L） 酵母粉 0.5，蛋白胨 1，氯化钠 0.5， pH 7.0 121 灭菌 30min 2种子培养基（ g/L）： 葡萄糖 25，玉米浆 30（ 2330）， MgSO4 0.5， K2HPO4 1.5， MnSO4 0.02， FeSO4 0.02， 尿素 5。 pH值 7.0 7.2 121 灭菌 30min 3发酵培养基（ g/L）： 葡萄糖 140、糖蜜 2.0（ 玉米浆 6） Na2HPO4 1.0， KCl 1.2， MgSO4 0.8， MnSO4 0.02， FeSO4 0.02， VB1 0.2mg， pH 7.0 7.2。 4补料溶液： 葡萄糖 600g/L，质量分数 40%尿素（氨水 25%） 5消泡剂 0.01%（消泡剂配制后经灭菌、冷却后备用 ) 四 实验内容 （ 一） 工艺流程 原料的预处理及淀粉水解糖的制取 谷氨酸生产菌种子的扩大培 养 谷氨酸发酵 谷氨酸的提取与分离 由谷氨酸制成味精 及味精成品加工 （二）实验步骤 1 斜面菌种制备 ：接种针挑取 1环原始菌种，于斜面培养基划线， 在恒温培养箱 32 培养 18-24h。 2液体种子培养 ：接一环生长良好的斜面种子至装有 50ml种子培 养基的 500ml三角瓶（ 1000ml装 200-250ml） ，放在冲程为 8cm的往复式摇瓶柜上培养，转速为 96r min，温度 32 ， 培养 8-9h。 一级种子质量标准： pH 6.5 光密度 OD0.75以上 残糖 0.5%以下 镜检：菌体生长均匀、粗壮，革兰氏阳性， 无杂菌，八字形 占 95%以上 由于发酵罐的容积较小，所以省略了二级种子的 培养。 3-1 发酵培养 发酵罐培养 1培养基配制 按发酵培养基配制，用自来水定容至发酵罐容 积的 60%， pH调至 7.0-7.2。 2）灭菌 空消及空气过滤系统灭菌 灭菌前检查发酵罐及相关管路气密性， 121 灭菌 30min，灭菌过程打开各路排气阀门，空 气过滤系统灭菌后通压缩空气吹干备用。 (罐小， 可省略 ) 2）实消 发酵罐加入培养基后，通过夹套预热至 80 ， 直接通蒸汽灭菌， 121 灭菌 20min，再关闭蒸 汽，改用自来水冷却至 32 。灭菌完毕通无菌 空气保持罐内正压，防止染菌。 3）发酵工艺条件 采用 火焰接种法接种 ，接种量 10% 罐压 控制在 0.05MPa 转速 200750r/min，调节转速及通气量控制 溶氧在 20%以上 当 pH降到 7.07.1左右， 及 时流加尿素（氨水） 。 前期 pH7.58.0， 中期降到 7.17.4，后期 7.0，在发 酵结束前 6小时停止流加尿素（ 氨水） ，接近放罐时 pH约 6.56.8 温度： 0-5h 34 ； 5-10h 35 ； 10-18h 36 ； 18h26h 37 ； 26h后 37 OD净增控制 : 总 OD=0.75 0.8。 残糖浓度通过流加葡萄糖液（ 残糖在 5%2.0%时是流加糖最佳时机 ）控制在 10- 15g/L。发酵周期在 36h内，放罐时残糖应 低于 5g/L。流加糖占总投糖的 60%70%时 产酸和转化率较为理想。开始流加时机应以 残糖量、耗糖速度、菌体的活力和转型情况 为依据 泡沫控制 ：在发酵产生一定泡沫时，流加一 定量的消泡剂，每次流加约 40g/m3 。 4）放罐 发酵结束后，将发酵液加热至 80 维持 15min灭菌， 并清洗发酵罐及补料瓶。 