维生素类药物的分析

药 物 分 析 学 （ 第 14章 ）维 生 素 类 药 物 的 分 析 （ 1）本 节 教 师 ： 韩 海 （ 博 士 /副 教 授 )暨 南 大 学 药 学 院Tel: 18620908821E-mail: QQ: 56011856 2013.10.30 维 生 素 类 药 物 的 分 析 基 本 内 容 维 生 素 A、 维 生 素 B1、 维 生 素 C、 维 生 素 D和 维 生 素 E的 结 构 和 性 质 、 鉴 别 试 验 、 含 量测 定 ， 以 及 游 离 生 育 酚 的 检 查 。 基 本 要 求 掌 握 ： 维 生 素 类 药 物 的 结 构 与 分 析 方 法 的关 系 ， 维 生 素 A的 紫 外 分 光 光 度 法 ， 维 生 素C的 碘 量 法 。 维 生 素 类 药 物 的 分 析 熟 悉 ： 维 生 素 A的 三 氯 化 锑 反 应 及 比 色 法 ，维 生 素 E的 鉴 别 试 验 及 气 相 色 谱 法 ， 维 生 素B1的 硫 色 素 反 应 及 紫 外 分 光 光 度 法 、 非 水滴 定 法 ， 维 生 素 C的 2， 6二 氯 吲 哚 酚 滴 定法 ， 维 生 素 D的 鉴 别 试 验 。 了 解 ： 该 类 药 物 的 其 他 分 析 项 目 与 方 法 ，维 生 素 D含 量 测 定 的 高 效 液 相 色 谱 法 ， 维 生素 A三 点 校 正 法 的 推 导 过 程 。 课 时 安 排 ： 总 学 时 ： （ 5学 时 ） 维 生 素 A、 维 生 素 B1 （ 3学 时 ） 重 点 内 容 ： 维 生 素 A的 紫 外 分 光 光 度 法 维 生 素 C、 D、 E； 复 习 及 习 题 （ 2学 时 ） 概 述 特 点 ：1.非 蛋 白 质 、 非 脂 肪 、 非 糖 类 的 有 机 化 合物 .具 有 较 强 的 生 理 活 性 ， 体 内 不 能 合 成 。2.多 为 醇 、 酯 、 胺 、 酸 、 酚 和 醌 类 ； 各 具不 同 的 理 化 性 质 和 生 理 作 用 。 CH2OR CH 3 3CH 3 CH CH3 CH3 维 生 素 A (retinal) N N NH3N S+ OHCH3 H3C Cl,HCl CH2 CH3HHO CH3 HH CH3 CH3H 维 生 素 D3 (colecalciferol， 胆 骨 化 醇 )维 生 素 B1(Thiamine hydrochloride,盐 酸 硫 胺 ) 类 别 名 称 每 日 所 需 (mg)Vit A 1 Vit D 0.025Vit E Vit K 1Vit B1 1.5 Vit B2 2Vit B6 3 Vit B12 0.005Vit H 0.25 Vit C 60 生 物 素 酶 缺 乏VC缺 乏 、 酸 化 尿 水 溶 性 主 要 作 用 间 歇 性 跛 行 周 围 神 经 炎核 黄 素 缺 乏 症 VB6依 赖 综 合 症 、 缺 乏 症恶 性 贫 血 、 神 经 系 统 疾 病 脂 溶 性 抗 干 眼 病 ， VA缺 乏 症佝 偻 病 ， 骨 软 化 症 抗 出 血 维 生 素 3.分 类 :脂 溶 性 和 水 溶 性 脂 溶 性 ： 维 生 素 A、 D、 E、 K等 ； 水 溶 性 ： 维 生 素 B组 (B1、 B2等 )、 烟 酸 、泛 酸 、 叶 酸 及 抗 坏 血 酸 。 其 中 脂 溶 性 维 生 素 在 体 内 可 直 接 参 与 代 谢 的 调节 作 用 ， 而 水 溶 性 维 生 素 是 通 过 转 变 成 辅 酶 对代 谢 起 调 节 作 用 。4. 测 定 方 法 :生 物 、 微 生 物 、 化 学 和 物 理 化 学 的 方 法 . 第 一 节 维 生 素 A的 分 析维 生 素 A主 要 存 于 动 物 性 食 物 中 ， 但 有 色 植 物 中 的 -胡 萝 卜 素 即 VA原 含 量 丰 富 。 第 一 节 维 生 素 A的 分 析 维 生 素 A 维 生 素 A1（ 视 黄 醇 ） 维 生 素 A2（ 去 氢 维 生 素 ） 维 生 素 A3 （ 去 水 维 生 素 ）全 反 式 维 生 素 A CH2OR CH 3 3CH 3 CH CH3 CH3 一 、 结 构 与 性 质 CH2OR CH 3 3CH 3 CH CH3 CH3 维 生 素 A (retinal) 1 共 轭 多 烯 结 构 ：具 有 强 紫 外 吸 收 （ 在 325328nm有 最 大 吸 收 ） ，可 采 用 紫 外 吸 收 光 谱 法 进 行 鉴 别 ， 采 用 紫 外 分 光光 度 法 进 行 含 量 测 定 。