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植 物 基 因 组 DNA的 提 取及 纯 度 与 含 量 的 测 定实 验 八 第 一 部 分植 物 基 因 组 DNA的 提 取 一 、 实 验 目 的 和 要 求1、 学 习 并 掌 握 植 物 基 因 组 DNA的 提 取 原 理 和 方 法 ；2、 了 解 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 核 酸 的 原 理 和 操 作 ；3、 学 习 并 掌 握 对 电 泳 检 测 基 因 组 DNA结 果 的 初 步 分 析 。 二 、 实 验 基 本 原 理 植 物 基 因 组 DNA的 提 取 方 法 就 其 提 取 原 理 主 要 有 二 种 ： 十 六 烷 基 三 乙 基 溴化 铵 （ CTAB)法 、 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (SDS)法 。 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 和 十 二 烷基 硫 酸 钠 等 离 子 型 表 面 活 性 剂 ， 能 溶 解 细 胞 膜 和 核 膜 蛋 白 ， 使 核 蛋 白 解 聚 ， 从而 使 DNA得 以 游 离 出 来 。 再 加 入 苯 酚 和 氯 仿 等 有 机 溶 剂 ， 能 使 蛋 白 质 变 性 ， 并使 抽 提 液 分 相 ， 因 核 酸 (DNA、 RNA)水 溶 性 很 强 ， 经 离 心 后 即 可 从 抽 提 液 中 除 去细 胞 碎 片 和 大 部 分 蛋 白 质 。 上 清 液 中 加 入 无 水 乙 醇 使 DNA沉 淀 ， 沉 淀 DNA溶 于 TE溶 液 中 ， 即 得 植 物 基 因 组 DNA溶 液 。 由 于 植 物 中 的 次 生 代 谢 产 物 多 酚 类 化 合 物 可 介 导 DNA降 解 ， 而 多 糖 的污 染 也 是 影 响 植 物 核 酸 纯 度 最 常 见 的 问 题 ， 这 些 多 糖 能 抑 制 限 制 酶 、 连 接 酶 及DNA聚 合 酶 等 分 子 生 物 学 酶 类 的 生 物 活 性 。 传 统 的 CTAB-DNA提 取 法 步 骤 多 ， 较烦 琐 ， DNA产 率 低 ， 而 且 由 于 酚 很 难 完 全 去 除 ， 容 易 影 响 以 后 的 酶 切 等 工 作 的效 率 。 SDS法 操 作 简 单 ， 温 和 ,也 可 提 取 到 较 高 分 子 量 DNA， 但 所 得 产 物 含 糖 类杂 质 较 多 ,这 将 直 接 影 响 DNA的 限 制 性 核 酸 内 切 酶 酶 切 效 果 。 由 于 植 物 细 胞 匀 浆 含 有 多 种 酶 类 (尤 其 是 氧 化 酶 类 )对 DNA的 抽 提 产 生 不 利 的 影 响 ， 在 抽 提 缓 冲 液中 需 加 入 抗 氧 化 剂 或 强 还 原 剂 (如 巯 基 乙 醇 )以 降 低 这 些 酶 类 的 活 性 。 本 实 验 采 用 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (SDS)法 提 取 植 物 基 因 组 DNA， 基 因 组 DNA提 取后 ， 通 过 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定 基 因 组 DNA分 子 量 大 小 、 纯 度 ； 用 紫 外 吸 收法 测 定 基 因 组 DNA纯 度 与 含 量 。 