培养基质量保证与质量控制

培养基质量保证与质量控制培 养 基 制 备 指 南 (SN/T1538)简 介李 卫 华山 西 出 入 境 检 验 检 疫 局 技 术 中 心 微 生 物 检 测 的 定 义n 在 特 定 的 环 境 下 （ 无 菌 ） ， 采 用 适 当 的方 法 对 样 品 中 目 标 微 生 物 进 行 增 殖 和 培养 ， 并 对 经 放 大 后 的 目 标 微 生 物 进 行 感官 、 生 理 、 生 化 等 方 面 的 特 性 分 析 和 判定 ， 以 确 定 样 品 中 目 标 微 生 物 的 量 和 /或质 的 特 性 的 过 程 。 微 生 物 检 测 涉 及 的 要 素n 检 测 人 员n 检 测 经 验 和 判 断 能 力n 检 测 设 备n 保 证 目 标 菌 种 的 生 长 的 外 部 环 境n 菌 种 试 剂n 保 证 目 标 菌 种 生 长 的 内 部 环 境n 检 测 方 法 n 选 择 适 宜 目 标 菌 种 检 测 的 方 法n 测 试 环 境n 保 证 操 作 过 程 不 受 外 界 干 扰 （ 保 护 样 品 和 人 员 ） 培 养 基 的 质 量 保 证 与 质 量 控 制n 质 量 保 证 quality assurance 为 使 人 们 能 确 信 某 个 产 品 (这 里 只 培 养 基 )能 满 足 规 定 的 质 量 要 求 所 必 须 执 行 的 有计 划 的 和 系 统 的 活 动提 出 质 量 要 求 并 制 定 系 统 的 质 量 控 制 计 划质 量 控 制 quality control 为 达 到 质 量 要 求 所 采 取 的 操 作 技 术 和 活 动为 达 到 质 量 要 求 所 采 取 的 具 体 的 技 术 操 作 培 养 基 制 备 指 南 ： SN/T1538n SN/T1538.1-2005(2005年 7月 1日 实 施 )n 第 1部 分 :实 验 室 培 养 基 制 备 质 量 保 证 通 则n 提 出 要 求 并 制 定 系 统 的 控 制 计 划n 属 于 质 量 保 证 的 范 围n SN/T1538.2-2007(待 发 布 )n 第 2部 分 :培 养 基 性 能 测 试 实 用 指 南 n 为 保 证 提 出 的 质 量 要 求 所 需 要 采 取 的 技 术 操 作n 属 于 质 量 控 制 的 内 容 标 准 制 定 情 况 简 介n SN/T1538.1修 改 采 用 了ISO/TS11133-1： 2000（ E） (2000年 6月 1日 发 布 )n SN/T1538.1修 改 采 用 了ISO/TS11133-2： 2003（ E） (2003年 12月 25日 发 布 ) 本 标 准 的 作 用n SN/T1538为 培 养 基 质 量 保 证 和 质 量 控 制标 准 体 系 ， 有 利 于 对 培 养 基 的 标 准 化 管理 ， 提 高 实 验 室 检 测 质 量 ：n 第 1部 分 为 质 量 保 证 和 培 养 基 质 量 基 本 要 求n 第 2部 分 为 质 量 控 制 技 术n 为 CNAS合 格 评 定 的 微 生 物 实 验 室 认 证 工作 提 供 参 考 依 据 重 点 讲 解 内 容n 相 关 术 语n 主 要 质 量 保 证 要 求n 质 量 控 制 方 法n 质 控 菌 株 培 养 基n 液 体 、 半 固 体 或 固 体 形 式 的 ， 含 天 然 或合 成 成 分 ， 用 于 保 证 微 生 物 繁 殖 或 保 持其 活 力 的 物 质 培 养 基 类 型n 各 别 成 分 培 养 基 Culture medium prepared from individual components n 实 验 室 用 不 同 的 化 学 和 /或 生 物 试 剂 按 照 一 定 的 配方 、 比 例 配 置 而 成 的 培 养 基n 即 用 型 培 养 基 ready-to-use medium n 以 即 用 形 式 置 于 容 器 中 ( 例 如 ： 平 皿 、 试 管 或 其 它容 器 ) 供 应 的 培 养 基 。 