《过氧化物酶》PPT课件

2021-5-2 实 验 二 过 氧 化 物 酶 活 性 的 测 定 2021-5-2 一 、 实 验 目 的一 、 实 验 目 的一 、 实 验 目 的1.学 习 红 薯 过 氧 化 物 酶 的 制 备 方法 。2.掌 握 过 氧 化 物 酶 的 反 应 原 理 及测 定 方 法 。 2021-5-2 二 、 实 验 原 理二 、 实 验 原 理二 、 实 验 原 理 1、 过 氧 化 物 酶 （ 简 称 POD)简 介 过 氧 化 物 酶 广 泛 存 在 于 植 物 体 中 ， 是 活 性较 高 的 一 种 酶 。 它 与 呼 吸 作 用 、 光 合 作 用 及 生长 素 的 氧 化 等 都 有 关 系 。 在 植 物 生 长 发 育 过 程中 它 的 活 性 不 断 发 生 变 化 。 一 般 老 化 组 织 中 活性 较 高 ， 幼 嫩 组 织 中 活 性 较 弱 。 这 是 因 为 过 氧化 物 酶 能 使 组 织 中 所 含 的 某 些 碳 水 化 合 物 转 化成 木 质 素 ， 增 加 木 质 化 程 度 ， 而 且 发 现 早 衰 减产 的 水 稻 根 系 中 过 氧 化 物 酶 的 活 性 增 加 ， 所 以过 氧 化 物 酶 可 作 为 组 织 老 化 的 一 种 生 理 指 标 。此 外 ， 过 氧 化 物 同 工 酶 在 遗 传 育 种 中 的 重 要 作用 也 正 在 受 到 重 视 。 2021-5-2 2 酶 活 力 测 定 (1) 酶 活 力 表 示 酶 量 的 多 少 不 能 像 一 般 物 质 那 样 ， 用 重 量(g)或 体 积 (ml)。 因 为 酶 是 一 种 生 物 催 化 剂 。 酶的 存 在 和 含 量 多 少 应 体 现 在 催 化 能 力 大 小 ， 即用 酶 活 力 (活 性 )表 示 。 酶 活 力 （ 酶 活 性 ） 指 酶 催 化 某 一 特 定 化 学 反 应的 能 力 。 催 化 能 力 强 (大 )， 酶 活 力 就 高 (大 )，也 表 示 酶 量 多 。 酶 本 身 的 重 量 不 能 说 明 酶 的 实际 含 量 多 少 。 同 样 重 量 的 酶 ， 酶 活 力 可 以 不 同 ，活 力 高 ， 价 值 就 大 。 2021-5-2 (2) 酶 促 反 应 速 度 酶 活 力 具 体 用 它 所 催 化 的 某 一 化 学 反 应 的 反 应 速度 来 表 示 ， 即 在 最 适 条 件 下 (最 适 pH、 最 适 T) 酶催 化 的 反 应 速 度 愈 快 ， 酶 活 力 就 愈 高 。 速 度 愈 墁 ，酶 的 活 力 就 愈 低 。 所 以 测 定 酶 的 活 力 (实 质 上 就 是酶 的 定 量 )测 定 就 是 测 定 酶 促 反 应 的 速 度 (用 v表示 ) 。 酶 促 反 应 速 度 可 用 单 位 时 间 内 、 单 位 体 积 中 底 物的 减 少 量 或 产 物 增 加 量 来 表 示 。 单 位 ： 浓 度 /单 位时 间 常 用 产 物 增 加 量 表 示 ， 因 为 它 从 无 到 有 ， 变 化 明显 。 酶 促 反 应 随 时 间 增 加 ， 产 物 增 加 。 2021-5-2 若 将 产 物 浓 度 对 反 应 时 间 作 图 得 到 酶 促 反 应若 将 产 物 浓 度 对 反 应 时 间 作 图 得 到 酶 促 反 应若 将 产 物 浓 度 对 反 应 时 间 作 图 得 到 酶 促 反 应的 速 度 曲 线 。的 速 度 曲 线 。的 速 度 曲 线 。 