DNA的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定 : DNA分 子 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 有 电 荷 效 应 和 分 子 筛 效 应 。 DNA分 子 在 高 于 等 电点 的 溶 液 中 带 负 电 荷 ， 它 在 电 场 中 向 正 极 移 动 。 在 一 定 的 电 场 强 度 下 ， DNA分子 的 迁 移 速 度 取 决 于 分 子 筛 效 应 ， 即 具 有 不 同 的 相 对 分 子 量 的 DNA片 段 泳 动 速度 不 同 。 DNA片 断 在 凝 胶 中 当 用 低 浓 度 的 荧 光 嵌 入 染 料 溴 化 乙 锭 （ EB） 染 色 后 ，在 紫 外 光 下 可 见 橙 红 色 带 ， 并 可 确 定 DNA片 断 在 凝 胶 中 的 位 置 。 影 响 DNA泳 动 速 率 （ 迁 移 率 ） 的 因 素 有 ： DNA分 子 质 量 的 影 响 ： 双 链 DNA分 子 迁 移 的 速 率 与 DNA分 子 量 对 数 成 反 比 。 分 子 量 越 大 ， 迁 移 率 越 小 。 DNA构 型 的 影 响 ： 超 螺 旋 DNA 线 状 DNA 开 环 DNA 胶 浓 度 的 影 响 ： 浓 度 越 低 ， 相 同 核 酸 分 子 迁 移 越 快 ， 一 般 常 用 的 凝 胶 浓 度 为 1 2 ； 电 场 强 度 的 影 响 ： 电 场 强 度 愈 大 ， 带 点 颗 粒 的 泳 动 越 快 。 但 凝 胶 的 有 效 分 离 范 围 随 着 电 压 增 大 而 减 小 ， 所 以 电 泳 时 一 般 采 用 低 电 压 ， （ 一 般 5V/cm） （ 电 场 强 度 ） 。 而 对 于 大 片 段 电 泳 ， 甚 至 用 0.5 1.0V/cm电 泳 过 夜 。 进 行 高 压 电 泳 时 ， 只 能 使 用 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 。 EB的 影 响 ： 溴 化 乙 锭 （ EB） 插 入 双 链 DNA造 成 其 负 电 荷 减 少 、 刚 性 和 长 度 增 加 。 电 泳 缓 冲 液 的 影 响 :核 酸 电 泳 常 采 用 TAE、 TBE、 TPE三 种 缓 冲 系 统 ， 但 它 们 各 有 利 弊 。 TAE价 格 低 廉 ， 但 缓 冲 能 力 低 ， 必 须 进 行 两 极 缓 冲 液 的 循 环 。 TPE在 进 行 DNA回 收 时 ， 会 使 DNA污 染 磷 酸 盐 ， 影 响 后 续 反 应 。 所 以 多 采 用 TBE缓 冲 液 。 在 缓 冲 液 中 加 入 EDTA， 可 以 鳌 合 二 价 离 子 ， 抑 制 DNase， 保 护 DNA。 缓 冲 液 pH常 偏 碱 性 或 中 性 ， 此 时 核 酸 分 子 带 负 电 ， 向 正 极 移 动 。 碱 基 组 成 与 电 泳 温 度 的 影 响 : 一 般 影 响 不 大 在 DNA提 取 过 程 中 必 须 始 终 注 意 以 下 几 个 关 键 问 题 ：（ 1） DNA的 二 级 结 构 和 双 链 易 受 多 种 因 素 （ 如 强 酸 、 强 碱 、 加 热 、 低 盐 浓 度 、有 机 溶 剂 、 酰 胺 类 、 尿 素 等 ） 的 影 响 引 起 双 链 解 开 ， 即 “ 变 性 ” ， 因 此 抽 提 时避 免 使 用 变 性 的 条 件 。（ 2） 抑 制 内 外 源 DNase的 活 力 。 