存 在 多 种 立 体 异 构 化 合 物天 然 维 生 素 A是 全 反 式 维 生 素 A。 其 它 异 构 体 具 有相 似 的 化 学 性 质 ， 但 生 物 效 价 不 同 。 （ 表 9-2） max 相 对 生 物 效 价维 生 素 A （ 全 反 ） 325.5 100% 新 维 生 素 Aa （ 2-顺 ） 328 75%新 维 生 素 Ab （ 4-顺 ） 320. 5 24%新 维 生 素 Ac （ 2、 4-顺 ） 310.5 15%异 维 生 素 Aa （ 6-顺 ） 323 21%异 维 生 素 Ab （ 2、 6-顺 ） 324 24% 一 、 结 构 与 性 质 2.结 构 式 中 R的 不 同 ， 可 以 形 成 维 生 素 A醇 或 其 酯 。临 床 上 多 用 其 醋 酸 酯 和 棕 榈 酸 酯 。 （ 表 14-1） 3.易 氧 化 变 质 ： 有 多 个 不 饱 和 键 ， 性 质 不 稳 定 ，易 被 空 气 中 氧 或 氧 化 剂 氧 化 ， 生 成 无 活 性 物 质 。 CH2OR CH 3 3CH 3 CH CH3 CH3 -H 维 生 素 A醇-COCH3 维 生 素 A醋 酸 酯-COC15H31 维 生 素 A棕 榈 酸 酯R : CH2OH CH2去 氢 维 生 素 A（ A2 dehydroretinol) 去 水 维 生 素 A（ A3 anhydroretinol) 一 、 结 构 与 性 质 4.溶 解 性 ： （ 脂 溶 性 ） 能 与 氯 仿 、 乙 醚 、 环 己 烷或 石 油 醚 任 意 混 合 ， 在 乙 醇 中 微 溶 ， 在 水 中 不 溶 。 5.能 与 三 氯 化 锑 呈 色 ： 在 氯 仿 中 能 与 三 氯 化锑 试 剂 作 用 ， 产 生 不 稳 定 的 蓝 色 。 二 、 鉴 别 试 验 （ 一 ） 三 氯 化 锑 反 应 （ Carr-Price反 应 ） 维 生 素 A在 饱 和 无 水 三 氯 化 锑 的 无 醇 氯 仿 溶 液中 ， 即 显 蓝 色 ， 渐 变 成 紫 红 色 。 + CH2 -RCOOSbCl5 -RCOOSbCl5+CH2 蓝 色紫 红CH3 CH3 CH2COORCH3 CH3SbCl5 二 、 鉴 别 试 验讨 论 ：1.实 际 起 作 用 的 是 三 氯 化 锑 ( )中 存 在 的Lewis酸 氯 化 高 锑 (V) 2.反 应 要 用 无 醇 氯 仿 ， 因 为 醇 的 存 在 要 作为 亲 核 反 应 物 与 正 碳 离 子 反 应 而 使 其 正电 荷 消 失 。 3.反 应 要 无 水 ， 水 可 使 三 氯 化 锑 水 解 为 氧氯 化 锑 。 （ 二 ） 紫 外 吸 收特 征 ： 1. 直 接 测 定 维 生 素 A1 在 326nm处 有 最 大 吸 收 。 2.酸 消 去 后 测 定 维 生 素 A3（ 去 水 维 生 素 A）在 332nm附 近 有 曲 折 ，在 348、 367、 389nm附 近 有 吸 收 峰 。 1、 为 什 么 吸 收 带 红 移 ？ 2、 为 什 么 吸 收 峰 变 多 ？ CH3 CH3 CH2ORCH3 CH3CH3 CH2 二 、 鉴 别 试 验 Vit AVit A3 维 生 素 A(醇 )在 盐 酸 存 在 下 解 离 ， 随 即 正 电 荷 转 移 至紫 萝 酮 环 上 的 碳 上 ， 然 后 失 去 一 个 质 子 而 生 成 去 水维 生 素 A： 1、 为 什 么 吸 收 带 红 移 ？ 去 水 维 生 素 A比 维 生 素 A多 一 个 共 轭 双 键 ， 因 而红 移 。 Konjugierte吸 收 Fieser规 则 、 Scoot规 则 2、 为 什 么 吸 收 峰 变 多 ？ （ 思 考 题 ， 请 查 询 紫 外 光 谱 原 理 的 相 关 资 料 ） （ 三 ） 薄 层 层 析条 件 1： （ BP2000）硅 胶 板溶 剂 ： 环 己 烷展 开 剂 ： 环 己 烷 乙 醚 （ 80:20）三 氯 化 锑 试 剂 显 色 ， 以 标 准 品 同 时 进 行 对 照条 件 2：硅 胶 板溶 剂 ： 氯 仿展 开 剂 ： 环 己 烷 乙 醚 （ 80:20）磷 钼 酸 显 色 ， 以 标 准 品 同 时 进 行 对 照 三 、 含 量 测 定维 生 素 A的 测 定 CHP收 载 三 种 HPLC法UV 三 氯 化 锑 法 三 、 含 量 测 定 紫 外 分 光 光 度 法 三 氯 化 锑 比 色 法 （ 专 属 性 差 ， 显 色 不 稳 定 ） 前 者 是 法 定 方 法 ， 后 者 多 用 于 食 品 或 饲 料 中 的 维 生 素A的 测 定 （ 行 业 方 法 ） 。 