共聚焦使用指南

共聚焦使用指南一、开机1. 打开显微镜开关，汞灯开关，电脑开关（地上）。2. 打开激光器开关按钮（右边3个，左边1个（观察DAPI）。若只分析图 片，只开 PC/Stand 的开关。3. 电脑上打开软件Leica con focal software:公司模式。4. 打开激光外器钥匙（右边3个，左边1个（观察DAPI）。若只分析图片， 不用打开钥匙。5. 488激光调节器（LevelAr/ArKr）至水平状态。若只分析图片，不用调节 此处。二、显微镜下观察1. 放好样品。2. 显微镜身左边：分光拉杆拉至中间，转盘调至相应激发光。3. 显微镜身正前方：Poris调至VIS;MAG调至1x。4. 选择合适倍数调好焦距：荧光弱需要大倍数 200x,400x 采集图片。三、电脑下观察采集图片（选择第一通道）1. 显微镜转盘转至SCAN，分光拉杆全部推进。2. 显微镜身正前方 Poris 调至 side;MAG 调至 B 灯亮后回调至 UV。3. 电脑软件左下角 microcontrol 选择 SCAN。4. 点击软件左下角Beam，选择荧光通道（用途）。5. 双击选择 Beam 右上角 DAPI ，点击软件左下角 Continous 实时观察。6. 显示窗口 Experiment 的 Qlut 看曝光是否过度（蓝色表示过度），可调节 Beam左上角的ND值，桌上PMT1和pinhole（此值一般AE在1-1.5，慎慎 调）控制曝光；ZOPS可调节图片Z轴聚焦。7. 点击Beam上Save（回车2次）。8. Continous 调至 STOP 关闭实时观察。（选择第二通道）9. 双击选择Beam右上角ZZ-FITC，点击软件左下角Continous实时观察。10. 显示窗口 Experiment 的 Qlut 看曝光是否过度（蓝色表示过度），可调节 Beam上的488通道的百分值，桌上PMT1和pin hole（此值一般AE在1-1.5, 慎调）控制曝光； ZOPS 可调节图片 Z 轴聚焦。11. 点击Beam上Save（回车2次）12. Continous 调至 STOP 关闭实时观察（选择第三通道）13. 双击选择Beam右上角ZZ-TRITCwide，点击软件左下角Continous实时观 察。14. 显示窗口 Experiment 的 Qlut 看曝光是否过度（蓝色表示过度），可调节 Beam上的543通道的百分值，桌上PMT1和pin hole（此值一般AE在1-1.5, 慎调）控制曝光； ZOPS 可调节图片 Z 轴聚焦。15. 点击Beam上Save（回车2次）。16. Continous 调至 STOP 关闭实时观察。（多通道扫描）17. 点击 Beam 上 sequence, Remove 原有选择。18. 找到 Beam 右上角已保存的三通道，分别 Add 添加; sequence 右上角选 择 between frames。19. 检查软件下方扫描层数LI.A（般选择4,表示扫描时做4次线平均）。20. 点击Series,开始扫描。（显示窗口 Experiment观察）Tiled:单通道观察。OVL :多通道及合成图像观察。（局部扫描）在Continous实时观察模式下，软件上Z-in框选并数码放大局部区域； 软件上 Zoom 可整数倍光学放大局部区域,桌上 Zoom 可非整倍数光学放大 局部区域21. 扫描完毕，点击软件左上角SAVE保存图片。（加标尺）22. 找出图片，点击合成后的图片，点击显示窗口 Experiment的Single23. 点击软件左边Setting的Scale。24. 点击 Send toExperimentAll（snapshot）。四、关机25.488激光调节器（LevelAr/ArKr）至最小状态。26. 关软件，电脑，显微镜开关，汞灯。27. 关激光器钥匙（右边 3 个，左边 1 个（观察 DAPI）。28. 关激光器开关（右边2个：scanner和PC/Stand,左边1个（观察DAPI）29. 十分钟后，关激光器开关 1 个: LaserAr/ArKr。（Ca2#离子测定）1. 前面步骤重复至选择好合适通道， Continous 实时观察调好参数并保存2. 点击modle选择XYT,点开软件下方time（有闹钟那个）。3. 点击Series,开始扫描。4. 显示窗口 Experiment中点击Elip圈定细胞。5. 点击软件下方 quantity 定量观察。