DNase就 象 一 把 刀 ， 它 能 把 大 分 子 的 DNA切 成 碎片 ， 所 以 要 加 以 杜 绝 ， 现 可 以 通 过 多 种 途 径 来 做 到 这 一 点 ： a、 低 温 操 作 ； b、调 节 pH， 使 偏 碱 （ pH8.0） ； c、 抽 提 液 中 加 表 面 活 性 剂 ； d、 加 螯 合 剂 （ EDTA）除 去 酶 的 铺 助 因 子 （ Mg2+） ， 使 酶 活 性 丧 失 。（ 3） 防 止 化 学 降 解 。 如 过 酸 或 过 碱 以 及 其 它 化 学 因 素 ， 会 使 DNA降 解 ， 一 般 综合 考 虑 ， 取 pH8.0左 右 为 宜 。（ 4） 防 止 物 理 因 素 降 解 。 如 温 度 太 高 或 机 械 张 力 剪 切 等 ， DNA分 子 特 别 大 ， 极易 被 机 械 张 力 拉 断 ， 甚 至 在 细 管 中 稍 急 一 些 的 流 动 也 会 使 DNA断 裂 ， 所 以 在 抽提 过 程 中 要 特 别 注 意 这 一 点 ， 操 作 过 程 要 尽 量 简 便 、 温 和 、 减 少 搅 拌 次 数 ， 也 不 要 剧 烈 摇 动 。（ 5） 植 物 的 次 生 代 谢 物 （ 主 要 是 胞 质 内 的 多 酚 类 或 色 素 类 化 合 物 ） 对 核 酸 提取 有 干 扰 作 用 。 因 此 ， 一 般 尽 可 能 选 幼 嫩 的 、 代 谢 旺 盛 的 新 生 组 织 作 为 提 取DNA的 材 料 ， 这 是 因 幼 嫩 的 新 生 组 织 次 生 代 谢 物 较 少 ， DNA含 量 高 ， 且 易 于 破 碎 ，植 物 材 料 最 好 是 新 鲜 的 。 三 、 实 验 材 料 与 试 剂1、 实 验 材 料 ： 植 物 幼 嫩 叶 子2、 实 验 试 剂（ 1） 基 因 组 DNA提 取 缓 冲 液（ 2） 氯 仿 :异 戊 醇 :乙 醇 抽 提 液（ 3） TE缓 冲 液（ 4） 平 衡 酚 ：（ 5） RNA酶 A（ 6） 酚 /氯 仿（ 7） 氯 仿 /异 戊 醇（ 8） 异 丙 醇 、 无 水 乙 醇 、 70%乙 醇 。（ 9） 3mol/L NaAc（ 10） 5 TBE缓 冲 液 （ 11） 6 电 泳 上 样 缓 冲 液（ 12） 1.0%琼 脂 糖 凝 胶（ 13） EB（ 14） DNA分 子 量 Markers： 125， 564， 2027， 2322， 4361， 6557， 9416， 23130bp. 四 、 实 验 器 材 与 仪 器1、 研 体2、 离 心 机 、 离 心 管 （ 7ml） 及 离 心 管 架 ；3、 微 量 移 液 器 ： 10ul、 1000ul；4、 恒 温 水 浴 箱 65 5、 制 冰 机 ；6、 冰 箱 ； 7、 恒 温 水 浴 箱 37 ；8、 微 波 炉 ； 9、 电 泳 仪 及 电 泳 槽 ；10、 紫 外 检 测 仪 。 五 、 实 验 操 作 方 法 和 步 骤 置 于 预 热 到 65 的 研 体 中 ，加 少 许 石 英 砂 ； 加 入 预 热 到65 的 核 酸 提 取 缓 冲 液 3 ml称 取 植 物 幼 嫩 叶 子 0.5g 迅 速 研 成 匀 浆 转 移 到 7ml带 盖 离 心 管 中65 水 浴 保 温 40 min， 其 间 经 常 轻 柔摇 动 加 入 3 ml氯 仿 -异 戊 醇 溶 液 轻 柔 颠 倒 混 匀 后 ，室 温 静 置 分 层 5 min离 心 12000rpm 5min 上 清 液 转 移 到 干 净 7ml离 心 管 中 ，记 录 体 积 ， 弃 沉 淀 ， * 加 入 等 体 积 异 丙 醇 试 剂 ，混 和 后 静 置 20 min沉 淀 DNA4 离 心 5,000g 3 min收 集 絮 状 沉 淀 加 入 3mlTE， 65 水 浴 中 助 溶 