细胞培养设施和基本条件

第二章 细胞培养设施和基本条件细胞培养技术 第 一 节 实 验 室 设 计实验室设计原则 防止微生物污染和有害因素影响要求 工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘划分不同功能区或用铝合金板隔开无菌操作区应在室内较少走动的内侧清洗和消毒安置在另室一般包括：准 备 室 、 缓 冲 室 和 培 养 室 准 备 室 ： 用 于 进 行 培 养 器 皿 的 清 洗 、 包 装 、 培 养 物 质 的 准 备和 消 毒 以 及 供 应 物 品 的 保 藏 等 。缓 冲 室 ： 为 减 少 外 界 污 染 源 带 入 培 养 室 ， 在 培 养 室 外 间 有 一缓 冲 室 ， 3 5m2既 可 ， 可 作 为 更 衣 室 ,也 可 放 置 恒 温 培 养 箱或 离 心 机 。培 养 室 ： 用 于 进 行 细 胞 培 养 和 各 种 无 菌 操 作 的 实 验 室 。 其 基本 条 件 是 ： 清 洁 、 无 菌 、 干 燥 、 不 通 风 ， 并 具 有 适 宜 的 光 线 ，应 尽 量 设 法 避 免 外 界 的 污 染 。 培 养 室 和 缓 冲 室 的 天 花 板 上 均 应 装 消 毒 用 的 紫 外 线 灯 。 41 缓 冲 室 一 、 最 常 用 的 大 型 必 备 装 置 和 仪 器 净 化 工 作 台 、 CO2培 养 箱 、 倒 置 显 微 镜 、 离 心 机 、 冰 箱 、 电 热 干 燥 箱 、 超 纯 水 装 置 、 消 毒 锅 、 超 声 波 清 洗 器 、 恒 温 水 浴 箱 、 冷 冻 保 存 装 置 、 天 平 等二 、 最 常 用 的 培 养 器 具 l.过 滤 除 菌 装 置 ： 不 锈 钢 正 压 过 滤 器 、 一 次 性 滤 器 2.手 术 器 械 3.培 养 器 皿 ： 溶 液 瓶 、 培 养 瓶 、 培 养 皿 、 多 孔 培 养 板 、 移 液 管 和 吸 管 、 离 心 管 第 二 节 实 验 室 设 备 外 流 式 （ 基 本 不 用 ） 侧 流 式 直 流 式超 净 工 作 台 ：工 作 原 理 是 利 用 鼓 风 机 驱 动 空 气 遁 过 高 效 滤 器 除 去 空 气中 的 尘 埃 颗 粒 ， 使 空 气 得 到 净 化 。 净 化 空 气 徐 徐 通 过 工作 台 面 ， 使 工 作 台 内 构 成 无 菌 环 境 。 超 净 工 作 台 结 构 和 模 式 图 CO2培 养 箱 ：维 持 适 当 温 度 、 湿 度 与 pH培 养 箱 设 定 的 条 件 为 37 ，5 CO2培 养 容 器 需 与 外 界 保 持 通 气 状态箱 内 空 气 应 保 持 干 净 ， 定 期 消毒 （ 紫 外 灯 、 酒 精 ）水 槽 :使 用 蒸 馏 水 ， 保 持 一 定湿 度 。 电 热 干 燥 箱 ：烘 干 和 干 热 消 毒 玻 璃 器 皿鼓 风 与 升 温 同 时 进 行 ， 100度 时 可停 止 鼓 风禁 止 先 升 温 后 鼓 风100度 以 下 时 再 打 开 箱 门金 属 器 械 、 塑 料 制 品 、 橡 胶 等 不能 在 干 燥 箱 内 消 毒 干 热 灭 菌 （ 160 ， 2hr） 高 压 灭 菌 锅 ：用 于 湿 热 灭 菌液 体 、 金 属 器 械 、 塑 料 制 品 、橡 胶 等 不 能 在 干 燥 箱 内 消 毒121 ， 20min 超 纯 水 仪 倒 置 显 微 镜 离 心 机 液 氮 罐 手 动 移 液 器电 动 移 液 器 精 密 PH计微 孔 板 震 荡 器 培 养 器 皿 玻 璃 瓶 皿 （ 用 于 储 存 各 种 液 体 ）玻 璃 瓶 （ 500毫 升 、 250毫 升 、 100毫 升 ）吸 管 、 离 心 管 多 孔 培 养 板 4、 6、 24、 96孔 ； 培 养 皿 30、 60、 100毫 米 ； 培 养 瓶 第 三 节 清 洗 与 消 毒在 组 织 细 胞 培 养 中 清 洗 和 消 毒 是 一 项 极 为 重 要 的 环 节 。