n 脱 水 合 成 培 养 基 culture medium prepared from commercially dehydrated formulation. n 不 立 即 使 用 的 干 粉 形 式 的 (如 ： 粉 末 、 小 颗 粒 、 冻干 等 形 式 )培 养 基 。 标 准 的 主 要 内 容n 购 置 验 收 要 求 (CNAS-CL01 ： 4.6.2)n 生 产 企 业 提 供 资 料n 实 验 室 外 观 检 查 记 录n 储 存 、 使 用 、 弃 置 要 求（ CL11： 5.9)n 成 品 的 质 量 控 制 (概 述 第2部 分 .重 点 为 菌 株 ) n 物 理 指 标 :培 养 基 外 观n 微 生 物 指 标 :重 点 提 到 对测 试 菌 株 的 要 求n SN/T1538.1 n 常 规 质 量 控 制 要 求n 物 理 指 标 :外 观 控 制n 微 生 物 指 标 :污 染 ;生 长 率 ;选 择 性 ;特 异 性 (CNAS-CL01 : 4.6.2; CNAS/CL11： 5.9)n 性 能 测 试 方 法 举 例n 对 质 量 控 制 要 求 的 补 充 说明 和 详 细 实 例n SN/T1538.2 购 置 验 收 要 求n 生 产 企 业 提 供 材 料 ：n 产 品 标 签 ：n 产 品 名 称 、 编 号n 批 号 n 使 用 前 的 pHn 必 要 的 安 全 /危 害 数 据 n 有 效 期n 技 术 数 据 清 单n 质 控 证 书n 性 能 评 价n 所 用 测 试 菌 株 n 实 验 室 验 收 ：n 产 品 标 签 ：n 名 称 和 批 号n 有 效 期n 接 收 日 期n 包 装 及 其 完 整 性n SN/T1538.1-2005中 4.1;对 应CNAS/CL01 4.6.2内 容 ,通 常 要记 录 (采 购 服 务 和 供 给 ) 储 存 要 求n 例 行 常 规 检 查 内 容 :n 容 器 密 闭 性 复 查n 首 次 开 封 日 期n 内 容 物 的 感 官 检 查 n 使 用 前 检 查 (即 用 型 培 养 基 ): n 颜 色 是 否 发 生 变 化 ?n 是 否 蒸 发 /脱 水 ?n 是 否 有 微 生 物 生 长 ?n 注 :SN/T1538.1:2005中 4.2;对 应 CNAS/CL01:4.6.2内 容 ,可 不 做 记 录 实 验 室 自 制 和 使 用 要 求n 培 养 基 用 水n 称 量 和 复 水n 溶 解 和 分 装n pH测 定n 灭 菌n 监 测 n 琼 脂 培 养 基 融 化n 培 养 基 脱 气n 添 加 成 分 制 备 和 加 入n 平 板 的 制 备 和 储 存n 培 养n 注 :SN/T1538.1-2005中4.3-4.4内 容 ,对 应CNAS/CL11:5.9部 分 内 容 ,红 色 部 分 通 常 需 做 记 录 培 养 基 的 弃 置 要 求n 所 有 污 染 和 未 使 用 的 培 养 基 的 弃 置 必 需采 用 安 全 的 方 式 ， 并 且 要 符 合 相 关 法 律法 规 的 规 定 。n 注 :SN/T1538.1-2005中 4.5内 容 ,应 符 合CNAS/CL01:5.3.5(废 弃 物 处 理 程 序 )要 求 质 量 控 制 基 本 要 求n 对 培 养 基 的 要 求n 分 装 数 量n 外 观 、 色 泽 和 均 一 性n 琼 脂 凝 胶 的 硬 度n 水 份 含 量 n pH n 缓 冲 能 力n 微 生 物 污 染 (即 用 培 养 基 ) n 对 基 础 成 分 的 要 求n 对 不 稳 定 的 生 物 成 分 ，使 用 时 可 根 据 情 况 调整 用 量 。注 :SN/T1538.2中 对 制 造 商 的 要 求 微 生 物 学 要 求n 微 生 物 污 染n 生 长 特 性n 生 长 率n 选 择 性n 生 理 生 化 特 性 n 选 择 性 和 特 异 性n 抗 菌 实 验 特 性 红色部分为对培养基进行质量控制的主要内容 生 长 率 (定 量 测 试 方 法 )n PR = NS/NOn NS ： 待 测 培 养 基 平 板 上 得 到 的 菌 落 总 数 。