15min， 使 之 完 全 溶 解加 入 等 体 积 的 平 衡 酚 ， 轻 柔 颠 倒 混 匀 ， 室 静 置 10min 4 离 心 12,000rpm 10min 转 移 上 清 于 新 7ml离 心 管 中 ， 记 录 体 积 *加 入 等 体 积 的 酚 氯 仿 ， 轻柔 颠 倒 混 匀 ， 室 温 放 置15min 4 离 心 （ 12,000rpm， 5min） 吸 取 上 清 转 移 到 一 新 7ml离 心 管 中，记 录 体 积 *加 入 等 体 积 的 氯 仿 ， 颠倒 混 匀 ， 室 温 放 置 5min 4 离 心 （ 12,000rpm， 10min） 吸 取 上 清 转 移 到 一 新 7ml离 心 管 中 ， 记 录 体 积 *加 入 1/10体 积 3mol/L NaAC和2 体 积 20 预 冷 的 无 水 乙 醇 20 放 置 20 min *4 离 心 （ 12,000rpm ， 10min） 收 集 沉 淀 *用 70%乙 醇 洗 涤 沉 淀 ， 倾 倒 掉 乙 醇 溶液 ， 干 燥 ， 让 酒 精 完 全 挥 发用 1ml TE 溶 解 沉 淀 ， 加 入 5l RNase（ 5g/l） ，37 保 温 10 min， 即 为 植 物 基 因 组 DNA溶 液 * 凝 胶 电 泳 检 测 基 因 组 DNA（ 分 子 量 大 小 、 纯 度 ）说 明 ： 如 果 蛋 白 质 和 RNA未 去 除 干 净 ， 重 复 酚 ， 酚 /氯 仿 ，氯 仿 抽 提 步 骤 ， 继 续 用 RNase 处 理 ， 乙 醇 沉 淀 和 洗 涤 ，重 溶 于 TE中 ， 直 至 基 因 组 DNA纯 度 和 质 量 符 合 要 求 。 （ 一 ） 植 物 基 因 组 DNA的 提 取 紫 外 吸 收 法 测 定 基 因 组 DNA纯 度 与 含 量 *植 物 基 因 组 DNA的 提 取 操 作 过 程 现 象 *植 物 基 因 组 DNA的 提 取 操 作 过 程 现 象 1、 制 胶 （ 1 琼 脂 糖 凝 胶 ） 在 胶 模 上 架 好 梳 子 。 称 取 01g琼 脂 糖 ， 置 于 250ml锥 形 瓶 中 ， 加 100ml 0.5 TBE电 泳 缓 冲 液 ， 加 热 熔 化 至 无 颗 粒 状 琼 脂 糖 ， 待 其 冷 却 至 50 60 后 ，加 入 EB， 使 其 终 浓 度 为 0.5mg/L， 摇 匀 后 立 即 倒 入 准 备 好 的 胶 模 中 ， 待 胶 凝 固后 ， 放 入 电 泳 槽 中 ， 倒 入 适 量 0.5 TBE（ 刚 好 淹 过 胶 面 ） ， 拔 去 梳 子 备 用 。（ 注 ： EB为 诱 变 剂 、 致 癌 物 ， 接 触 凝 胶 必 须 戴 手 套 操 作 ）2、 加 样 取 5ul纯 化 的 DNA原 溶 液 样 品 ， 与 1ul 6 电 泳 加 样 缓 冲 液 混 匀 ， 用 微 量 移液 枪 小 心 加 入 样 品 槽 中 （ 注 ： 勿 划 破 或 戳 穿 加 样 孔 ， 勿 带 入 气 泡 ） 。 若 DNA含量 偏 低 ， 则 可 依 上 述 比 例 增 加 上 样 量 ， 但 总 体 积 不 可 超 过 样 品 槽 容 量 。 每 加 完一 个 样 品 要 换 枪 头 以 防 互 相 污 染 。 注 意 上 样 时 要 小 心 操 作 ， 避 免 损 坏 凝 胶 或 将样 品 槽 底 部 凝 胶 刺 穿 。3、 电 泳 加 完 样 后 ， 盖 上 电 泳 槽 盖 ， 立 即 接 通 电 源 ， 使 电 压 调 到 100V， 恒 压 电 泳 。当 溴 酚 蓝 条 带 移 动 到 距 凝 胶 前 缘 约 2cm时 ， 停 止 电 泳 （ 约 需 30 60min） 。 