实验二培养材料消毒和接种

一 、 实 验 目 的 1、 掌 握 植 物 组 织 培 养 中 的 无 菌 操 作 技 术 2、 掌 握 植 物 外 植 体 表 面 消 毒 的 常 规 方 法 操 作 前 的 准 备 工 作 接 种 室 在 接 种 前 4-5 d必 须 通 风 换 气 。 在接 种 前 一 天 对 接 种 室 进 行 全 面 消 毒 ， 一般 用 40%福 尔 马 林 进 行 全 面 喷 雾 ， 并 密 闭24 h， 然 后 打 开 换 气 窗 10-15 min.。 A: 实 验 器 具 和 材 料 的 准 备B: 用 75%的 酒 精 擦 拭 超 净 工 作 台 ， 然 后 室 内 及超 净 工 作 台 用 紫 外 灯 杀 菌 20min-30min。 注 意 ：台 面 上 的 用 品 不 要 放 置 太 多 或 重 叠 放 置 ， 以 免降 低 灭 菌 效 果 。C: 关 紫 外 灯 、 打 开 风 机 ， 过 5-10min进 入 缓 冲间 ， 以 75%洗 手 和 手 臂 ， 更 换 无 菌 服 、 帽 子 和口 罩 。 进 入 接 种 室 。 （ 注 ： 没 有 特 别 情 况 ， 尽量 不 要 下 工 作 台 ） D: 用 70 75 乙 醇 消 毒 双 手 。 试 验 用 具 也 应该 用 酒 精 消 毒 。 点 燃 酒 精 灯 ， 将 金 属 器 械 在 其火 焰 上 灼 烧 ， 冷 却 待 用 。注 意 ： 所 有 操 作 应 在 火 焰 近 处 并 经 过 灼 烧 进 行 。移 液 管 不 能 灼 烧 ， 培 养 瓶 口 、 塑 料 材 料 、 橡 胶材 料 过 火 焰 不 能 时 间 太 长 。 接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中 错 误 整 个 接 种 操 作 应 在 近 火 焰 处 进 行 ， 且 动 作 要迅 速正 确 错 误 接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染 正 确 错 误 培 养 器 材 的 清 洗 与 灭 菌 在 细 胞 工 程 实 验 中 ， 离 体 细 胞 对 任 何 毒 性 物 质都 十 分 敏 感 。 毒 性 物 质 包 括 解 体 的 微 生 物 和 细胞 残 余 物 以 及 非 营 养 的 化 学 物 质 。 某 些 化 学 物质 仅 0.01 g/L就 会 对 细 胞 产 生 毒 性 作 用 ， 因此 对 培 养 器 皿 的 清 洗 是 组 织 培 养 中 一 项 极 为 重要 的 环 节 。 A、 新 购 买 的 玻 璃 仪 器 表 面 常 附 着 有 游 离 的 碱 性 物质 ， 可 先 用 0.5 的 去 污 剂 洗 刷 ， 再 用 自 来 水 洗 净 ，然 后 浸 泡 在 1 2 盐 酸 溶 液 中 过 夜 （ 不 可 少 于四 小 时 ） ， 再 用 自 来 水 冲 洗 ， 最 后 用 无 离 子 水 冲洗 两 次 ， 在 100 120 烘 箱 内 烘 干 备 用 。 B、 使 用 过 的 玻 璃 仪 器 的 清 洗 先 用 自 来 水 洗 刷 至 无 污 物 ， 再 用 合 适 的 毛 刷沾 去 污 剂 （ 粉 ） 洗 刷 ， 然 后 用 自 来 水 彻 底 洗 净去 污 剂 ， 用 无 离 子 水 洗 两 次 ， 烘 干 备 用 。 