从发酵 4小时开始，每间隔 2小时测定 OD， pH，糖含 量，镜检 3-2 发酵培养 摇瓶发酵 取种子培养液以 10%接种量 接种至装有 25mL发酵培 养基 的 500mL三角瓶中， 8层纱布封口，置巡回式摇 床 (220r/min)上振荡培养 36h。添加 2滴 1%苯酚红指 示剂，间歇流 40加尿素控制 pH 在 7.0 左右。温度： 前期 32 33 ，后期 34 37 。转速：前期 100r min，后期 220r/min。 发酵过程 参数测定 幻灯片 9 还原糖的测定 谷氨酸的测定 菌体形态观察 菌体浓度测定 发酵过程参数的控制 DO值 pH 温度 搅拌速度 发 酵 发 酵 液 冷却接种 三角瓶培养 固体斜面培养 上罐实消 培养基的配制 谷氨酸发酵的工艺流程简图 6 谷氨酸的提取与分离 等电点法提取工艺 操作简单，收率 60。周期长，占地面积大 晶种 4h 发酵液 菌体分离 清液（浓缩） 育晶点 停酸搅拌两小时 边冷却边缓慢调酸 2M HCL 等电点 低速 搅拌 结晶 68h 4 静置沉降 4h湿谷氨酸 离心分离 谷氨酸 母液 1)发酵液预处理 采用金属过滤膜过滤设备去除菌体及固形物杂质，必要时可在膜过 滤前添加絮凝剂沉淀蛋白质杂质，添加发酵液体积 1.5%的粉末活性 炭在 80 下对发酵液脱色 20min，在 510nm下透光值达到 75%以上。 2）发酵液浓缩 采用旋转蒸发仪 70 、 -0.1 MPa真空度下浓缩发酵液体 积至原体积的 50%。 3）等点结晶 采用 2M HCL调节谷氨酸浓缩液 pH至 3.2，并缓慢搅拌 育晶 8h 4）晶体分离及干燥 采用真空抽滤设备分离谷氨酸晶体， 60 烘干并称重。 7 谷氨酸制味精 谷氨酸用适量的 NaCO3溶液中和后，再经过过滤、浓缩、 离心分离等步骤、最终制成味精。 工艺条件：湿谷氨酸：水：纯碱：活性炭 =1： 2：（ 0。 30.34）： 0.01 1）在不锈钢内桶内加入清水及活性炭升温到 65 ，开 始搅拌 60r/min。投入谷氨酸， 成为饱和溶液。 2）缓慢逐步加入 NaCO3 中和到 pH6.4（试纸）， 加热到 65 ，继续搅拌 4）谷氨酸钠的浓缩结晶： a.将澄清的脱色液（ 18- 20B/35 ）加到旋转式蒸发仪（加料 1/2） ,真空度 80kPa以上， T70 浓缩至 3434.5 B/80 ，升温 至 80 放料。放料后冷却，搅拌 23h后开冷却水降 温，降温到（室温 +15 ） b.分离 ：抽滤（工业滤 布作介质 /真空抽滤设备 ） c.烘干：鼓风干燥箱（ T60 ）干燥。即可得到味精 原粉。 注 中和液 除铁、除锌 ：硫化钠法、树脂法除铁锌。 五 注意事项 1菌种制备的整个过程牢固 无菌 概念，严防杂菌污染。 2流加糖消毒灭菌温度不宜过高，切要迅速降温至 3045 ， 105 在搅拌以防止糖液的焦化产生焦 糖和色素 ,流加过程中残糖控制量不宜忽高忽低。 3等电点法提取谷氨酸注意 A、发酵液纯度高：谷氨 酸 /残糖比值高，胶体少，提前除菌体最好； B、发 酵液处理要及时； C、加酸调 pH、温度、育晶时间、 搅拌服从结晶规律，特别是观察到晶体后，要停搅 拌 2h 育晶，否则产物无法沉淀。 D谷氨酸结晶操作 中要控制条件， 避免 型结晶析出。 