大肠杆菌感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态细胞的制备、重组DNA的转化、克隆筛选 1. 实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2. 相关知识及原理 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的细胞 。（人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因 ） 转 化 （ transformation） ： 是 将 异 源 DNA分 子 导 入受体细 胞 ， 使 受 体 细胞 获 得 新 的 遗 传 性 状 的 一 种 手 段 ， 是 基 因 工 程等 研 究 领 域 的 基 本 实 验 技 术 。 进 入 细 胞 的 DNA分 子 通 过 复 制 表 达 ， 才 能实 现 遗 传 信 息 的 转 移 ， 使 受 体 细 胞 出 现 新 的 遗传 性 状 。 转 化 过 程 所 用 的 受 体 细 胞 一 般 是 限 制 修 饰系 统 缺 陷 的 变 异 株 ， 即 不 含 限 制 性 内 切 酶 和 甲基 化 酶 的 突 变 株 。 转 化 的 方 法 ： 化 学 的 方 法 (热 击 法 )； 使 用 化 学 试 剂 （ 如CaCl2） 制 备 的 感 受 态 细 胞 ， 通 过 热 击 处理 将 载 体 DNA分 子 导 入 受 体 细 胞 ；1. 电 转 化 法 ： 使 用 低 盐 缓 冲 液 或 水 洗 制 备 的感 受 态 细 胞 ， 通 过 高 压 脉 冲 的 作 用 将 载 体DNA分 子 导 入 受 体 细 胞 。 3 仪 器 、 材 料 和 试 剂 无 菌 超 净 台 ， 电 热 恒 温 水 浴 ， 分 光 光 度 计 ，离 心 机 ， 移 液 器 ， 微 型 离 心 管 等 ； 菌 株 ： E.coli jM109 质 粒 ： pUC+DNA 片 段 的 重 组 质 粒 LB培 养 基 ； 含 抗 菌 素 的 LB平 板 培 养 基 （ 氨 苄 青 霉 素 ， 终 浓度 100g mL ) 氨苄青霉素；母液200mg/ml 预 冷 CaCl 2溶 液 （ 0.1mol L） 4 操 作 步 骤 1） 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 的 制 备 (CaCl2法 ) （ 1） 从 新 活 化 的 E.coli E.coli jM109菌 平 板上 挑 取 一 单 菌 落 ， 接 种 于 3 5ml LB液 体 培养 中 ， 37 振 荡 培 养 12h左 右 ,将 该 菌 悬 液 以1:100 1:50转 接 于 100ml LB液 体 培 养 基 中 ，37 振 荡 扩 大 培 养 ， 当 培 养 液 开 始 出 现 混 浊后 ， 每 隔 20 30min测 一 次 OD600nm， 至OD600nm0.5时 停 止 培 养 ； （ 2） 每 组 取 培 养 液 1-4ml转 入 离 心 管 中 ，在 冰 上 冷 却 5min(可 省 略 ） ,5000r min离 心2min （ 3） 倒 净 上 清 培 养 液 ， 用 1ml冰 冷 的0.1mo1 L CaCl2溶 液 轻 轻 悬 浮 细 胞 ， 冰 浴30min ；（4） 5000rmin离心2min；（5）弃去上清液，加入400l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。 5000rmin离心2min ； （ 6） 弃 去 上 清 液 ， 加 入 200l冰 冷 的 0.1mo1L CaCl2溶 液 ， 小 心 悬 浮 细 胞 ， 冰 上 放 置 片 刻后 ， 即 制 成 了 感 受 态 细 胞 悬 液 ；（ 7） 制 备 好 的 感 受 态 细 胞 悬 液 可 直 接 用 于 转化 实 验 ， 也 可 加 入 占 总 体 积 15 左 右 高 压 灭 菌过 的 甘 油 ， 混 匀 后 分 装 于 1.5ml离 心 管 中 ， 置于 -70 条 件 下 ， 可 保 存 半 年 至 一 年 。 2） 细 胞 转 化 分 别 取 3个 200l感 受 态 细 胞 悬 液 (如 是 冷 冻 保 存 液 ，则 需 化 冻 后 马 上 进 行 下 面 的 操 作 )， 第 一 组 ，转化实验组 加 入 5 l重 组 质 粒 DNA + 200l感 受 态 细 胞 第二组， 200l感受态细胞悬液； 第三组，质粒DNA对照组 1ng 质粒DNA十200l感受态细胞悬液。 (2) 将 以 上 各 样 品 轻 轻 摇 匀 ， 冰 上 放 置 30min，于 42 水 浴 中 保 温 1.5min， 然 后 迅 速 冰 上 冷却 2min(3) 立 即 向 上 述 管 中 分 别 加 入 0.6ml LB液 体培 养 基 （ 不 需 在 冰 上 操 作 ） ， 使 总 体 积 到0.8ml， 该 溶 液 称 为 转 化 反 应 原 液 ， 摇 匀 后于 37 振 荡 培 养 约 45min ， 使 受 体 菌 恢 复 正常 生 长 状 态 3) 平 板 培 养 （ 有 时 需 要 稀 释 ）(1)取 各 样 品 培 养 液 0.1ml， 分 别 接 种 于含 抗 菌 素 LB平 板 培 养 基 上 ， 涂 匀（ 如 果 用 玻 璃 棒 涂 抹 ， 酒 精 灯 烧 过后 稍 微 凉 一 下 再 用 ， 不 要 过 烫 ） 。 (2) 菌 液 完 全 被 培 养 基 吸 收 后 ， 倒 置 培 养 皿 ，于 37 恒 温 培 养 箱 内 培 养 过 夜 (12-16小 时 )，待 菌 落 生 长 良 好 而 又 未 互 相 重 叠 时 停 止 培 养 用 CaCl2法 制 备 的 感 受 态 细 胞 ， 可 使 每 微克 超 螺 旋 质 粒 DNA产 生 5106-2107个 转 化菌 落 。 在 实 际 工 作 中 ， 每 微 克 有 105以 上 的转 化 菌 落 足 以 满 足 一 般 的 克 隆 实 验 。 重 组 质 粒 克 隆 的 鉴 定鉴 定 带 有 重 组 质 粒 克 隆 的 方 法 常 用 的 有 -互 补 小 规 模 制 备 质 粒 DNA进 行 酶 切 分 析 插 入 失 活 PCR 杂 交 筛 选 的 方 法最 常 用 的 方 法 是 小 规 模 制 备 质 粒 DNA进 行酶 切 分 析 ， 对 于 带 有 LacZ基 因 的 载 体 还 可以 结 合 -互 补 现 象 来 筛 选 。 各 实 验 组 在 培 养 皿 内 菌 落 生 长 状 况 及 结 果 分 析