生物物质的分离与纯化

第十三章生物物质的分离与纯化 1、 培 养 液 的 预 处 理 2、 培 养 液 的 固 液 分 离 3、 细 胞 的 破 碎 4、 生 物 物 质 的 分 离 纯 化 方 法 5、 生 物 分 离 工 艺 介 绍教 学 内 容 补 充 内 容 （ 一 ）发酵醪(发酵液)的一般特征 利用微生物发酵生产各种发酵产品，由于菌种不同和发酵醪特性不同，其预处理方法和提取、精制方法的选择也有差异。应针对发酵醪的特性来合理选择处理方法，大多数发酵产物存在发酵醪中，也有少数发酵产物存在菌体中，或发酵醪和菌体都 含有，例如四环类抗生素。各种发酵产物无论在发酵醪或是在菌中体现往往浓度较低，并与种种的溶解和悬浮的杂质混在一起，要分离提纯发酵产物，首先要针对发酵醪的特性进行预处理。 发酵醪的特性一般可归纳为：1、发酵醪大部分是水，一般含量达90%-99%.2、发酵醪中发酵产物浓度较低，尽管由于菌种、原料、工艺条件不同，发酵产物于发酵醪中浓度的高低也有差异，但总的来说发酵醪中发酵产物浓度都是比较低的，除了酒精、柠檬酸、葡萄糖酸等发酵产物浓度在10%以上外，其余的都在10%以下，而抗生素的浓度更低，一般在1%以下。3、发酵醪中的悬浮固体物主要含有菌体和蛋白质胶状物。由于发酵醪中存在一定数量的菌体和蛋白质胶体物质，不仅使发酵醪粘度增加，不利于过滤，而且增加提取和精制后工序的操作困难，在浓缩过程中变得更粘稠，同时容易产生泡沫。采用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在夺产生乳化，使溶媒相和水相分层困难；采用离子交换法提炼时，蛋白质的存在也会增加树脂的吸附量，加重树脂的负担。 4、发酵醪的培养基残留成分中还含有无机盐类，非蛋白质大分子其降解产物对提取和精制均有一定的影响。5、发酵醪中除了发酵产物外，常有其他少量的代谢产物。发酵过程中除了主代谢产物外，尚伴有一些其他的副代谢产物。这些少量的副产物，有时其结构特性与发酵主产物极为近似，这就会给分离提纯操作带来困难。6、发酵醪中还含有色素、热原质、毒性物质等有机杂质。尽管它们的确切组成还不十分明了，但它们对提炼影响相当大。为了保证发酵产品的质量和卫生标准，应通过预处理将色素、热原质、毒性物质等有机杂质先除去。 发酵成熟醪中常含有各种样的杂质，而所需要的发酵产物则含量很少。因此，要获得纯净的发酵产物，它的提取与精制过程便成为一个复杂而必不可少的工艺过程。提取和精制的目的在于从发酵液中制取高纯度的、合符质量标准要求的发酵成品。 尽管由于菌种、发酵醪的特征及发酵工艺的不同，发酵产物可以多种多样，但从工业发酵范畴来看，从发酵醪中获得产物大致可分为三类：发酵产物的分类 补 充 内 容 （ 二 ） 菌体 主要以菌体细胞作为发酵产品，如单细胞蛋白、面包酵母、饲料酶母等。此外就是从菌体细胞中提取有用的发酵产物，如由酵母细胞提取辅酶A、核糖核酸等产品。有的抗生素主要存在于菌丝体中，如灰黄霉素产生菌在发酵过程中所产生的灰黄霉素主要在菌丝中，因此，也要从菌丝体中进行提取。酶 发酵产物为酶制剂，包括胞外酶和胞内酶。如-淀粉酶、-淀粉酶、异淀粉酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶、右旋糖酐酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、转化酶、蜜二糖酶、柚苷酶、花青素酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基酰化酶、天冬氨酸酶、青霉素酰胺酶、磷酸二酰酶、天冬酰胺酶等，均在工业上和医药上发挥作用。代谢产物 中间代谢产物包括醋酸、乳、柠檬酸、葡萄糖酸、衣康酸及延胡索酸等。氨基 酸发酵产物包括谷氨酸、赖氨酸、色氨酸等。由于对菌种的变异和氨基酸代谢机理的研究日益深入，所以其他氨基酸，除蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸外，18种氨基酸均可用直接发酵法制造。 有机溶剂发酵产物包括酒精、丙酮、丁醇等。 