HPLC法 具 有 强 紫 外 吸 收 （ 在 325328nm有 最 大 吸 收 ） ， 可 采用 紫 外 分 光 光 度 法 进 行 含 量 测 定 。 CH2OR CH 3 3CH 3 CH CH3 CH3 紫 外 分 光 光 度 法 目 前 各 国 药 典 均 采 用 紫 外 分 光 光 度 法 测 定 维 生 素 A的含 量 。 本 法 快 速 、 准 确 、 经 济 ， 测 定 结 果 能 比 较 正 确地 反 映 维 生 素 A的 效 价 。 如 何 测 定 ？ 1.根 据 紫 外 光 谱 数 据 : 定 量 维 生 素 A在 不 同 溶 剂 中 的 紫 外 吸 收 数 据 max(nm) 换 算 因 子 max(nm) 换 算 因 子环 己 烷 327.5 1530 1900 326.5 1755 1900 异 丙 醇 325 1600 1830 325 1820 1830 溶 剂 Vit A acetate Vit A alcohol%cm1 %cm1其 最 大 吸 收 峰 的 位 置 随 溶 剂 的 不 同 而 异 2.能 否 直 接 测 定 ？能 直 接 测 定 的 条 件 ： 1.仪 器 符 合 药 典 的 要 求 2.溶 剂 及 样 品 中 的 基 质 等 其 他 组 分 在 测 定 波 长处 无 干 扰 （ 1） 而 维 生 素 A原 料 药 中 常 混 有 杂 质 ， 如 维 生 素 A2、维 生 素 A3。 （ 2） 维 生 素 A的 氧 化 产 物 ： （ 3） 维 生 素 A在 光 照 下 产 生 的无 生 物 活 性 的 聚 合 物 鲸 醇 ： （ 4） 维 生 素 A的 顺 反 异 构 体 ； （ 5） 合 成 时 产 生 的 中 间 体 这 些 杂 质 在 维 生 素 A的 最 大 吸 收 波 长 （ 310340nm） 波 长 范 围 内 有 吸 收 ， 干 扰 维 生 素 A的测 定 ， 所 测 得 的 吸 收 度 不 是 维 生 素 A所 独 有 。 所 以 不 能 直 接 测 定 维 生 素 A的 用 于 定 量 要 消 除 杂 质 的 干 扰三 点 校 正 法 三 点 校 正 法 测 定 维 生 素 A的 含 量 本 法 是 用 在 三 个 波 长 处 测 得吸 收 度 ， 根 据 校 正 公 式 计 算吸 收 度 A校 正 值 后 ， 再 计 算 含量 。 原 理 ： 杂 质 的 吸 收 在 310340nm波长 范 围 内 呈 一 条 直 线 ， 且 随 波 长的 增 大 ， 吸 收 度 变 小 。 物 质 对 光 的 吸 收 度 具 有 加 和 性 ，因 而 吸 收 曲 线 也 是 他 们 吸 收 曲 线的 叠 加 。 A nmVit A samplepure VA acetateimpurities 原 则 ： 最 大 吸 收 波 长 处 一 点 ， 最 大 吸 收 波 长 的两 侧 各 选 一 点 。 1.中 国 药 典 测 定 维 生 素 A醋 酸 酯 等 波 长 差 法在 1的 左 右 各 选 一 点 为 2和 3； 使 3 1 1 2。 规 定 1 328nm， 2 316nm， 3 340nm合 成 Vit A天 然 鱼 肝 油 2.中 国 药 典 测 定 维 生 素 A醇 等 吸 收 比 法在 1的 左 右 各 选 一 点 为 2和 3；使 A 2 A3=6/7A 1。 规 定 1 325nm， 2 310nm， 3 334nm 第 一 法 ： 测 定 维 生 素 A醋 酸 酯 的 方 法 等 波长 差 法 基 本 思 想 ： 先 判 断 杂 质 的 干 扰 是 否 影 响 测 定 及影 响 程 度 （ 五 点 波 长 法 ） ， 再 决 定 用 哪 个 吸 收度 进 行 含 量 计 算 。 1.取 维 生 素 A醋 酸 酯 ， 精 密 称 定 ， 加 环 己 烷 制成 每 1m1中 含 915单 位 的 溶 液 。 然 后 在 300、316、 328、 340、 360nm五 个 波 长 处 分 别 测 定吸 收 值 。 