清 洗 后 器 皿 内 外 不 可 挂 有 水 珠 ， 否 则 重 洗 . C、 金 属 用 品 洗 涤 金 属 用 品 一 般 不 宜 用 各 种 洗 涤 液 洗 涤 （ 新 的可 以 用 热 洗 衣 粉 水 洗 净 ） ， 需 要 清 洗 时 ， 一 般用 酒 精 擦 洗 ， 然 后 火 焰 干 燥 （ 1） 干 热 灭 菌适 用 于 玻 璃 器 皿 和 金 属 器 械 的 灭 菌 。 操 作 方 法 ：150 、 40min （ 2） 湿 热 灭 菌适 用 于 各 种 器 皿 、 培 养 基 、 器 皿 、 蒸 馏 水 、 棉 塞 、纸 等 。 121 维 持 2030min （ 3） 过 滤 灭 菌 培 养 基 中 某 些 成 分 遇 到 高 温 分 解 （ 如 某 些 生 长调 节 剂 GA3、 玉 米 素 等 ） ， 就 需 要 过 滤 灭 菌 。 灭 菌 方 法 ： 将 生 长 调 节 剂 或 酶 配 成 一 定 浓 度 ，用 注 射 器 注 入 微 孔 滤 膜 虑 。 制 培 养 基 时 ， 现 将培 养 基 高 压 灭 菌 ， 待 降 至 50 左 右 时 ， 加 入 适量 的 激 素 。 （ 4） 射 线 灭 菌主 要 是 利 用 紫 外 灯 进 行 照 射 ， 适 合 实 验 室 空 气 、操 作 台 等 ， 灭 菌 时 间 20-30min。注 意 ： 关 灯 后 5min后 再 进 入 。 超 净 工 作 台 关 灯后 要 打 开 风 机 、 （ 5） 火 焰 灼 烧 灭 菌用 火 焰 灼 烧 达 到 灭 菌 目 的 ， 适 用 于 接 种 器 皿 的灭 菌 。 （ 6） 消 毒 剂适 用 外 植 体 、 实 验 器 皿 、 操 作 表 面 、 皮 肤 等 。几 种 常 用 消 毒 剂 的 效 果 比 较消 毒 剂 使 用 浓 度 (%) 消 毒 时 间(min.) 效 果 残 液 去 除难 易乙 醇 70-75 0.1-3 好 易新 洁 尔 灭 10 20 5 30 好 易氯 化 汞 0.1 1 2 15 最 好 最 难过 氧 化 氢 10 12 5 15 较 好 最 易抗 菌 素 4 50mgl -1 30 60 较 好 较 难次 氯 酸 钙 /纳 9 10 5 30 好 易 二 、 实 验 原 理 用 于 进 行 组 织 培 养 的 组 织 、 器 官 和 细 胞 称 为 外植 体 。 在 组 织 培 养 中 ， 外 植 体 如 果 是 带 菌 的 ，在 接 种 前 都 必 须 进 行 表 面 消 毒 ， 这 是 取 得 培 养成 功 的 最 基 本 的 和 重 要 的 前 提 。 常 用 消 毒 剂 对外 植 体 进 行 消 毒 。 从 室 外 取 的 材 料 ， 一 般 先 用自 来 水 冲 洗 数 分 钟 . 接 种 材 料 使 用 消 毒 剂 后 ， 要 用 无 菌 水 洗 涤 3 5 遍 ， 最 后 用 无 菌 纸 擦 干 净 。 使 用 消 毒 剂 的 原 则是 既 要 达 到 消 毒 目 的 ， 又 不 能 损 伤 植 物 组 织 和细 胞 ， 还 要 符 合 就 地 取 材 的 原 则 。 对 一 些 容 易污 染 、 较 难 灭 菌 的 外 植 体 进 行 表 面 消 毒 时 ， 用单 一 消 毒 剂 不 能 收 到 好 的 效 果 ， 所 以 常 选 用 两种 消 毒 剂 交 替 浸 泡 法 。 