4中和使用 NaCO3，在 pH7左右得到谷氨酸一钠，在 pH9-10得到的是谷氨酸二钠，因此中和应严格控制 反应的 pH。 5注意配料顺序：硫酸镁和磷酸氢二钾应分别溶解， 交叉加入 六实验数据处理方法 1）菌体 OD ： 吸取 0.5ml发酵液，加入 9.5ml水稀释并 摇匀，采用 7200分光光度计于 600nm下（ 752型 620nm） 测定吸光值。 2） pH值 :在线测定 3） 还原糖 含量 :用裴林试剂测定 4） 镜检 ：每隔 6小时检测菌体的生长状况，要求无杂菌 和噬菌体。 5） GA含量： 从发酵 12小时开始，每隔 4小时测定 GA 含量 ， GA用 茚三酮比色法 测定。 6）糖酸转化率 发酵液中生成的谷氨酸量和消耗的葡萄糖质量的比例。 转化率 =Vt GA%/V0 初糖 %(Vt 发酵放罐体 积 ;V0 初始定容体积 ) 七实验结果分析 1 实验过程中每间隔 2h取样一次，分别测定还原糖、 溶氧、通气量、 PH、菌体浓度、谷氨酸含量等指标的 过程曲线，绘制谷氨酸发酵过程曲线图，并解释曲线 变化的原因。 2、计算谷氨酸产量、糖酸转化率、谷氨酸提取收率 等指标； 以发酵零小时的投入糖量除以发酵终 了的谷氨酸总质量，得到谷氨酸的转化率。 3比较各小组实验结果，评价本小组谷氨酸发酵及味 精制作的结果，总结实验过程中的得与失。 4根据所得产量，分析影响味精产量的因素。 八 思考题 1为什么以尿素为氮源的发酵控制中，增加风量 和提高溶氧会造成发酵液 PH的上升？ 2以谷氨酸发酵过程中 pH值的变化规律为例，说 明为什么 pH值的变化是反应过程中菌体生长和产 物合成的综合性指标？ 3发酵过程实现高的产酸，应如何防止杂菌及噬 菌体感染？ 主要参考文献 发酵工程实验指导 吴根福 主编 高等教育出版社 2006.5ISBN7-04-018619-5 生物工程专业实验 贾世儒 主编 中国轻工业出版社 2004.7 ISBN7-5019-4390-7 固定化原生质体半连续发酵生产谷氨酸 文章编号 0254-5071（ 2010） 06-0121-02 缪静 冯志彬 呈显好 张玉香 程仕伟 张健勇 Intnert 谢谢 ！ 缓冲 溶 液 的 制 备 : 配 制 p H 6 . 0 的 NaAc - HAc 缓冲溶液。 谷氨酸标准液的配制 :用天平准确称取 1. 0000g谷氨酸标准品 ,溶于 1L 缓冲溶 液中。 再采用逐级稀释法配得浓度为 80 g/ mL、 90 g/ mL至 140 g/ mL 的谷氨酸 标准液。 茚三酮试剂的制备 :称取 0. 5g 茚三酮溶于 100mL 水中得到 5g/ L 的茚三酮水 溶液。 1 实验方法 2 标准曲线的确定 分别吸取 80 140g/ mL 的谷氨酸标准液 5mL 于 25mL 的比色管中 ,各加入 1mL 的茚三酮试剂 ,加上塞充分摇匀。将其置于 90 下水浴 20 25 min ,冷却至室 温 ,用 7200 型分光光度计在 569nm 下测得其光密度值 2 。以标准液的光密度值和 浓度做一标 准曲线。 3 样品的测定 稀释待测液于 80 140g/ mL 内 (谷氨酸发酵液浓度一般在 8 % 14 % ,测量 时稀释 1000 倍即可 ) ,调 p H 为 6. 0。以同样的反应量与反应条件进行反应 ,并 在 569nm 下测定其光密度值。由以上所得标准曲线对应查得待测稀释液的浓 度 ,再乘以稀释倍数即为谷氨酸待测液的浓度。