4、 观 察 和 拍 照 取 出 胶 块 置 于 紫 外 灯 下 观 察 ， DNA存 在 处 可 显 示 出 肉 眼 可 辨 的 橘 红 色 荧 光带 ， 再 用 成 像 仪 进 行 拍 照 ， 以 便 于 分 析 。 （ 注 ： 紫 外 光 对 眼 睛 有 害 ， 观 察 时 戴上 防 护 镜 或 眼 镜 ， 或 隔 着 玻 璃 或 有 机 玻 璃 观 察 ） 。 （ 二 ） 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 基 因 组 DNA 第 二 部 分基 因 组 DNA纯 度 与 含 量 的 测 定 一 、 实 验 目 的 和 要 求1、 学 习 紫 外 吸 收 法 测 定 核 酸 基 本 原 理 和 方 法 ；2、 学 习 并 掌 握 紫 外 吸 收 法 测 定 基 因 组 DNA纯 度 与 含 量 的 方 法 。 二 、 实 验 基 本 原 理 核 酸DNA和 RNA所 含 碱 基 的 苯 环 结 构 （ 嘌 呤 环 和 嘧 啶 环 ） 的 共 轭 双 键 具有 紫 外 吸 收 的 性 质 ， 它 们 在 260nm处 有 最 大 的 吸 收 峰 。 因 此 ， 可 以 用 260nm波 长进 行 核 酸 含 量 的 测 定 。 波 长 为 260nm时 ， DNA或 RNA的 光 密 度 的 大 小 不 仅 与 总 含 量 有 关 ， 也 与 它 们的 不 同 构 型 而 有 差 异 。 对 标 准 样 品 来 说 ， 浓 度 为 1 g / ml时 ， DNA钠 盐 的 OD260 0.02。 当 OD260 1时 ， 双 链 DNA含 量 约 为 50 g / ml 单 链 DNA含 量 约 为 37 g / ml RNA含 量 约 为 40 g / ml 寡 核 苷 酸 含 量 约 为 30 g / ml（ 由 于 底 物 不 同 有 差 异 ）1、 核 酸 样 品 DNA、 RNA含 量 的 测 定 ： 如 用 1cm光 径 石 英 比 色 皿 ， 用 H 2O稀 释 DNA或 RNA样 品 n倍 并 以 H2O为 空 白 对照 ， 根 据 此 时 读 出 的 OD260值 即 可 计 算 出 样 品 稀 释 前 DNA的 含 量 ： DNA（ g/ l） =50 OD260读 数 DNA样 品 稀 释 倍 数 /1000 RNA（ g/ l） =40 OD260读 数 RNA样 品 稀 释 倍 数 /1000 若 样 品 不 纯 ， 则 比 值 发 生 变 化 ， 此 时 无 法 用 分 光 光 度 法 对 核 酸 进 行 定 量 ，可 使 用 溴 化 乙 锭 法 或 其 他 方 法 进 行 估 算 。 当 DNA样 品 中 含 有 蛋 白 质 、 酚 或 其 他 小 分 子 污 染 物 时 ， 会 影 响 DNA吸 光 度 的准 确 测 定 。 由 于 DNA在 260nm处 有 最 大 的 吸 收 峰 ， 蛋 白 质 在 280nm处 有 最 大 的 吸收 峰 ， 盐 和 小 分 子 则 集 中 在 230nm处 。 所 以 ， 一 般 情 况 下 同 时 检 测 同 一 样 品 的OD260、 OD280和 OD230， 计 算 它 们 的 比 值 来 判 断 核 酸 样 品 的 纯 度 。2、 核 酸 样 品 纯 度 判 断 的 一 般 标 准 ： DNA纯 度 ： OD260/OD280 1.8， 表 示 为 纯 的 DNA； OD260/OD280 1.9， 表 示 有 RNA污 染 ； OD260/OD280 1.6， 表 示 有 蛋 白 质 、 酚 等 污 染 。 