合 成 Vit A天 然 鱼 肝 油测 定 方 法 中 国 药 典 2. A值 的 选 择 法 : 按 中 国 药 典 附 录 J维 生 素 A测 定 法 的 规 定 。 计 算 各 波 长 下 的 吸 收 度 与328nm波 长 下 的 吸 收 度 的比 值 。 并 确 定 最 大 吸 收 波 长(应 为 328nm)。五 个 吸 收 度 比 值 分 别 与 规定 的 吸 收 度 比 值 相 减 ， 即 得到 五 个 差 值 。 判 断 每 个 差 值是 否 超 过 规 定 的 0.02。 1.理 想 状 况 :杂 质 几 乎 没 有 形 成 干 扰 。 判 断 标 准 ： 最 大 吸 收 波 长 在 326 329nm之 间 ，计 算 吸 收 度 比 值 Ai /A328， 并 与 规 定 值 相 减 ， 差值 不 超 过 0.02 A值 选 择 ： 选 择 A328计 算 含 量 2. 非 理 想 状 况 :杂 质 有 干 扰 。 判 断 标 准 （ 符 合 以 下 两 点 之 一 ） (1) 最 大 吸 收 波 长 在 326 329nm之 间 ， 5个 波 长下 的 Ai /A328与 规 定 值 之 差 有 一 个 或 几 个 超 过 0.02 ； (2)最 大 吸 收 波 长 不 在 326 329nm之 间 。 A值 选 择 ： 先 计 算 出 ： 再 计 算 出 再 根 据 以 下 三 种 不 同 情 况 选 择 （ 1） 若 所 得 的 数 值 在 3%， 表 明 杂 质 干 扰 很小 ， 则 仍 用 A328计 算 含 量 ； （ 2） 若 所 得 的 数 值 在 -15% -3%之 间 ， 表 明杂 质 有 一 定 的 干 扰 ， 则 需 用 A328（ 校 正 ） 计 算含 量 ； 340316328328 2523 AAA.A 校 正 %100A AAf 328 328)(328 校 正 如 何 计 算 标 示 量 的 百 分 含 量 ？ 第 二 步 ： 求 第 三 步 ： 求 效 价 （ IU/g） ： 效 价 系 指 每 克 供 试品 中 所 含 维 生 素 A的 国 际 单 位 数 。 如 何 换 算 成 效 价 （ IU/g） ？ 换 算 因 子 ： 定 义 为 每 1个 数 值 所 相 当 的效 价 。 )(%cm1 样 l(%)C A% )(cm1 样 （ C单 位 为 g/100ml） )(%cm1 样 )(%cm1 样 %1 /cmE gIU ）效 价 （换 算 因 数 VitA的 标 示量 为 效 价 ！ 醋 酸 酯维 生 素 Ag344.0IU1 2907000g344.0 g101g/IU 6 ）效 价 （1g维 生 素 A醋 酸 酯 相 当 的 国 际 单 位 数 为 ：15302907000E g/IU% )(cm1 纯 ）效 价 （换 算 因 数 1900 效 价 IU/g = E 1cm1% 1900(溶 剂 :环 己 烷 ) 醇维 生 素 Ag300.0IU1 1g维 生 素 A醇 相 当 的 国 际 单 位 数 为 ：3330000g300.0 g101g/IU 6 ）效 价 （ 18203330000E g/IU% )(cm1 纯 ）效 价 （换 算 因 数 1830 效 价 IU/g = E 1cm1% 1830(溶 剂 :环 己 烷 ) 第 四 步 ： 求 标 示 量 标 示 量 样 品 标 签 上 注 明 的 每 胶 丸 含 有 的 维生 素 A醋 酸 酯 的 国 际 单 位 数 (效 价 ， 非 含 量 ！ ) 1.求 维 生 素 A醋 酸 酯 胶 丸 为 标 示 量 的 百 分 含 量 : IU/丸 标 示 量 % =- 100% 标 示 量 IU/丸 = IU/g g/丸 = IU/g W IU/g W 标 示 量 % = - 100% 标 示 量 %100100% %11%11 WW EDLEA cmcm 标 示 量 换 算 因 子标 示 量 换 算 因 子）效 价 （ 样样 % )(1)(/ cmEgIU 测 定 含 量 单 位 质 量 1g对 应的 效 价效 价 占 单 位 样 品 质量 的 百 分 比效 价 （ 标 示 ） 占 单位 质 量 的 百 分 比 或 者 ： A直 接 测 得 的 A328或 校 正 后 的 A328 (校 正 )； D供 试 品 的 稀 释 倍 数 ； 1900换 算 因 数 ； W胶 丸 的 平 均 内 容 物 重 量 ， g； W称 取 供 试 品 取 量 ， g； l比 色 池 厚 度 ， cm； 标 示 量 样 品 标 签 上 注 明 的 每 胶 九 含 有 的 维 生 素 A醋酸 酯 的 国 际 单 位 数 。 