Vmax时 间产物的生成量 斜 率 浓 度 /时 间 V 2021-5-2 从 图 可 知 ， 反 应 速 度 只 在 最 初 一 段 时 间 内 保持 恒 定 ， 随 着 反 应 时 间 的 延 长 ， 酶 反 应 速 度逐 渐 下 降 。 引 起 下 降 的 原 因 很 多 ， 如 底 物 浓度 降 低 ， 产 物 浓 度 增 加 而 加 速 了 逆 反 应 的 进行 ， 产 物 对 酶 有 抑 制 作 用 等 。 因 此 研 究 酶 反应 速 度 以 酶 促 反 应 的 初 速 度 为 准 ， 即 酶 促 反应 最 初 的 一 段 时 间 ， 产 物 呈 线 性 增 加 时 的 反应 速 度 。 具 体 指 酶 促 反 应 速 度 曲 线 的 斜 率 。即 从 原 点 对 曲 线 作 切 线 ， 求 切 线 斜 率 ( v ) = 浓 度 / 时 间 2021-5-2 由 于 产 物 从 无 到 有 ， 只 要 方 法 灵 敏 ， 可准 确 测 定 。 测 定 产 物 增 加 量 的 方 法 很 多 ： 化 学 方 法 ： 滴 定 、 比 色 、 气 体 测 压 、 电化 学 等 。 物 理 方 法 ： UV吸 收 、 荧 光 等 。 同 位 素 方 法 等 。 2021-5-2 (3) 酶 的 活 力 单 位 表 示 酶 活 力 大 小 ， 也 就 是 酶 量 的 大 小 的 单 位称 酶 的 活 力 单 位 (U)。 国 际 单 位 (IU)定 义 ： 1个 酶 活 力 单 位 ， 是 指在 特 定 条 件 下 ， 在 1分 钟 内 能 转 化 1微 摩 尔( mol)底 物 的 酶 量 ， 或 是 转 化 1微 摩 尔 底 物中 的 有 关 基 团 的 酶 量 。 2021-5-2 3、 测 定 原 理 过 氧 化 物 酶 催 化 过 氧 化 氢 氧 化 酚 类 的 反应 ， 产 物 为 醌 类 化 合 物 ， 此 化 合 物 进 一 步缩 合 或 与 其 他 分 子 缩 合 ， 产 生 颜 色 较 深 的化 合 物 。 本 实 验 以 邻 甲 氧 基 苯 酚 （ 即 愈 创木 酚 ） 为 过 氧 化 物 酶 的 底 物 ， 在 此 酶 存 在下 ， H2O2可 将 邻 甲 氧 基 苯 酚 氧 化 成 红 棕 色的 4-邻 甲 氧 基 苯 酚 ， 其 反 应 为 ： 2021-5-2本 实 验 用 紫 外 吸 收 法 测 定 产 物本 实 验 用 紫 外 吸 收 法 测 定 产 物本 实 验 用 紫 外 吸 收 法 测 定 产 物 4 邻 甲 氧 基 苯 酚 在 邻 甲 氧 基 苯 酚 在 邻 甲 氧 基 苯 酚 在 470nm光 吸 收 增 加 值 表 示 产 物 增 加 量 ， 划 出 光 吸 收光 吸 收 增 加 值 表 示 产 物 增 加 量 ， 划 出 光 吸 收光 吸 收 增 加 值 表 示 产 物 增 加 量 ， 划 出 光 吸 收 - 时 间 的 速时 间 的 速时 间 的 速度 曲 线 ， 求 出 曲 线 的 斜 率 ， 即 酶 促 反 应 初 速 度 ， 再 换 算度 曲 线 ， 求 出 曲 线 的 斜 率 ， 即 酶 促 反 应 初 速 度 ， 再 换 算度 曲 线 ， 求 出 曲 线 的 斜 率 ， 即 酶 促 反 应 初 速 度 ， 再 换 算为 酶 活 力 。为 酶 活 力 。为 酶 活 力 。 