n N0 ： 参 考 培 养 基 平 板 上 获 得 的 菌 落 总 数 ， 应 100cfu 要 求 ： 非 选 择 性 培 养 基 上 目 标 菌 的 生 长 率 最 低 应 为 0.7，该 类 培 养 基 应 易 于 目 标 菌 生 长 ； 选 择 性 培 养 基 上 目 标菌 的 生 长 率 最 低 应 为 0.1 选 择 性 (定 量 测 试 方 法 )n SF = DO DSn D0： 能 在 参 考 培 养 基 上 生 长 至 少 10个 菌 落 的 最 高 稀 释 度n DS： 能 在 测 试 培 养 基 上 显 示 生 长 的 最 高 稀 释 度 n 非 目 标 菌 在 选 择 性 培 养 基 上 的 SF至 少 为 2 n 半 定 量 和 定 量 法 中 ， 非 目 标 菌 应 部 分 或 全 部 被 抑 制 培 养 基 测 试 方 法n 定 量 测 试 方 法n 半 定 量 测 试 方 法n 定 性 测 试 方 法 几 种 方 法 的 使 用 原 则n 通 常 使 用 半 定 量 或 定 性 测 试 方 法 就 能 满 足 实 验室 对 培 养 基 性 能 测 试 的 要 求n 评 价 新 的 培 养 基 或 新 的 供 应 商 的 产 品 时 ， 应 采用 定 量 测 试 方 法n 采 用 定 量 方 法 时 ， 必 须 使 用 参 考 培 养 基 进 行 对照 ； 采 用 半 定 量 和 定 性 方 法 时 ， 使 用 参 考 有 助于 结 果 解 释 。n 参 考 培 养 基 必 须 是 从 近 期 批 次 中 选 出 的 已 知 质量 良 好 的 培 养 基 。 介 绍 几 种 常 用 的 质 控 方 法n Miles-Misra法 (定 量 方 法 )n 改 进 的 平 板 划 线 法 (半 定 量 方 法 )n 平 板 接 种 观 察 法 (定 性 方 法 )n 上 述 均 为 固 体 培 养 基 测 试 方 法 ,液 体 培 养基 定 量 和 半 定 量 测 试 方 法 也 要 通 过 固 体培 养 基 菌 落 计 数 技 术 才 能 得 到 结 果 。 改 良 Miles-Misra法 操 作 方 法n 测 试 菌 株 过 夜 培 养 物 10倍 稀 释n 测 试 平 板 和 参 照 平 板 划 分 为 4个 区 域 并 标记n 从 最 高 稀 释 度 开 始 ， 分 别 滴 一 滴 稀 释 液于 试 验 平 板 和 对 照 平 板 标 记 好 的 区 域n 将 稀 释 液 涂 满 整 个 1/4区 域 ， 37 C培 养18 hr。n 对 易 计 数 的 区 域 计 数 ， 按 公 式 计 算 结 果 方 法 举 例测 试 培 养 基 在 10-5稀 释 度 上 有 30个 菌 落参 照 培 养 基 在 10-5稀 释 度 上 有 40个 菌 落通 过 公 式 计 算 ： PR = 10-5 30/ 10-5 40=0.75注 ： 在 几 种 固 体 计 数 方 法 中 ， Miles-misra方 法 和 螺 旋 平 板 涂 布 法 效 果 较 好 。 改 进 的 划 线 法 接 种 法 模 式 图 计 算n 计 算 生 长 指 数 G ：n 每 条 有 菌 落 生 长 的 划 线 记 作 1分 ， 每 个n 仅 一 半 的 线 有 菌 落 生 长 记 作 0.5分n 没 有 菌 落 生 长 或 生 长 量 少 于 划 线 的 一 半 ， 则记 作 0n 如 ： 菌 落 在 A区 和 B区 全 部 生 长 ， 而 在 C区有 一 半 线 生 长 则 G 为 10 n 目 标 菌 在 培 养 基 上 应 呈 现 典 型 的 生 长 ，而 非 目 标 菌 的 生 长 应 部 分 或 完 全 被 抑 制 n 目 标 菌 的 生 长 指 标 G大 于 6时 ， 培 养 基 可接 受结 果 解 释 定 性 测 试 方 法 n 用 3mm接 种 环 取 测 试 菌 培 养 物 ， 在 测 试培 养 基 表 面 划 平 行 直 线 。 