标 示 量标 示 量 100100 1900 LW WDA （ 3） 若 所 得 的 数 值 小 于 -15%或 大 于 +3%， 或 最大 吸 收 波 长 不 在 326 329nm之 间 ， 表 明 杂 质 干扰 很 大 ， 已 经 不 适 宜 再 用 本 法 测 定 。 则 应 采 用第 二 法 （ 皂 化 法 ） 测 定 。 图 示 ： 用 第 二 法 测 定 用 A328（ 校 正 ） 计 算 用 A328 计 算 用 第 二 法 测 定 -15% -3% 0 +3% 第 二 法 ： 中 国 药 典 适 用 于 维 生 素 A醇 （ 含 杂 质较 多 的 维 生 素 A ） 的 方 法 等 吸 收 比 法 、 6/7A法 第 一 法 无 法 消 除 杂 质 干 扰 时 用 此 法 iKOH Anm mlIU VitAVitAS 处 测 、于稀 释 至溶 解 异 丙 醇除 去 植 物 油 的 干 扰 甘 油 和 脂 肪 酸 盐植 物 油 醇醋 酸 酯皂 化 液 挥 干 乙 醚乙 醚 提 取 乙 醇334 325310300/159/ 2. A值 的 选 择 法 : 按 中 国 药 典 附 录 J维 生 素 A测 定 法的 规 定 。 判 断 max是 否 在 323 327nm之 间 计 算 325300 AA是 否取 未 皂 化 样 品 采 用 色谱 法 纯 化 后 再 测 定 判 断 A300 /A325 是 否 大 于 0.73是 否取 未 皂 化 样 品采 用 色 谱 法 纯化 后 再 测 定 计 算 A325(校 正 ) 334310325325 260455528156 A.A.A.A 校 正 %100 325 325)(325 A AAf 校 正 0 3% 3% 校 正325A 325A 校 正325A f 如 何 计 算 含 量 ？ 1.求 E 1cm1% E 1cm1% =A/CL（ C单 位 为 g/100ml） 2.求 效 价 （ IU/g） ： IU/g= E 1cm1% 1830 3.求 维 生 素 A醇 为 标 示 量 的 百 分 含 量 : IU/丸 标 示 量 % = - 100% 标 示 量 IU/丸 = IU/g g/丸 = IU/g W IU/g W 标 示 量 % = - 100% 标 示 量 A直 接 测 得 的 A328或 校 正 后 的 A328 (校 正 )；1830换 算 因 子 ；D供 试 品 的 稀 释 倍 数 ；W胶 丸 的 平 均 内 容 物 重 量 ， g；W称 取 供 试 品 取 量 ， g；l比 色 池 厚 度 ， cm；标 示 量 样 品 标 签 上 注 明 的 每 胶 九 含 有 的 维 生 素 A醋酸 酯 的 国 际 单 位 数 。 关 于 三 点 校 正 法 测 定 维 生 素 A 含 量 方 法 的 讨 论 1） 维 生 素 A醋 酸 酯 的 吸 收 度 校 正 公 式 是 用 直 线方 程 式 法 （ 即 代 数 法 ） 推 导 而 来 ： 维 生 素 A醇 的 吸 收 度 校 正 公 式 是 用 相 似 三 角形 法 （ 几 何 法 或 6/7定 位 法 ） 推 导 而 来 。 （ 了 解 ） 关 于 三 点 校 正 法 测 定 维 生 素 A 含 量 方 法 的 讨 论 2） 在 应 用 三 点 校 正 法 时 ， 除 其 中 一 点 在 最 大 吸 收 波长 处 测 定 外 ， 其 余 两 点 均 在 最 大 吸 收 峰 的 两 侧 进 行 测 定 。如 果 仪 器 波 长 精 度 不 准 确 时 ， 会 产 生 较 大 误 差 。 因 此 ： 在 测 定 前 务 必 要 校 正 波 长 ，（ ChP， Appendix IV A） 可 用 全 反 式 维 生 素 A进 行 测 定 ，比 较 测 定 结 果 和 比 值 是 否 与 对 照 品相 符 合 ， 以 进 一 步 核 对 仪 器 波 长 是否 准 确 。 测 定 的 样 品 应 不 得 少 于 两 份 。 关 于 三 点 校 正 法 测 定 维 生 素 A 含 量 方 法 的 讨 论 3） 皂 化 后 提 取 应 避 免 强 烈 振 动 以 免 引 起 乳 化 。 皂 化 的全 部 过 程 应 连 氮 并 应 在 最 短 时 间 内 完 成 。 标 准 品 及 样 品的 处 理 ， 应 避 免 接 触 金 属 器 皿 。 