4 2021-5-2 21 3 4 5 6 7 800 2 4 6 8反 应 时 间 （ 分 钟 ）生成物光吸收 0.400.300.200.10 2021-5-2 2. pH对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响(1) 影 响 酶 促 反 应 速 度 的 因 素* 底 物 浓 度 米 氏 公 式* 温 度* 酶 浓 度* 激 活 剂 、 抑 制 剂* pH 2021-5-2 (2) pH对 酶 促 反 应 速 度 的 影 响 大 多 数 酶 的 活 力 受 其 环 境 pH影 响 。 这 是 因为 pH影 响 底 物 分 子 和 酶 分 子 中 一 些 基 团 的解 离 ， 这 些 基 团 的 离 子 化 状 态 关 系 到 底 物与 酶 的 结 合 、 酶 的 专 一 性 和 酶 活 性 中 心 的构 象 。 通 常 各 种 酶 只 有 在 一 定 pH范 围 内 才具 有 活 性 ， 并 在 一 定 pH下 ， 酶 促 反 应 具 有最 大 反 应 速 度 ， 此 pH称 最 适 pH， 高 于 或 低于 此 值 反 应 速 度 都 下 降 。 2021-5-2 如 将 反 应 速 度 对 pH作 曲 线 ， 典 型 的 呈 钟 罩形 ， 但 不 同 酶 受 pH影 响 是 不 同 ， 所 以 会 有不 同 形 状 ， 有 的 只 有 钟 罩 形 的 一 半 ， 有 的 则是 一 直 线 ， 即 受 pH影 响 不 大 。 2021-5-2 木 瓜 蛋 白 酶胃 蛋 白 酶 胆 碱 脂 酶 2021-5-2 不 同 酶 的 最 适 pH也 不 同 ， 如 胃 蛋 白 酶 为 pH 1.5 - 2.5、 胰 蛋 白 酶 为 pH 8。 但 应 注 意 最 适pH不 是 特 征 常 数 ， 对 于 同 一 种 酶 ， 其 最 适pH因 底 物 的 种 类 、 浓 度 及 缓 冲 液 成 份 不 同而 有 差 异 ， 因 此 酶 的 最 适 pH并 不 是 一 个 常数 ， 只 是 在 一 定 条 件 下 才 有 意 义 。 一 般 最适 pH在 6 - 8之 间 。 由 于 酶 活 力 受 pH影 响 很 大 ， 因 此 在 测 定 酶活 力 时 ， pH必 须 恒 定 ， 所 以 测 活 反 应 最 好在 缓 冲 液 体 系 中 进 行 。 2021-5-2 本 实 验 测 定 三 亇 不 同 pH下 过 氧 化 物 酶 的时 间 光 吸 收 关 系 曲 线 ， 比 较 三 亇 不 同pH ( 6.0,7.0,8.0)条 件 对 过 氧 化 物 酶 活 力 的影 响 。 2021-5-2 三 、 实 验 操 作三 、 实 验 操 作三 、 实 验 操 作1、 过 氧 化 物 酶 粗 品 液 的 制 备 称 取 红 薯 材 料 1g， 加 少 许 石 英 砂 及0.1mol/LpH=6.0磷 酸 缓 冲 液 （ 2ml左 右 ) ，于 研 钵 中 研 磨 成 匀 浆 。 再 加 入 3ml磷 酸 缓 冲 液 浸 提 20分 钟 后 ， 以6000r/min离 心 15分 钟 。 倾 出 上 清 液 并 过 滤 ， 然 后 转 入 10ml容 量 瓶定 容 ， 摇 匀 后 ， 贮 于 冷 处 备 用 。 2021-5-2 2、 酶 活 力 测 定 (1)取 1只 比 色 杯 洗 净 控 干 ， 按 以 下 步 骤 操 作 ： 用 移 液 管 吸 取 0.1 mol/L反 应 液 (pH 6.0) 2.9mL 加 入 比 色 杯 中 。 放 入 紫 外 分 光 光 度 计 比 色 杯 架 内 ， 按 auto zero，出 现 插 入 空 白 ， 按 ok， 仪 器 自 动 调 零 。 调 零 完成 后 按 start， 出 现 插 入 样 品 。 (2)取 出 比 色 杯 ， 1人 加 酶 液 (L)， 先 加 20 L ，另 1人 同 时 按 ok开 始 计 时 ， 加 酶 后 盖 上 硫 酸 纸 ，按 紧 混 匀 ， 30秒 内 放 入 比 色 杯 架 内 ， 仪 器 每 30秒 自 动 记 录 光 吸 收 值 A470nm。 (3)按 数 据 处 理 中 的 数 据 打 印 ， 显 示 8个 数 据 ，记 录 数 据 。 2021-5-2 (4)操 作 要 点 ： * 关 键 是 酶 稀 释 的 倍 数 和 酶 量 多 少 要 合 适 ，使 A470nm在 0.20.4/min， 即 第 1个 30秒A470nm在 0.1- 0.2。 过 低 过 高 都 应 增 加 或 减少 酶 量 重 新 做 。 * 加 酶 后 应 迅 速 摇 匀 ， 立 即 计 算 时 间 ， 2人要 配 合 好 ， 计 时 不 能 提 前 或 推 后 ， 否 则 曲线 不 是 从 原 点 开 始 。 * 每 次 测 定 前 务 必 洗 净 比 色 杯 ， 用 去 离 子 水冲 洗 5遍 以 上 ， 保 证 不 残 留 上 次 的 溶 液 ， 否则 影 响 测 定 。 2021-5-2 四四四 . 数 据 处 理数 据 处 理数 据 处 理 1. 用 坐 标 纸 作 出 时 间 A470nm曲 线 ， 过 原点 在 直 线 部 分 作 切 线 ， 求 斜 率 A470nm /min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 时 间 /min 10.80.60.40.2A 470nm 2021-5-2 2. 代 入 下 式 计 算 酶 活 力 A470nm /minVPOD活 力 单 位 （ mol/min） = L A470nm /min3 mL = 26.6 mL/ mol cmcm A470nm 3 = (mol/min) 26.6 V 反 应 液 体 积 ( mL ) 产 物 4邻 甲 氧 基 苯 酚 的 摩 尔 消 光 系 数 26.6 L/ mmolcm 即 26.6 mL/ molcm) L 比 色 杯 光 径 (1cm) 2021-5-2 实 验 三实 验 三实 验 三 POD蛋 白 浓 度 测 定 和 比 活 力 计 算 2021-5-2 一一一 .实 验 目 的实 验 目 的实 验 目 的 1.学 习 Folin酚 法 （ Lowry法 ） 测定 POD蛋 白 浓 度 的 原 理 和 方 法 2.掌 握 比 活 力 计 算 方 法 2021-5-2 二二二 .实 验 原 理实 验 原 理实 验 原 理1 Folin酚 法 原 理 Folin酚 试 剂 由 两 种 试 剂 组 成 ： 甲 试 剂 ： 双 缩 脲 试 剂 尿 素 加 热 至 180 左 右 ， 两 分 子 尿 素 缩合 放 出 一 分 子 氨 ， 而 形 成 双 缩 脲 。 2021-5-2 NH2 NH2 C = O C = O NH2 180 NH + NH3 NH2 C = O C = O NH2 NH 2 2021-5-2 双 缩 脲 在 碱 性 溶 液 中 与 铜 离 子 （ 酒石 酸 钾 钠 -CuSO4） 络 合 生 成 复 杂的 紫 红 色 化 合 物 。 蛋 白 质 分 子 中 的 肽 键 （ CONH） 与 双 缩 脲 结 构 相 似 ， 也 有双 缩 脲 反 应 ， 其 颜 色 深 浅 与 蛋 白 质的 含 量 成 正 比 ， 因 此 所 有 蛋 白 质 或二 肽 以 上 的 多 肽 都 有 双 缩 脲 反 应 ，可 用 作 蛋 白 质 定 性 、 定 量 分 析 。 