《网织红细胞计数》PPT课件

实 验 三 网 织 红 细 胞 计 数一 、 实 验 原 理 网 织 红 细 胞 胞 浆 内 残 存 有 嗜 碱 性 的 RNA物 质 ， 经 煌 焦 油 蓝 或 新 亚 甲 蓝 活 体 染 色 后RNA中 负 电 荷 基 团 与 带 正 电 荷 的 有 色 基 团 结合 ， 凝 聚 成 颗 粒 呈 浅 蓝 或 蓝 黑 色 的 点 状 、 丝 状或 网 状 结 构 ， 可 在 显 微 镜 下 识 别 。 计 数 1000个 红 细 胞 中 所 有 的 网 织 红 细 胞 数 直 接 报 告 其 百分 比 ， 或 红 细 胞 计 数 结 果 报 告 其 绝 对 值 。 网 织 红 细 胞 （ Ret） 是 晚 幼 红 细 胞 脱 核 后 到 成 熟 红 细 胞 间的 过 渡 细 胞 ， 是 尚 未 完 全 成 熟 的 红 细 胞 ，其 胞 浆 内 残 存 有 嗜 碱 性 的 RNA物 质 。 嗜碱 性 物 质 与 染 料 凝 聚 成 蓝 色 颗 粒 ， 颗 粒 与颗 粒 连 缀 成 线 ， 线 连 接 成 网 ， 故 而 得 名 。 分 型 ： 丝 球 型 、 网 型 、 破 网 型 、 点 粒 型 。（ 、 、 、 型 ） 网 织 红 细 胞 计 数 方 法n 1、 普 通 光 学 显 微 镜 法 ： 活体 染 色 后 推 片 镜 检n 2、 网 织 细 胞 计 数 仪 法 ： 荧光 染 色 后 用 流 式 细 胞 术 计 数 二 、 试 剂 器 材1、 试 剂 10g/L煌 焦 油 蓝 酒 精 （ 水 ） 溶 液 2、 器 材 毛 细 血 管 采 血 用 具 、 小 试 管 、载 玻 片 、 推 片 、 显 微 镜 、 香 柏 油 、 二 甲苯 及 擦 镜 纸 、 Miller窥 盘 或 直 径 约 20 mm（ 较 目 镜 内 径 稍 小 ） 的 圆 形 硬 纸 片 （ 正中 央 开 一 边 长 为 3mm的 菱 形 或 正 方 形 小孔 ， 置 目 镜 光 阑 处 ， 用 于 缩 视 野 法 计 数 ） 三 、 操 作 步 骤1. 染 色 ： 于 载 玻 片 的 一 端 加 煌 焦 油 蓝 酒 精 溶 液 1滴 ，任 其 自 然 凉 干 后 备 用 ， 取 末 梢 血 或 抗 凝 血 一 滴 ， 于已 干 燥 的 染 料 上 ， 用 推 片 角 混 匀 后 ， 将 两 玻 片 盖 合（ 玻 片 法 ） ； 试 管 法 取 染 液 2滴 入 试 管 ， 加 血 2滴混 匀 ， 封 闭 好 ， 待 15分 钟 以 上 时 间 ，2. 推 片 ： 取 混 合 液 1小 滴 于 载 玻 片 的 一 端 ， 推 制 成 薄而 均 匀 的 血 膜 ，3. 低 倍 镜 浏 览 ， 选 取 红 细 胞 分 布 均 匀 网 织 红 细 胞 染色 较 好 的 部 分 （ 体 尾 交 界 处 ） ， 滴 香 柏 油 转 换 至 油镜 ， 在 Miller窥 盘 下 计 数 小 方 格 中 的 RBC数 和 大 方格 中 的 网 织 红 细 胞 数 （ 或 数 出 整 个 视 野 中 的 RBC总 数 和 其 中 的 网 织 红 细 胞 数 ， 换 一 视 野 同 法 计 数 至几 个 视 野 RBC总 数 1000为 止 ） 。 Miller窥 盘 A3 1B 将 Miller窥 盘 放 在 显微 镜 目 镜 中 ,通 过 窥 盘中 大 小 方 格 间 的 9比 1比 例 关 系 计 算 RBC数 和Ret数 。 四 、 计 算 1.Miller窥 盘 法 ： 网 织 红 细 胞 （ Retic）百 分 率 (%)= （ 大 方 格 内 Retic总 数 ）/（ 小 方 格 内 RBC总 数 9） 100% 2.直 接 计 数 法 ： 网 织 红 细 胞 （ Retic） 百分 率 (%)= 多 个 视 野 内 Retic总 数 /多个 视 野 内 RBC总 数 100% 五 、 注 意 事 项1.用 酒 精 染 液 时 ， 应 待 玻 璃 片 上 的 酒 精 挥 发 干 燥后 ， 才 能 加 血 液 ， 染 色 时 应 用 推 片 角 不 停 搅 动 ，使 染 料 和 血 液 混 合 ， 防 止 凝 固 。2.染 色 时 间 一 定 要 充 足 ， 混 合 后 不 能 立 即 推 片 ，室 温 低 时 染 色 时 间 应 适 当 延 长 ， 应 覆 以 另 一 玻片 防 止 蒸 发 。