4） 不 适 宜 用 第 一 法 测 定 的 维 生 素 A醋 酸 酯 。 改 用 第二 法 （ 皂 化 法 ） 测 定 后 。 其 换 算 因 子 也 相 应 改 为 维 生 素A醇 的 换 算 因 子 1830， 计 算 时 必 需 注 意 ！ ！ 5） 中 国 药 典 收 载 的 维 生 素 A胶 丸 、 维 生 素 AD滴 剂 、维 生 素 AD胶 丸 等 均 采 用 三 点 校 正 法 测 定 。 应 用 示 例 一 VitAD胶 丸 中 VitA的 含 量 测 定精 密 称 取 本 品 (规 格 10,000VitAIU/丸 )装 量 差 异 项 下 （ 平 均 装 量0.07985g/丸 ） 的 内 容 物 0.1287g 至 50ml量 瓶 中 ， 用 环 己 烷 稀释 至 刻 度 ， 摇 匀 ； 精 密 量 取 2.0ml， 置 另 一 50 ml量 瓶 中 ， 用 环己 烷 稀 释 至 刻 度 ， 摇 匀 。 以 环 己 烷 为 空 白 ， 测 定 最 大 吸 收 波 长为 328nm， 并 在 下 列 波 长 处 测 得 吸 收 度 如 下 ， 计 算 Vit A的 标 示量 百 分 含 量 。 (nm) 300 316 328 340 360A 0.374 0.592 0.663 0.553 0.228 (nm) 300 316 328 340 360A i 0.374 0.592 0.663 0.553 0.228A i/A328 0.564 0.893 1.000 0.834 0.344A 规 定 0.555 0.907 1 0.811 0.299A 0.009 -0.014 0.000 0.023 0.045 637.0553.0592.0663.0252.3 AAA252.3A 340316328328 校 正 %)3%15(%92.3%100 328 328)(328 A AA 校 正A=A328校 正 %9.93 1001000007985.01005015021287.0 1900637.0 100)ml100/g(C 1900A% 328 标 示 量平 均 丸 重标 示 量 校 正 维 生 素 A的 HPLC法 （ 请 自 学 ）色 谱 条 件 正 相 色 谱 法 ！色 谱 柱 ： 硅 胶 柱流 动 相 ： 正 己 烷 -异 丙 醇 （ 997:3)检 测 波 长 325 nm外 标 法 ： Vit A 酯 维 生 素 A的 三 氯 化 锑 比 色 法 原 理 ： 维 生 素 A与 三 氯 化 锑 的 无 水 氯 仿 溶液 作 用 ， 产 生 不 稳 定 的 蓝 色 ， max 618nm 620nm ， 符 合 Beer定 律 。 方 法 ： 标 准 曲 线 法 。 特 点 ： 1.需 在 510秒 钟 内 测 定 。 呈 色 不 稳 定 2.受 温 度 影 响 很 大 3.需 要 无 水 条 件 4、 三 氯 化 锑 有 腐 蚀 性 5.非 专 属 反 应 ； 如 新 维 生 素 A 、 去 水 维 生 素 A及胡 萝 卜 素 等 物 质 ， 均 与 三 氯 化 锑 均 显 蓝 色 ， 故在 测 定 天 然 维 生 素 A时 ， 测 定 值 往 往 偏 高 . 6.简 易 ， 操 作 迅 速 。 目 前 仍 为 食 品 或 饲 料 中 维生 素 A测 定 常 用 的 方 法 。 第 二 节 水 溶 性 维 生 素 维 生 素 B1的 分 析 VB1又 称 盐 酸 硫 胺 素 ，是 由 一 个 噻 唑 环 和 氨 基嘧 啶 环 通 过 亚 甲 基 连 接而 成 的 季 铵 化 合 物 。 在 生 物 体 内 主 要 以 焦 磷酸 硫 胺 素 （ TPP） 形 式存 在 。 VB1和 糖 代 谢 关 系 密 切 ，当 缺 乏 时 造 成 丙 酮 酸 积累 易 引 起 神 经 炎 和 脚 气病 。 氨 基 嘧 啶 环 噻 唑 环N N NH2CH2 N SCH3 OHH3C 123 4 512 3 456 Cl , HCl亚 甲 基 季 铵亦 称 盐 酸 硫 胺 ,具 有 维 持 糖 代 谢 及 神 经 传 导 与 消化 的 正 常 功 能 ， 主 要 用 于 治 疗 脚 气 病 、 多 发 性神 经 炎 和 胃 肠 道 疾 病 一 、 结 构 及 性 质 结 构 特 点 ：1 氨 基 嘧 啶 环 和 噻 唑 环 ： 具 有 硫 色 素 反 应 ， 此 反 应 专 属性 强 ， 用 于 鉴 别 和 含 量 测 定 。2. 