RNA纯 度 ： 1.7 OD260/OD280 2.0， 表 示 为 纯 的 RNA； OD260/OD280 1.7时 ， 表 示 有 蛋 白 质 或 酚 污 染 ； OD260/OD280 2.0时 ， 表 示 可 能 有 异 硫 氰 酸 残 存 。 OD230/OD260的 比 值 应 在 0.4-0.5之 间 ， 若 比 值 较 高 说 明 有 残 余 的 盐 和 小 分 子 如 核 苷 酸 、 氨 基 酸 、 酚 等 的 存 在 。 若 样 品 不 纯 ， 则 比 值 发 生 变 化 ， 此 时 无 法 用 分 光 光 度 法 对 核 酸 进 行 定 量 ；同 时 也 会 影 响 酶 切 和 PCR的 效 果 。 三 、 实 验 材 料 与 试 剂1、 实 验 材 料 植 物 基 因 组 DNA样 品2、 实 验 试 剂 ddH2O； TE缓 冲 液 （ pH 8.0） 。四 、 实 验 器 材 与 仪 器1、 离 心 机 、 离 心 管 （ 5ml） 及 离 心 管 架 ；2、 微 量 移 液 器 10ul、 200ul、 1000ul及 枪 头 ；3、 紫 外 分 光 光 度 计 ； 4、 石 英 比 色 皿 （ 0.5cm光 径 ） 或 1cm光 径 的 微 量 石 英 比 色 皿 （ 50ul、 100ul） 。 五 、 实 验 操 作 方 法 和 步 骤 方 法 1： 将 提 取 的 植 物 基 因 组 DNA样 品 吸 取 20ul， 加 到 新 的 5ml离 心 管 中 ， 再 加 一 定量 的 ddH2O 或 TE缓 冲 液 （ pH 8.0） 稀 释 100倍 ， 用 0.5cm光 径 石 英 比 色 皿 （ 约需 1.6ml样 品 溶 液 ） 或 微 量 石 英 比 色 皿 在 紫 外 分 光 光 度 计 上 测 定 230nm、 260nm、280nm处 的 吸 光 度 。 计 算 植 物 基 因 组 DNA样 品 溶 液 的 DNA的 含 量 以 及 DNA样 品 的纯 度 。 方 法 2： 直 接 取 植 物 基 因 组 DNA样 品 微 量 原 液 （ 12ul)， 用 分 光 光 度 计 进 行 自 动测 定 出 230nm、 260nm、 280nm处 的 吸 光 度 值 ， 计 算 植 物 基 因 组 DNA样 品 溶 液 的DNA的 含 量 以 及 DNA样 品 的 纯 度 。 用 TE调 0（ 空 白 ） ： 取 植 物 基 因 组 DNA样 品 原 液 12ul， 进 行 自 动 测 定 230nm、 260nm、 280nm处的 吸 光 度 值 ： 六 、 计 算1、 植 物 基 因 组 DNA样 品 溶 液 的 DNA的 含 量 ： DNA（ g/ l ） = 50 OD260读 数 2* DNA样 品 稀 释 倍 数 /1000 （ * 用 0.5cm光 径 石 英 比 色 皿 2 ， 用 1cm光 径 石 英 比 色 皿 1。 ）2、 植 物 基 因 组 DNA样 品 溶 液 的 DNA的 纯 度 ： OD260/OD280 OD230/OD260 3、 样 品 纯 度 判 断 ： OD260/OD280 1.8， 表 示 为 纯 的 DNA； OD260/OD280 1.9， 表 示 有 RNA污 染 ； OD260/OD280 1.6， 表 示 有 蛋 白 质 、 酚 等 污 染 。 七 、 结 果 分 析 讨 论 下 次 实 验 课自 主 设 计 实 验 与 实 践 开 题 报 告递 交 ： 自 主 设 计 实 验 与 实 践 课 题 申 请 书 及 “ 实 验 药 品 、 器 材 和 仪 器 需 量 申 领 表 ”
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