核苷酸类物质发酵产物包括肌苷、肌苷酸以及鸟苷酸等。5-肌苷酸和5-鸟苷酸均为呈味核苷酸，核酸的微生物包括辅酶A、ATP、辅酶I等均为重要的医药品。 抗生素发酵产物包括青霉素、链霉素、四环素、土霉素、金霉素、庆大霉素、新霉素、红霉素及利福霉素等。 多糖发酵产物包括右旋糖酐及多糖B-1459等。多糖是医药和工业上重要粘性物质来源之一，右旋糖酐经过部分水解后供代血浆用。多糖B-1459是水溶性、高分子量的胞外异多糖。 维生素发酵产物有核黄素、维生素C和维生素B12. 甾体氧化的产物为甾体激素，是重要的品。如醋酸可的松、氢化可的松、醋 酸泼尼松、氢化泼尼松等促皮质激素及肾上腺皮质激素制剂、黄体酮、甲孕酮（安宫黄体酮）等性激素、炔诺酮等避孕药。 问 题1、发酵醪有哪些特性？2、发酵醪中获得产物大致可分为 、 、 三类？3、发酵液中的细胞代谢产物有哪些？分别举出2个具体代表产物。 生化生产过程的最后一个环节是把目标产物从培养液或反应液中分离提取出来。多数生化产品在生产过程中需经微生物发酵、酶反应过程或动植物细胞大量培养，并通过包括产物回收、粗分离、纯化及精制等处理后，才能符合一定的质量标准。在生物产品生产过程中一般将微生物发酵、酶反应过程或动植物细胞大量培养称为“上游过程”，而与之相应的产物回收、粗分离、纯化及加工等后续过程就称之为“下游过程”，或称之为生化分离和纯化过程。众所周知，要使生物技术走向产业化，必须要上下游过程兼容、协调、以使全过程能优化进行。 鉴于生化产品具有如下特点：目的产物在初始物料中的含量低；含目的产物的初始物料组成复杂，除了产物外，还含有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等；生物活性物质的稳定性差，对PH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，易失活、变性；生化产品种类繁多，包括了大、中、小分子量的结构和性质复杂又各异的生物 活性物质；生化产品的应用面广，许多产品用作医药、食品、试剂等，对含量和纯度要求高等。因此，应用于生化产品的后处理过程中的分离纯化技术必须满足以下一些要求： 条件温和，特别对具有生物活性的物质，在后处理过程中必须保持其生物活性；分离纯化技术的选择性好、专一性强，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，以达到较高的分离纯化倍数；目的产物的量和活性具有较高的收率； 应用于生化产品的后处理过程中的分离纯化技术必须满足以下一些要求： 在提高单个分离技术的收效率的同时，注意各单元操作间的有效组合和整体协调，以减少工艺过程的步骤；快速，以提高生产能力。 就目前的发展和应用情况来看，在大多数生物产品的开发研究中，后处理过程等的研究费用约占全部费用的50%以上，在产品的成本构成中，后处理成本占总成本的40%-80%,对于精细胞和药用的产品，此比例就更高。生产过程中后处理投入的人力和物力占全部的70%-90%. 生物产品的后处理分离纯化技术和工艺不仅影响产品的质量和成本，也决定着产品的产量。生化产品由于没有适当的提取、分离和纯 化方法或因回收率太低致使 生产成本过高而不能投产的例子是屡见不鲜的。 不同的生化产品，由于自身的特性及其对纯度要求的不同，所采用的分离纯化路线常常也是不同的。例如从发酵液中提取和精制菌体和胞内酶，就与分离与纯化细胞的代谢产物有明显的不同；同样即使产物都属于代谢产物，由于产物的化学结构不同，其提取和精制的方法也就不同。但一般来说，分离纯化路线都包括了两个基本阶段：产物的初级分离阶段；产物的纯化精制阶段。 初级分离阶段在细胞培养结束之后，其任务是分离培养液、破碎细胞释放产物（如果产物在胞内）、溶解包涵体、复原蛋白质、浓缩产物和去除大部分杂质等。 纯化精制阶段是在初级分离的基础上，用各种高选择的手段和方法，将目标产物和干扰杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到相关的要求，成为级别的产品。 