母 核 具 N杂 环 ， 有 弱 碱 性 ，1） 可 以 与 生 物 碱 沉 淀 剂 反 应 ， 产 生 沉 淀 ， 用 于 鉴 别 与 含量 测 定 。2） 可 以 在 冰 醋 酸 中 与 高 氯 酸 定 量 反 应 ， 用 于 含 量 测 定 。3 共 轭 体 系 ： 具 紫 外 吸 收 ， 用 于 含 量 测 定 。4 盐 酸 根 ： 呈 氯 化 物 的 反 应 ， 用 于 鉴 别 。 一 、 结 构 及 性 质 理 化 性 质 (1)溶 解 性 本 品 在 水 中 易 溶 ， 水 溶 液 显 酸 性 反应 。 在 乙 醇 中 微 溶 ， 在 乙 醚 中 不 溶 。 (2)具 有 紫 外 吸 收 本 品 约 12.5 g m1盐 酸 溶 液(91000)， max = 246nm， 百 分 吸 收 系 数 为406436。 (3)在 碱 性 中 遇 氧 化 剂 ， 如 铁 氰 化 钾 ， 可 被 氧 化为 具 有 荧 光 的 硫 色 素 ， 后 者 溶 于 正 丁 醇 中 呈 蓝色 荧 光 。 N N NH2CH2 N SCH3 OHH3C 123 4 512 3 456 Cl , HCl (4)分 子 中 含 有 两 个 杂 环 (嘧 啶 环 和 噻 唑 环 )， 故可 与 某 些 生 物 碱 沉 淀 试 剂 (如 碘 化 汞 钾 、 三 硝 基酚 、 碘 溶 液 、 硅 钨 酸 等 )反 应 生 成 组 成 恒 定 的 沉淀 。 (5)水 溶 液 呈 氯 化 物 的 反 应 ， 用 于 鉴 别 。 (6)干 燥 品 很 稳 定 ， 酸 性 水 溶 液 稳 定 ， 在 碱 性 溶液 中 ， 噻 唑 环 开 环 ， 迅 速 分 解 。N N NH2CH2 N SCH3 OHH3C 123 4 512 3 456 Cl , HCl 二 、 鉴 别 试 验 (一 )硫 色 素 反 应 硫 色 素 反 应 为 维 生 素 B1所 特 有 ， 中 国 药 典 以 此进 行 鉴 别 。 (1)原 理 (2)方 法 取 本 品 约 5mg， 加 氢 氧 化 钠 试 液 2.5m1溶 解 后 ，加 铁 氰 化 钾 试 液 0.5m1与 正 丁 醇 5m1， 强 力 振 摇 2min，放 置 分 层 ， 上 面 的 醇 层 显 强 烈 的 蓝 色 荧 光 。 加 酸 使 成酸 性 ， 荧 光 即 消 失 。 再 加 碱 使 成 碱 性 ， 荧 光 又 显 出 。 蓝 色 荧 光硫 色 素 正 丁 醇 OOH 荧 光 消 失蓝 色 荧 光 硫 色 素 正 丁 醇）（ 环 合 HCNFeK OHNaOHVitB 63 21 O OH (二 )沉 淀 反 应 (1) (2) (3) (4)与 苦 酮 酸 作 用 形 成 不 溶 于 水 的 扇 形 两 头 弯 成螺 旋 状 的 白 色 结 晶 。 其 他 维 生 素 与 苦 酮 酸 不 发生 反 应 ！ 嘧 啶 环 伯 氨噻 唑 环 季 铵 4242 HgIHBHgIK 淡 黄 2KII IHIB2 红 色H+ 白 色硅 钨 酸 H+ OH4WO12 OHSiOB 23 222 （ 三 ） 加 碱 分 解 后 与 醋 酸 铅 反 应 水 溶 液 加 醋 醋 铅 试 液 和 氢 氧 化 钠 试 液 并 加热 ， 溶 液 由 黄 色 棕 色 最 后 生 成 黑 色 沉淀 。 苛 性 碱 分 解 维 生 素 B1， 产 生 的 硫 化 钠 与 醋酸 铅 作 用 生 成 黑 色 硫 化 铅 沉 淀 。S元 素 反 应 PbSNaSVitB AcPbNaOH （ 四 ） 水 溶 液 显 氯 化 物 的 特 殊 反 应 OHNHAgNO AgCl 白3HNO HNO 蓝淀 粉 试 纸 KIMnO ClHCl-反 应 三 、 含 量 测 定 方 法 种 类 ： 硅 钨 酸 重 量 法 、 BP（ 1998） 硫 色 素 荧 光 法 、 USP（ 24） 非 水 溶 液 滴 定 法 、（ Chp 测 定 维 生 素 B1原 料 药 ） 紫 外 分 光 光 度 法 。（ Chp 测 定 维 生 素 B1制 剂 ） 1 硅 钨 酸 重 量 法 简 介BP（ 2000） 、 Chp（ 1990） 方 法维 生 素 B1在 酸 性 溶 液 中 与 硅 钨 酸 作 用 产 生 沉 淀 ，根 据 沉 淀 的 重 量 即 可 计 算 其 含 量 。特 点 ： 原 理 简 单 ， 但 操 作 繁 琐 费 时 ，试 剂 易 得 ，结 果 较 为 准 确 。