《生物化学实验》PPT课件

生物化学实验技术理论 一、层析技术l 1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因又常称为层析法。l 80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。l几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。 一、层析技术l 1、层析技术原理l 2、层析技术分类l 3、常用层析技术原理 1、层析技术原理l层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。l可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。 名称操作方式固定相流动相分离依据分配层析纸层析薄层层析液体液体溶解度离子交换层析离子交换柱层析固体液体带电性静电引力吸附层析吸附薄层层析气体吸附层析固体固体液体气体吸附力亲合层析酶与底物抗原与抗体固体液体配体专一性凝胶层析 凝胶过滤固体液体分子大小 淀粉凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 凝胶支持物区带电泳 纸电泳 醋酸纤维薄膜电泳 薄层电泳 非凝胶支持物电泳 用支持物区带电泳 显微电泳等电聚焦电泳等速电泳 不用支持物电泳 是否用支持物 u= v = d/t = dle V/l Vt 类型优点缺点纸 电 泳 设 备 操 作 简 单 分 辨 率 差 ， 电 渗 现象醋 酸 纤 维 薄 膜 电泳 设 备 操 作 简 单 ， 样 品用 量 少 分 辨 率 差琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 快 速 ， 分 辨 率 高 电 渗 现 象 严 重聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶电 泳 可 调 节 凝 胶 孔 径 ， 样品 用 量 少 分 辨 率 高 ，无 电 渗 现 象 高 浓 度 凝 胶 难 剥 离 OCH2=CH-C-NH2 O OCH2=CH-C-NH -CH2-NH-C-CH=CH2 A. 样品的浓缩效应缓冲液成分及pH的不连续性l 浓 缩 胶 pH6.7l 缓 冲 液 浓 缩 胶 Tris-HCl, 电 极 缓 冲 液 Tris-Glyl 解 离 度 ： Cl 蛋 Gly l mcl clm蛋 蛋 m Gly Glyl 凝 胶 中 Cl 为 快 离 子 ， Gly 为 慢 离 子 ，蛋 白 质 样 品 被 夹 在 中 间 。 缓 冲 液样 品浓 缩 胶分 离 胶 缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图 快离子 慢离子 蛋白质样品 E：每 厘 米 的 电 压 降 E I(电 流 强 度 )/ (电 导 率 ) E与 电 泳 速 度 成 正 比l 电 泳 开 始 后 ， 由 于 快 离 子 泳 动率 最 大 ， 在 快 离 子 后 面 形 成 一个 离 子 浓 度 低 的 低 电 导 区 ， 产生 较 高 的 电 位 梯 度 ， 使 蛋 白 质和 慢 离 子 加 速 移 动 ， 蛋 白 质 样品 被 进 一 步 浓 缩 。电位梯度的不连续性 l E：每 厘 米 的 电 压 降 E I(电 流 强 度 )/ (电 导 率 )l E与 电 泳 速 度 成 正 比l 电 泳 开 始 后 ， 由 于 快 离 子 泳 动率 最 大 ， 在 快 离 子 后 面 形 成 一个 离 子 浓 度 低 的 低 电 导 区 ， 产生 较 高 的 电 位 梯 度 ， 使 蛋 白 质和 慢 离 子 加 速 移 动 ， 蛋 白 质 样品 被 进 一 步 浓 缩 。 电位梯度的不连续性 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：l 缓 冲 液 成 分 及 pH的 不 连 续 性l 电 位 梯 度 的 不 连 续 性 缓 冲 液浓 缩 胶样 品分 离 胶 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：l凝胶层的不连续性： 样 品 进 入 浓 缩 胶 有 一 个 堆 积 浓 缩效 应 (缓 冲 液 pH8.3) 蛋 白 质 从 “ ” 极 向 “ ” 极 移动 ， 从 浓 缩 胶 进 入 分 离 胶 ， 速度 变 慢 ， 堆 积 浓 缩 。 缓 冲 液样 品浓 缩 胶分 离 胶 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：l凝胶层的不连续性： 样 品 进 入 浓 缩 胶 有 一 个 堆 积 浓 缩效 应 (缓 冲 液 pH8.3) 蛋 白 质 从 “ ” 极 向 “ ” 极 移动 ， 从 浓 缩 胶 进 入 分 离 胶 ， 速度 变 慢 ， 堆 积 浓 缩 。 缓 冲 液样 品浓 缩 胶分 离 胶 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：l凝胶层的不连续性： 样 品 进 入 浓 缩 胶 有 一 个 堆 积 浓 缩效 应 (缓 冲 液 pH8.3) 蛋 白 质 从 “ ” 极 向 “ ” 极 移动 ， 从 浓 缩 胶 进 入 分 离 胶 ， 速度 变 慢 ， 堆 积 浓 缩 。 缓 冲 液浓 缩 胶分 离 胶 A. 样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：l凝胶层的不连续性： 样 品 进 入 浓 缩 胶 有 一 个 堆 积 浓 缩效 应 (缓 冲 液 pH8.3) 蛋 白 质 从 “ ” 极 向 “ ” 极 移动 ， 从 浓 缩 胶 进 入 分 离 胶 ， 速度 变 慢 ， 堆 积 浓 缩 。 缓 冲 液浓 缩 胶分 离 胶 B.电荷效应l蛋白质样品进入分离胶后 pH增 大 (pH 8.9)， Gly 解 离 度 增大 ， 不 存 在 快 、 慢 离 子 之 分 ，蛋 白 质 样 品 在 均 一 电 场 强 度 和pH条 件 下 泳 动 。l由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。 缓 冲 液浓 缩 胶分 离 胶 C.分子筛效应l分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的 泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 缓 冲 液浓 缩 胶分 离 胶