清 洗 的 主 要 目 的 :清 除 杂 质 和 微 生 物 ， 使 在 器 皿 内 不 残 留任 何 影 响 细 胞 生 长 的 成 份 。 金 属 类 以 配 置 10000ml常 用 清 洁 液 为 例 介 绍 如 下 ：先 在 搪 瓷 盆 或 塑 料 盆 中 加 入 蒸 馏 水 8000ml， 称 取 1000g重 铬 酸钾 ， 用 玻 璃 棒 搅 拌 直 至 溶 解 （ 可 加 热 以 辅 助 溶 解 ） ， 待 重 铬 酸钾 液 冷 却 后 ， 缓 慢 加 入 1000ml浓 硫 酸 ， 边 加 边 用 玻 璃 棒 搅 动 ，以 混 合 液 温 度 不 过 快 上 升 和 不 出 现 重 铬 酸 钾 结 晶 为 度 。配 好 后 倒 入 洗 液 缸 中 备 用 。 新 配 制 的 清 洁 液 呈 棕 红 色 。 当 使 用时 间 过 久 ， 清 洁 液 的 颜 色 变 暗 、 发 绿 或 混 浊 时 ， 应 弃 去 （ 深 埋地 下 ） ， 配 制 新 的 。 酸 缸配 制 、 盛 装 清 洁 液 的 容 器 应 防 酸 、 耐 热 、 有 较 大 的 开 口 ，一 般 用 瓷 缸 、 玻 璃 制 品 或 耐 酸 塑 料 制 品 。 新 购 置 物 品 玻 璃 器 皿 清 洗 步 骤清 水 浸 泡 半 小 时 以 上 简 单 刷 洗 5%的 稀 盐 酸 浸 泡 过夜 自 来 水 冲 洗 在 洗 涤 剂 中 反 复 刷 洗 自 来 水 中 充分 冲 洗 凉 干 （ 或 50 烤 干 ） 浸 酸 过 夜 流 水 振 荡冲 洗 20遍 漓 水 去 离 子 水 冲 洗 3 4次 三 蒸 水 冲 洗两 次 （ 或 浸 泡 一 次 ） 50 烤 干 ， 待 包 装 。 用 过 的 玻 璃 器 皿 清 洗 步 骤带 毒 玻 璃 器 材 用 后 应 立 即 浸 入 消 毒 水 中 ， 非 带 毒 的 玻 璃器 材 需 浸 入 清 水 中 浸 泡 刷 洗 自 来 水 冲 洗 凉 干（ 50 烤 干 ） 浸 酸 过 夜 流 水 振 荡 冲 洗 20遍 漓 水 去 离 子 水 冲 洗 3 4次 三 蒸 水 冲 洗 两 次 （ 或 浸 泡 一 次 ） 50 烤 干 ， 待 包 装 。 橡 皮 帽 和 橡 皮 塞 的 清 洗新 购 置 的 橡 胶 制 品 （ 大 小 胶 塞 、 橡 皮 胶 头 ） 的 洗 涤方 法 :2%NaOH煮 沸 15分 钟 流 水 冲 洗 2 5%稀 HCl煮沸 15分 钟 流 水 冲 洗 去 离 子 水 煮 沸 20分 钟 （ 或 去离 子 水 浸 泡 过 夜 ） 去 离 子 水 冲 洗 一 次 三 蒸 水 煮沸 20分 钟 三 蒸 水 冲 洗 一 次 50 烤 干 备 用 不 锈 钢 除 菌 滤 器 的 清 洗先 用 洗 涤 剂 刷 洗 滤 器 流 水 冲 洗 15分 钟 去 离 子 水 冲 洗2 3次 （ 去 离 子 水 浸 泡 24小 时 ） 三 蒸 水 冲 洗 2 3次 或浸 泡 24小 时 干 燥 备 用 。镊 子 、 剪 刀 纱 布 擦 去 脏 污 自 来 水 洗 净 酒 精 棉 球 擦 试 。金 属 滤 网 自 来 水 冲 洗 蒸 馏 水 冲 洗 三 蒸 水 冲 洗 。 二 、 消 毒细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染 1 234 56 7 8 9 1011 课 后 思 考 题 ：1.细 胞 培 养 工 作 室 可 分 为 那 几 个 部 分 ， 各 有 什 么 作 用 ?2.试 述 清 洁 液 的 配 方 组 成 及 配 制 时 的 注 意 事 项 。3.细 胞 培 养 中 需 要 进 行 物 理 、 化 学 和 抗 生 素 消 毒 ， 举 出消 毒 方 法 和 使 用 范 围 。