3.染 液 与 血 液 比 例 以 1： 1为 宜 ， 贫 血 适 当 加 血 量 。4.涂 片 厚 薄 均 匀 适 宜 ， 弓 形 移 动 ， 多 个 区 域 计 数5.试 剂 应 定 期 重 配 ， 以 免 变 质 沉 淀 。6.与 变 性 珠 蛋 白 小 体 鉴 别 六 、 参 考 值成 人 ： 0.005-0.015（ 0.5%-1.5%）新 生 儿 ： 0.02-0.06（ 2%-6%）儿 童 ： 0.005-0.075（ 0.5%-7.5%）成 人 绝 对 值 （ 24-84） 109/L 七 、 临 床 意 义（ 1） 评 价 骨 髓 增 生 能 力 ， 判 断 贫 血 类 型 再 障 时 ， 明 显 降 低 。 绝 对 值 低 于 5 109/L可做 为 急 性 再 障 的 辅 助 诊 断 指 标 。失 血 、 多 数 溶 血 性 贫 血 患 者 网 织 红 细 胞 可 明显 高 于 正 常 。营 养 不 良 性 贫 血 在 治 疗 前 网 织 红 细 胞 可 保 持正 常 、 轻 度 升 高 或 降 低 。 （ 2） 评 价 疗 效网 织 红 细 胞 反 应 ： IDA或 巨 幼 细 胞 贫 血 分 别给 予 铁 剂 、 维 生 素 B12或 叶 酸 治 疗 23d后 ， 网 织红 细 胞 计 数 值 开 始 上 升 ， 710d达 到 最 高 (10%左 右 )； 两 周 以 后 逐 渐 降 至 正 常 水 平 ， 红 细 胞 、血 红 蛋 白 开 始 升 高 。骨 髓 移 植 、 EPO治 疗 后 ： 若 骨 髓 开 始 恢 复 造血 功 能 ， RMI升 高 ， 网 织 红 细 胞 计 数 值 上 升 。 （ 3） 放 、 化 疗 监 测 机 体 接 受 放 、 化 疗 后 ， 如 出 现 骨 髓 抑 制 ，早 期 HFR和 MFR降 低 ， 然 后 才 检 测 到 网 织红 细 胞 的 降 低 。 而 停 止 放 、 化 疗 ， 骨 髓 功能 恢 复 后 ， 又 见 上 述 指 标 依 次 上 升 。 可 指导 临 床 医 师 适 时 调 整 治 疗 方 案 ， 避 免 造 成严 重 的 骨 髓 抑 制 。 RPI=病 人 网 织 红 细 胞 （ %） /2 * 病 人 HCT/正 常人 HCT（ 男 0.45， 女 0.40） 临 床 应 用 ： 3提 示 溶 血 性 贫 血 或 急 性 失 血 性 贫 血 ；网 织 红 生 成 指 数 （ Reticulocyte production index,RPI） 八 、 思 考 题 一 溶 血 性 贫 血 患 者 ， 红 细 胞 计 数2.6x1012/L， 血 细 胞 比 容 0.29， 网 织 红 细胞 计 数 相 对 值 为 35%， 如 何 报 告 网 织 红细 胞 检 测 结 果 ？ n 外 周 血 网 织 红 细 胞 计 数 （ 百 分 数 和 绝 对 值 ） 是 一 反 映骨 髓 红 系 增 生 活 性 的 常 用 指 标 。 许 多 学 者 先 后 提 出 应用 FCM和 不 同 的 RNA特 异 性 荧 光 染 料 自 动 计 数 网 织 红细 胞 的 方 法 ， 如 派 若 宁 Y、 AO、 溴 化 乙 啶 、 thiazole orange等 。 目 前 最 普 遍 应 用 的 是 thiazoie orange 染 色 法 ，这 种 特 异 性 RNA 的 激 发 波 （ 488nm） 测 量 的 特 点 ， 与人 工 计 数 法 相 比 ， 它 不 但 能 得 到 网 织 红 细 胞 的 百 分 数和 绝 对 值 ， 而 且 还 能 获 得 网 织 红 细 胞 成 熟 指 数 （ RMI） 。RMI是 一 个 检 测 骨 髓 功 能 的 独 立 实 验 室 指 标 ， 它 与 网 织红 细 胞 内 RNA含 量 成 正 比 ， RMI可 成 功 地 用 于 评 价 骨 髓移 植 的 效 果 。 n 目 前 ， FCM检 测 网 织 红 细 胞 主 要 用 于 1） 预 测 骨 髓 移 植 的 效 果 ； 2） 解 释 各 种 红 系 增 长 低 下 性 贫 血 的发 病 原 因 ; 3） 评 价 某 些 新 的 重 组 生 物 制 剂 的 治疗 效 果 。