2021-5-2 甲 试 剂 实 质 是 利 用 蛋 白 质 中 肽键 反 应 进 行 定 量 测 定 ， 它 与 蛋白 质 分 子 量 及 氨 基 酸 组 成 无 关 ，即 受 蛋 白 质 氨 基 酸 的 特 异 性 影响 较 少 。 但 灵 敏 度 较 低 ， mg级水 平 ， 010 mg/mL作 标 准 曲 线 。 2021-5-2 乙 试 剂 ： 主 要 起 作 用 是 磷 钼 酸 （ 磷 钨 酸 ） ， 它 由 钼 酸 钠（ 钨 酸 钠 ） 在 酸 性 （ 磷 酸 等 ） 作 用 下 产 生 。 钼 酸 钠 （ 钨 酸 钠 ） HCl 碱 性 H3PO4 + 钼 酸 （ 钨 酸 ） 磷 钼 酸 钼 兰 （ 钨 兰 ） （ 磷 钨 酸 ） 还 原 剂 2021-5-2 H3PO4 + 12H2MoO4 H3Mo12PO40 + 12H2O 碱 性 还 原 剂 Mo2O3MoO3 兰 色 2021-5-2 Folin酚 试 剂 最 初 由 Folin等 于 1912年提 出 ， 当 时 只 有 乙 试 剂 应 用 于 酚 类测 定 ， 以 后 才 用 于 蛋 白 质 测 定 。 因为 Tyr的 酚 基 也 能 起 还 原 剂 作 用 ， 呈兰 色 反 应 ， 因 而 被 利 用 于 测 定 蛋 白质 ， 产 物 颜 色 深 浅 与 被 测 蛋 白 质 含量 成 正 比 关 系 ， 所 以 乙 试 剂 作 用 是利 用 蛋 白 质 中 Tyr、 Try、 Cys等 具 有还 原 性 的 氨 基 酸 残 基 的 作 用 进 行 测定 ， 灵 敏 度 高 ， 但 是 后 来 发 现 有 些缺 点 ， 出 现 不 少 改 良 方 法 。 2021-5-2 1951年 Lowry（ 劳 里 ） 在 Folin酚 试 剂 中 引 入 双 缩 脲 反 应 （ 加 入 甲 试 剂 ） 即 成为 如 今 广 泛 被 使 用 的 Lowry法 。 为 什 么 要 作 这 样 改 良 ？ Folin酚 试 剂 中 只 有 乙 试 剂 ， 依 赖 蛋 白 质中 Tyr、 Trp等 氨 基 酸 残 基 的 反 应 ， 而 对于 不 同 种 类 蛋 白 质 ， 由 于 它 们 之 间 的 氨基 酸 组 成 不 同 ， 在 呈 色 反 应 中 就 会 有 差异 ， 影 响 实 验 准 确 度 ， 即 受 蛋 白 质 特 性影 响 较 大 ， 而 双 缩 脲 试 剂 是 利 用 肽 键 反应 ， 不 受 氨 基 酸 组 成 的 影 响 。 2021-5-2 引 入 双 缩 脲 试 剂 后 ， 具 有 两 种 试 剂 双 重作 用 ， 互 相 补 充 ， 结 果 大 大 增 加 了 反应 的 灵 敏 度 和 准 确 度 。 Lowry法 较 双 缩脲 灵 敏 度 提 高 100倍 ， 较 UV法 灵 敏1020倍 。 Folin酚 （ Lowry） 法 ， 灵 敏 度 高 ， 操作 简 单 ， 迅 速 ， 不 需 要 特 殊 仪 器 ， 常用 作 蛋 白 质 定 量 测 定 ， 文 献 引 用 最 多 。 2021-5-2 方 法 灵 敏 度 时 间 原 理 干 扰 物 质 说 明凯 氏 定 氮 法（ Kjedahl法 ） 灵 敏 度 低 ， 适用 于 0.21.0mg/ml氮 ， 误 差 为 2 费 时 8 10小 时 蛋 白 质 （ 平 均 含 氮量 16 ） 经 过 硫 酸消 化 ， 强 碱 碱 化 ，吸 收 并 滴 定 ， 准 确测 定 氮 量 非 蛋 白 氮 （ 可 用三 氯 乙 酸 沉 淀 蛋白 质 而 分 离 ） 用 于 标 准 蛋 白 质含 量 的 准 确 测定 ； 干 扰 少 ； 费时 太 