OHHCl OHWOOHSiOOSClNHC OHWOSiOHClOSClNHC H 2 2322241712 23241712 4 412 26122 白）（）（ MW： 3479.22 2.硫 色 素 荧 光 法 p222 USP（ 24） 方 法 原 理 : 盐 酸 硫 胺 在 碱 性 溶 液 中 ， 被 氧 化 剂 （ 如铁 氰 化 钾 ） 氧 化 生 成 硫 色 素 ， 用 异 丁 醇提 取 ， 在 紫 外 光 照 射 下 呈 现 蓝 色 荧 光 ，与 已 知 浓 度 的 标 准 品 溶 液 所 得 荧 光 进 行比 较 或 测 定 荧 光 强 度 ， 可 求 得 供 试 品 中B1的 含 量 。 方 法 ： 教 材 P2601. 铁 氰 化 钾 溶 液 要 新 配2.标 准 品 、 供 试 品 逐 步 定 量 稀 释3.标 准 品 、 供 试 品 各 测 定 两 份 以 上 ,取 均 值 定 量 。 并 与 空 白 试 验 校 正 。讨 论 1.硫 色 素 反 应 为 维 生 素 B1所 特 有 ， 为 高 专 属 性 反 应 。 适用 于 维 生 素 B1制 剂 的 含 量 测 定 .2.反 应 非 定 量 完 成 ， 但 在 一 定 条 件 下 ， 形 成 的 硫 色 素 与维 生 素 B1浓 度 成 正 比 .3.操 作 繁 琐 费 时 ,且 干 扰 荧 光 测 定 的 因 素 较 多 . 3.非 水 溶 液 滴 定 法 ： （ Chp2000 测 定 维 生 素 B1原 料 药 的 方 法 ）原 理 : 维 生 素 B1分 子 中 有 两 碱 性基 团 ， 在 非 水 溶 液 中 均 可 与高 氯 酸 作 用 。 根 据 消 耗 高 氯 酸 的 量 可 计 算 维 生 素 B1的 量 HClOClOB HClOHClClB AcHg ）（ 方 法 ： 教 材 P220221摩 尔 比 为 1 2， 滴 定 度 为 16.86mg/ml mlmgnMcT /86.162 27.3371.0 %W FTVV% 空样含 量喹 那 啶 红 亚 甲 蓝 （ 紫 红 天 蓝 ） 讨 论 ： 教 材 P221 1.加 入 醋 酸 汞 的 作 用 : 2.反 应 摩 尔 比 为 1 2，分 子 量 为 337.27， 滴 定度 为 16.86mg/ml。 3.也 可 以 用 电 位 法 指 示终 点 .(更 精 确 ) 4 紫 外 分 光 光 度 法 ： （ Chp2000 测 定 维 生 素 B1片 剂 及 注 射 剂 ） 原 理 维 生 素 B1分 子 中 具 有 共 轭 双 键 结 构 ， 故具 紫 外 吸 收 ， 在 一 定 波 长 下 测 定 吸 收 度 即 可 定 量 。 1、 0.1M盐 酸2、 水3、 PH=7磷 酸 盐 缓 冲 液4、 乙 醇 方 法 :（ 维 生 素 B1片 剂 ） 取 本 品 20片 ， 精 密 称 定 ， 研 细 ， 精 密 称 取 适 量(约 相 当 于 维 生 素 B125mg)， 置 100ml量 瓶 中 ， 加盐 酸 溶 液 (91000)约 70ml， 振 摇 15min， 使 维生 素 B1溶 解 ， 加 盐 酸 溶 液 (9 1000)稀 释 至 刻 度 ，摇 匀 ， 定 量 滤 过 后 ， 再 用 盐 酸 溶 液 (9 1000)稀释 20倍 。 在 246nm波 长 处 测 定 吸 收 度 ， 按C12H17ClN4OSHCl的 吸 收 系 数 (E 1cm1% )为 421计算 ， 即 得 。 片 剂 、 注 射 剂= 421%cmE11（ 每 片 ） 相 当 于 标 示 量 的 %= %WE A%cm 100110011 标 示 量平 均 片 重稀 释 度A = ECL 规 格g/片 稀 释 度稀 释 倍 数 1g ChP （ 每 ml） 相 当 于 标 示 量 的 %= %VE A%cm 1001110011 标 示 量稀 释 度 规 格g/mlml %式 中 ， A吸 收 度 ；D供 试 品 稀 释 倍 数 ；W平 均 片 重 ；W称 取 的 片 粉 重 。维 生 素 B1注 射 液 （ 自 学 ） 讨 论 ： 维 生 素 B1在 紫 外 光 区的 特 征 吸 收 峰 随 溶 液pH的 变 化 而 变 化 。 在pH= 2时 ， 最 大 吸 收在 246nm处 ， E 1cm1% =421， 测 定 时 溶 液 的pH应 为 2。（ 0.1mol/L HCl) 1、 0.1M盐 酸2、 水3、 PH=7磷 酸 盐 缓 冲 液4、 乙 醇