生物产品的后处理过程一般包括：发酵液的预处理；提取；精制三个步骤 。 图13-1生物产品分离纯化的一般步骤发酵液或培养液细胞产物胞外产物胞内产物离心或过滤细胞（洗涤）离心或过滤（洗涤)离心或过滤（洗涤）细胞破碎（化学法机械法等）整体细胞萃取离心、过滤干燥 分离剂回收、再生提取、分离沉淀、吸附、萃取、过滤等分离剂回收、再生纯化、精制层析、结晶、电泳等干燥废物产物产物 滤液循环副产物废物滤渣副产物循环废物细胞滤渣副产物废物细胞含产物的清液预处理阶段 一、培养液的预处理 问 题 1、培养液的预处理的目的是什么？2、培养液的预处理包括哪些步骤？ 菌体细胞的分离固体悬浮物的去除蛋白质的去除重金属离子的去除 色素、热原质、毒性物质等有机物质的去除改善培养液的处理性能调节适宜的PH和温度 二、培养液的固液分离方法 1、 分 离 前 的 处 理 加热 由于加热可能使某些热敏感性蛋白发生不可逆的变性，因此这种预处理方法仅适用于对非热敏感性产品发酵液的预处理。适当加热之后，发酵液中的蛋白由于变性而凝聚，形成较大的颗粒，发酵液的粘度就会降低，一般加热的用65-80 调节PH值 适当的PH值可以提高产物的稳定性，减少其在随后的分离纯化过程中的损失。此外，发酵液PH值的改变会影响发酵液中某些成分的电离程度，从而 降低发酵液的粘度。在调节PH值时要注意选择比较温和的酸和碱，以防止局部过酸或过碱。草酸是一种较常用的PH值调节剂。 加入絮凝剂 通常情况下，细菌的表面都带有负电荷，可以在发酵液中加入带正电荷 的絮凝剂，从而使菌体细胞与絮凝剂结合形成絮状沉淀，降低发酵液的上粘度，利于菌体的收获。 2、 固 液 分 离 方 法 3、 碟 式 离 心 机 结 构 及 工 作 原 理进料轻液出口 菌体及固体杂质 当发酵醪由转鼓中心进料入高速旋转的转鼓内，由于固、液比重不同，在碟片空间内由于离心力的作用下，把发酵醪分成固相和液相两部分。比重较轻的清液有规则地沿着碟片的上表面向碟片轴心方向移动，由环形轻液出口处排出，而比重较大的菌体及浓缩物，则有规则地沿着上一个碟片的底表面滑移到碟片边缘，经转鼓壁上的喷嘴喷出收集于菌体收集器内，从而达到分离菌体的目的。 此机的转速可高达6000-10000r/min左右。我国广州重型机械厂生产的DP-400型酵母高速离心分离机转速为6500r/min，可适用于发酵工 业的菌体分离。 干燥处理机械法非机械法固体剪切作用流体剪切作用破碎方法溶胞处理珠磨法压榨法超声法化学法物理法高压匀浆酶溶法三、细胞的破碎 细胞破碎就是通过采用不同手段破坏细胞外围使细胞内含物释放出来，转入液相中，以便于进行产物的分离纯化。细胞破碎的方法有很多，按照是否存在在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。如图13-2为细胞破碎方法的分类。 表13-2列出了主要的细胞破碎方法的原理，使用的设备、特点和存在的缺点。 表13-2细胞破碎方法序号方 法原 理设备特 点缺 点1压力破碎法利用压力释放时的液固剪切进行破碎压力破碎机操作简便，可连续操作，适用于不同的细胞加压放热，需要冷却，否则生物活性物质会失活；破碎率较低，压力不稳定，需要进行反复破碎2珠磨破碎法利用固体的剪切进行破碎细胞珠磨破碎机操作简便、稳定，可连续批式操作，破碎率可以控制，容易放大，适用于工业放大珠磨时会放热，需要高效冷却，不同细胞的破碎条件差异大3超声波破碎法利用超声波形成空穴产生压力冲击使进行破碎超声破碎机操作简便，可连续或批式操作超声波处理会产热，需要冷却，破碎率较低，需反复进 行破碎，应用面较窄4渗透压法利用渗透压的突变，造成细胞内压力差而引起细胞的破碎适用于位于胞内质的产物释放，细胞的破碎率低，但产物的释放较好，纯度较高 操作比较复杂，条件要求严格，只适用于少量榈的处理，费用高5有机溶剂或表面活性剂法利用有机溶剂或表面活性剂改变细胞壁或膜的通透性，使胞内产物得以释放方法简单，细胞内含物释放少，产物较纯，可大规模应用 适用性有限，只适合于对有机溶剂或表面活性剂稳定的产物6碱或酶处理法经碱或酶的处理使细胞壁或膜破坏，使产物释放出来方法简单，可大规模应用适用性有限，只适合于对碱或酶稳定的产物 问 题细胞破碎的方法的具体有哪些？