一 般 ， 首 先 用 75 乙 醇 浸 泡 外 植 体 数 秒 钟 至30s， 然 后 置 于 0.1 氯 化 汞 溶 液 5 10min 或含 有 2 活 性 氧 的 次 氯 酸 钠 溶 液 5 30min， 然后 用 无 菌 水 洗 涤 。 有 时 在 氯 化 汞 或 次 氯 酸 钠 灭菌 后 ， 用 无 菌 水 洗 ， 进 一 步 剥 去 几 层 组 织 或 器官 如 叶 片 后 ， 再 用 次 氯 酸 钠 灭 菌 3 5min， 无菌 水 漂 洗 3 次 后 ， 切 割 、 用 于 接 种 。消 毒 溶 液 对 外 植 体 消 毒 是 在 超 净 工 作 台 上 进 行 。完 成 表 面 消 毒 的 接 种 材 料 要 尽 快 放 置 于 培 养 基中 。 三 、 实 验 材 料 器 材 ： 超 净 工 作 台 、 镊 子 、 酒 精 灯 、 脱 脂 棉 、 烧 杯 、广 口 瓶 、 培 养 皿 。 药 品 及 材 料 ： 0.1%升 汞 、 酒 精 、 次 氯 酸 钠 、 无 菌 水 、 绿 豆 种子 、 培 养 基 。 四 、 实 验 步 骤 （ 1） 准 备 好 培 养 基 ， 无 菌 水 ， 培 养 皿 及 接 种 工 具 。 （ 2） 将 培 养 基 、 无 菌 水 、 接 种 工 具 置 于 接 种 台 上 ，打 开 超 净 台 紫 外 灯 开 关 ， 照 射 至 少 20分 钟 ， 关 闭 台内 的 紫 外 灯 ， 通 风 五 分 钟 后 ， 再 开 日 光 灯 进 行 无 菌操 作 。 （ 3） 接 种 前 用 肥 皂 洗 手 ， 特 别 是 将 手 指 洗 净 ， 然后 用 沾 有 75%酒 精 的 棉 球 把 手 消 毒 一 次 。 （ 4） 将 绿 豆 种 子 在 流 水 下 冲 洗 干 净 。 （ 5） 将 种 子 放 于 广 口 瓶 中 ， 用 75%的 酒 精 溶 液浸 泡 30s， 无 菌 水 冲 洗 ， 然 后 用 0.1%升 汞 溶 液浸 泡 3、 5、 10min， 期 间 不 断 摇 动 溶 液 ， 用 无菌 水 洗 涤 5遍 待 用 。 （ 6） 取 出 培 养 皿 ， 有 必 要 的 话 可 以 用 沾 有 75%的 酒 精 的 棉 球 把 皿 表 面 擦 一 下 。 （ 7） 接 种 用 的 镊 子 使 用 前 插 入 95%的 乙醇 溶 液 中 ， 使 用 镊 子 时 在 酒 精 灯 上 烧 片刻 ， 冷 却 后 待 用 。 也 可 以 插 入 培 养 基 边缘 促 使 其 冷 却 。 （ 8） 在 酒 精 灯 火 焰 旁 揭 去 培 养 皿 封 口 膜 ， 在靠 近 火 焰 处 ， 右 手 用 灭 菌 的 镊 子 夹 取 绿 豆 种 子 ，将 其 放 在 培 养 基 上 ， 用 镊 子 轻 轻 按 一 下 ， 使 其部 分 浸 入 培 养 基 。 每 瓶 可 放 8-12个 外 植 体 。 （ 9） 封 上 封 口 膜 ， 标 上 接 种 日 期 、 材 料 名 称 、姓 名 等 ， 将 接 种 材 料 移 到 培 养 室 培 养 。 五、作业1、 观 察 接 种 后 2 5天 的 污 染 情 况 ， 填 入 下 表接 种 日期 接 种 数 污 染 数 污 染 率 主 要 污 染菌 种 2、 在 接 种 过 程 中 ， 通 过 哪 些 措 施 来 防 止 细 菌 对 接 种 工 具 ， 接 种 材 料 的 污 染 ？