可 同 时 在 一 个平 板 上 接 种 多 个 菌 株 ， 但 划 线 不 能 交 叉n 按 标 准 中 规 定 的 培 养 时 间 和 温 度 对 接 种后 的 平 板 进 行 培 养 结 果 解 释n 培 养 后 按 以 下 方 法 计 分 ：n 0表 示 无 生 长n 1表 示 微 弱 生 长n 2表 示 生 长 良 好n 目 标 菌 得 分 应 为 2， 并 有 典 型 的 菌 落 外 观 、大 小 和 形 态n 非 目 标 菌 的 生 长 应 部 分 或 全 部 被 抑 制 质 控 菌 株 要 求n 标 准 菌 株 ： 来 自 国 际 /国 家 菌 种 保 藏 中 心(本 标 准 要 求 为 ATCC菌 株 )或 经 ISO9002认 证 的 经 销 商 提 供 的 菌 株 (有 资 质 )n 制 备 储 备 菌 株 和 工 作 菌 株 时 一 次 制 备 多份 ， 每 株 菌 原 则 上 不 能 重 复 使 用n 通 常 工 作 菌 株 不 能 再 传 代 ， 但 处 理 得 当可 再 次 使 用 标 准 储 备 菌 株 (Reference stock)n 标 准 菌 株 在 实 验 室 经 过 一 次 传 代 获 得 的一 组 完 全 相 同 的 菌 株n 传 代 菌 株 应 当 完 全 具 备 标 准 菌 株 的 所 有 性 状n 传 代 时 要 保 证 一 定 的 量 (减 少 传 代 次 数 )n 每 株 菌 株 尽 量 避 免 多 次 使 用n 采 用 不 同 的 保 存 方 法 保 存 期 限 不 同 n 如 冻 干 法 ,液 氮 法 ,穿 刺 法 ,液 体 石 蜡 法 ,斜 面 保 存法 等 (见 后 ) 菌 种 保 藏 方 法n 液 氮 保 存 法n 低 温 保 存 法n 液 体 石 蜡 保 存 法 液 氮 保 存 法保存制 备 细 胞 悬 液 ， 甘 油 或 二 甲 亚 砜 作 保 护 剂分 装 无 菌 安 瓿 瓶 ， 每 管 0.2ml预 冻 至 -40 （ 控 制 温 度 下 降 速 率 为 1 min）放 入 液 氮 生 物 贮 存 罐 中 气 相 保 存恢复直 接 浸 入 38 水 浴 中 解 冻 5 10min转 接 于 适 宜 培 养 基 内 培 养注 意 ： 大 多 数 属 种 适 于 慢 速 冻 结 和 快 速 解 冻 适 用 菌 种病 毒支 原 体各 类 细 菌 、 放 线 菌 、 酵 母 菌 、 丝 状 真 菌蓝 藻动 物 细 胞 液 体 石 蜡 覆 盖 保 存 法n 传 代 保 存 的 变 相 方 法n 能 够 适 当 地 延 长 保 存 时 间n 优 质 石 蜡 121 高 压 灭 菌 2小 时 ， 160干 燥 箱 中 灭 菌 12小 时 ， 放 冷 备 用n 液 体 石 蜡 的 深 度 以 1cm左 右 n 保 存 期 通 常 6个 月 至 一 年 适 用 菌 种n 霉 菌 、 酵 母 菌 、 放 线 菌 、 部 分 细 菌 。 如 ：大 肠 杆 菌 、 变 形 杆 菌 、 金 黄 色 葡 萄 球 菌等 需 氧 性 细 菌n 不 能 用 于 低 温 冷 冻 保 存 的 微 生 物 （ 如 孢子 形 成 能 力 极 差 的 丝 状 菌 ）n 不 适 于 用 菌 种 ： 固 氮 菌 、 乳 酸 杆 菌 、 明串 珠 菌 、 分 枝 杆 菌 、 沙 门 氏 菌 ， 丝 状 菌中 的 毛 霉 、 根 霉 菌 等 甘 油 低 温 保 藏 法n 保 藏 方 法 ： 菌 种 悬 浮 在 10 (体 积 分 数 )甘 油 蒸馏 水 中 。 置 于 低 温 (-70)保 藏 。n 注 意 事 项 ： 所 要 保 藏 的 菌 种 ， 最 好 先 培 养 至 对数 期 ； 使 用 液 体 培 养 基 时 ， 可 直 接 加 到 已 灭 过菌 的 甘 油 中 ， 并 使 甘 油 的 终 浓 度 在 l0 30左 右 。 为 避 免 反 复 冻 溶 ， 可 分 装 于 小 离 心 管 中 ，置 低 温 保 藏 。 n 适 用 菌 种 ： 基 因 工 程 、 丝 状 真 菌 、 酵 母 、 细 菌和 放 线 菌 方 法 举 例n SN/T1538.1-2005n SN/T1538.2-2007 谢 谢 大 家n 李 卫 华n 山 西 出 入 境 检 验 检 疫 局 技 术 中 心n 太 原 市 漪 汾 街 8号n 邮 编 030024n Email:n 电 话 (传 真 ):0351-6162536 n 手 机 :13603510651