四、生物物质的分离纯化方法 发酵产物的提取和精制过程也就是浓缩和纯化过程，一般包括：发酵液的预处理；提取；精制三个步骤。在提取前还必须使菌体、悬浮固形物、固体发酵液开，即进行过滤或离心分离，并加入一些物质或采取一些措施，以改变发酵液的性质，便于以后的提取，这过程称为发酵液的预处理。由于发酵液体积大，发酵液中的发酵产物浓度低，一步操作远不能满足要求，而常要好几步操作。其中第一步操作从发酵液中分离提取发酵产物最为重要，称为提取。而以后几步操作所处理的体积小了，操作要容易些，主要将发酵产物部分除去杂质、浓缩、提纯及精炼，这过程统称精制。 用于生物物质分离、纯化的方法除了传统的沉淀法、吸附法、离子交换、萃取法等之外，还有超滤、反渗透、电渗析、凝胶电泳、离子交换层析、新和层析、疏水层析、等电聚焦、双水相萃取、超临界萃取、反胶团萃取、凝胶层析等。表13-3、表13-4、表13-5分别列出了一些生物分离纯化技术及其它们的特点、经济性。 表13-3主要的生物分离纯化技术一览表分离纯化技术开发现状典型产物产物回收率选择性产物产出形式蒸馏工业化挥发性物质高回收所有的挥发性物质，选择性低产物浓溶液浓缩 加热法 超滤法工业化非挥发性物质分子量大于50000的物质取决于产物的稳定性高无选择性去除所有低分子量化合物去除挥发性组分的浓缩发酵液浓缩且部分纯化的发酵液萃取 溶剂 （传统） 溶剂 （离子对） 双水相分配双水相+液膜工业化半工业化小规模工厂生产溶剂可溶性物质溶剂可溶的，且必须有适当的抗衡离子的物质大分子量物质潜力大，产物范围广中高中潜力 大去除所有不能溶于溶剂的化事物较好选择性中等选择性潜力很大产物与溶剂的混合溶液产物与平衡离子溶剂的混合溶液溶解在聚乙二醇中的产物溶液溶剂和产物溶液的乳人液沉淀、过滤或离心工业化产物的不溶性衍生物高选择性较高产物不溶衍生物的浓浆吸附工业化大分子量及不稳定物质中选择性高，甚至是专一性以溶液存在于洗脱液中 问 题请列举出生物物质分离纯化的方法（至少5个）？五、生物分离工艺介绍 生物产品的商品化，除了必须有良好、高效的生物分离纯化的方法外，还必须对这些方法进行合理的安排，以得到可用于大规模生产的、具有良好的经济的性的生物分离工艺。为了获得优化的生物分离工艺，保证生产目的的实现，设计具体工艺前一般需要考虑以睛的总体概念：P246 纯度和质量 成本 利用微生物、工程菌进行发酵或动植物细胞培养、酶反应等 进行生物产品的上游过程中的各种因素均对分离纯化的方法和分离工艺有直接的影响。P246共7点 生化产品的大规模生产对分离纯化技术和生物分离工艺有以下一些要求：P247生物分离工艺设计的方法主要有：P247248方法启发式设计启发式专家启发式数学模型式合成式 生化产物在物料中的存在形式基本上有两种情况：细胞内或细胞外。在工艺设计时为从原始物料中回收产品，首先需要进行液-固分离，若产物是在溶液中，固-液分离后所得的含产物和大量杂质的稀溶液，经浓缩后，再进行分离纯化。而对于产物处于细胞内时，固-液分离后，得到的细胞需要进行破碎，使产物释放到溶液中，再经过液-固分离后，得到含产物和大量稀溶液，再经浓 缩 后，再进行分离纯化。若产物是在细胞内以包涵体形式存在，须将包涵体与细胞碎片分离，经过变性、复性后进行分离纯化。生物分离工艺的基本流程如图13-4所示。 由于产物及种类不同，生化产品的分离纯化工艺也是不同的。但工业生产工艺中的分离纯化步骤的安排顺序还是有一些共同点，总是将最容易分离的物质放在前面，而将难以分离的物质留在后面进行分离。一般第一步应当是非特异性的低分辨率的分离技术，如沉淀、粗的吸附；第二步采用高分辨、较高选择性的分离技术；最后选择兼有高选择性分离纯化、又有澄清、脱盐等作用的凝胶层析等。这种工艺安排是基于在粗分离时，物料体积较大，使用便宜、低选择性的技术来减少成本。而后面的步骤由于物料体积的减小和减少，就可以比较经济地使用更昂贵的高选择性分离步骤。表13-6为一些与产物相关的分离纯化工艺过程。 初始物料细胞固-液分离溶液细胞破碎固-液分离包涵体固体溶液 提取变性复性浓缩粗分离纯化精制产品