实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白

1动 物 医 学 院 动 物 生 化 教 研 室 2 掌 握 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 盘 状 电 泳 的 原 理 ； 学 习 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 盘 状 电 泳 的 操 作 技 术 ； 了 解 血 清 蛋 白 的 主 要 成 份 。一 、 实 验 目 的 3 二 、 实 验 原 理 不 连 续 系 统 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 中 ， 蛋 白 样 品 通 过 浓 缩 胶 的 浓缩 按 分 子 大 小 排 列 成 层 ， 然 后 进 入 分 离 胶 ， 随 着 电 泳 的 不 断 进 行， 不 同 大 小 、 电 荷 的 蛋 白 质 分 子 逐 渐 被 分 开 。 4 Bis将 单 体 长 链 连 成 网 状 结 构TEMED催 化 AP生 成 硫 酸 自 由 基1、 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 生 成催 化 Acr聚 合 成 长 链Acr： 丙 烯 酰 胺Bis： 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺AP： 过 硫 酸 胺 （ 催 化 剂 ）TEMED： N, N, N,N-四 甲 基 乙 二 胺 （加 速 剂 ）Acr、 Bis决 定 孔 径 大 小AP、 TEMED决 定 聚 合 速 度 5 n 连 续 胶 电 泳 采 用 相 同 孔 径 的 凝 胶 和 相 同 的 缓 冲 系 统 （ 样 品 缓 冲 液 、 凝 胶 缓 冲 液和 电 极 缓 冲 液 ） ， 在 pH 恒 定 、 离 子 强 度 相 同 的 条 件 下 进 行 。l 优 点 ： 制 胶 简 单 、 快 捷 缓 冲 液 pH值 恒 定 ， 可 以 防 止 样 品 进 胶 后 因 pH值 改 变 发 生 的 凝 聚 和 沉 淀 缓 冲 系 统 组 成 简 单 ， 来 源 广 泛l 缺 点 ： 分 辨 率 不 高2、 连 续 胶 和 不 连 续 胶 电 泳 6 n 不 连 续 胶 电 泳 采 用 不 相 同 孔 径 的 凝 胶 和 不 同 缓 冲 系 统 的 电 泳 方 式 ， 在 电 泳 分 离 过 程 中 ， 由于 浓 缩 胶 的 堆 积 作 用 ， 可 使 样 品 在 浓 缩 胶 和 分 离 胶 界 面 上 先 浓 缩 成 一 窄 带 ， 然 后在 一 定 浓 度 或 浓 度 梯 度 的 凝 胶 上 进 行 分 离 。l 优 点 ： 分 辨 率 高 用 于 复 杂 和 特 殊 样 品 的 分 离 7 l 不 连 续 电 泳 的 三 种 物 理 效 应 样 品 的 浓 缩 效 应 凝 胶 的 分 子 筛 效 应 电 荷 效 应 电 泳 的 过 程 三 种 效 应 同 时 存 在 ， 对 蛋 白 样 品 起 协 同 作 用 ， 使 样 品 各 组分 按 照 带 电 量 、 分 子 质 量 及 形 状 按 一 定 的 顺 序 分 离 。l不 连 续 电 泳 的 四 种 不 连 续 体 系凝 胶 的 不 连 续缓 冲 液 成 份 的 不 连 续缓 冲 液 pH值 的 不 连 续电 压 梯 度 的 不 连 续 8 三 、 实 验 步 骤n 封 槽 清 洁 、 干 燥 的 小 玻 管 一 端 ， 用 Parafilm贴 封 后 垂 直 放 在 管 架 上 9 l 分 离 胶 ： A:C:D:E 1:2:3:2（ V/V）l 浓 缩 胶 ： B:C:D:E 2:1:5:2（ V/V） A: pH 8.9 Tris/H cl缓 冲 液 B: pH 6.7 Tris/H cl缓 冲 液 C: 30% Acr-Bis贮 存 液 D: 水 E: 过 硫 酸 铵 灌 装 前 加 入 TEMED， 混 匀 取 干 净 玻 璃 管 ， 下 端 封 口 膜 封 好 （ 重 要 ） ； 用 注 射 器 加 分 离 胶 至 管 口 1-2cm处 ， 封 水 （ 沿 管 壁 ， 动 作 要 慢 ） ； 凝 固 后 弃 水 、 吸 干 ； 加 浓 缩 胶 距 管 口2-3mm处 、 封 水 ； 凝 固 后 备 用 。制 胶 和 灌 胶 10 n 加 样n 电 泳 n 剥 胶 11 n 染 色 将 凝 胶 柱 置 于 0.05%氨 基 黑 10B溶 液 中 浸 染 20min， 然 后 再 浸入 7%醋 酸 溶 液 中 脱 色 。 血 清 蛋 白 在 凝 胶 柱 上 可 分 出 十 多 条 色 带 。 12 分 离 胶 和 浓 缩 胶 中 A,B,C,D,E各 是 什 么 组 分 。 分 离 胶 和 浓 缩 胶 中 缓 冲 液 的 组 分 ， pH值 异 同 ？ 它 们 与 电 极 缓 冲液 有 区 别 ？ 本 实 验 有 哪 些 不 连 续 ？ 为 什 么 比 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 分 辨 率 高 。四 、 思 考 题