长双 缩 脲 法（ Biuret法 ） 灵 敏 度 低310nm比 色0.1 1.0mg/ml540nm比 色1 10mg/ml 中 速 2030分 钟 多 肽 键 碱 性Cu2 紫 色 络 合物 硫 酸 铵 ；Tris缓 冲 液 ；某 些 氨 基 酸 用 于 快 速 测 定 ，但 不 太 灵 敏 ； 不同 蛋 白 质 显 色 相似紫 外 吸 收 法 较 为 灵 敏0.1 1.0mg/ml 快 速 5 10分 钟 蛋 白 质 中 的 酪 氨 酸和 色 氨 酸 残 基 在280nm处 的 光 吸 收 各 种 嘌 吟 和 嘧啶 ； 各 种 核 苷 酸 用 于 层 析 柱 流 出液 的 检 测 ； 核 酸的 吸 收 可 以 校 正 Folin 酚 试 剂法 （ Lowry法 ） 灵 敏 度 高0.03 5g 慢 速 40 60分 钟 双 缩 脲 反 应 ； 磷 钼酸 磷 钨 酸 试 剂 被Tyr和 Phe还 原 硫 酸 铵 ；Tris缓 冲 液 ；甘 氨 酸 ；各 种 硫 醇 耗 费 时 间 长 ； 操作 要 严 格 计 时 ；颜 色 深 浅 随 不 同蛋 白 质 变 化考 马 斯 亮 蓝 法(Bradford法 ) 灵 敏 度 最 高1 5g 快 速5 15分 钟 考 马 斯 亮 蓝 染 料 与蛋 白 质 结 合 时 ， 其max由 465nm变为 595nm 强 碱 性 缓 冲 液 ；TritonX-100;SDS 最 好 的 方 法 ； 干 扰 物 质 少 ； 颜 色 稳 定 ； 颜 色 深 浅 随 不 同蛋 白 质 变 化 2、 蛋 白 质 的 定 量 测 定 2021-5-2 3.比 活 力 概 念 比 较 不 同 重 量 或 不 同 蛋 白 含 量 的 酶 活 力 并 无 实 际意 义 ， 不 同 酶 或 同 一 种 酶 在 不 同 情 况 下 的 比 较 应有 一 个 重 量 标 准 ， 于 是 产 生 出 另 一 个 酶 的 重 要 参数 比 活 力 。 比 活 力 指 单 位 质 量 的 酶 蛋 白 所 具 有 的 酶 活 力 单 位 酶 活 力 单 位 / mg酶 蛋 白 ( IU / mg酶 蛋白 ) 比 活 力 是 酶 学 研 究 及 酶 制 剂 生 产 制 备 中 经 常 使 用的 数 据 ， 用 来 比 较 单 位 重 量 酶 蛋 白 的 催 化 能 力 ( 即酶 活 力 大 小 )。 2021-5-2 比 活 力 实 际 意 义 可 以 说 明 酶 的 质 量 好 坏 ， 纯 度 高低 。 不 同 酶 比 较 时 ， 比 活 力 高 ， 说 明 其 质 量 好 ，纯 度 高 ； 对 同 一 种 酶 ， 可 以 比 较 不 同 批 次 的 质 量和 纯 度 。 在 酶 的 生 产 制 备 过 程 ， 考 察 比 活 力 尤 为重 要 ， 随 着 该 酶 不 断 被 提 纯 ， 它 的 比 活 力 升 高 ，说 明 酶 逐 步 被 纯 化 ， 比 如 ， 粗 制 品 总 活 力 很 高 ，蛋 白 质 含 量 也 很 高 (杂 蛋 白 多 )， 比 活 力 低 。 纯 化 后虽 然 总 活 力 降 低 ， 但 蛋 白 质 含 量 也 因 大 量 杂 蛋 白被 除 去 而 减 少 ， 使 比 活 力 升 高 。 酶 愈 纯 ， 比 活 力愈 高 ， 比 活 力 不 再 升 高 ， 酶 就 相 当 纯 了 ， 因 此 比活 力 用 以 衡 量 生 产 工 艺 优 劣 、 生 产 效 率 高 低 。 它是 一 个 很 有 实 际 用 途 的 参 数 ， 是 经 常 要 测 定 的 数据 。 2021-5-2 三 、 操 作 步 骤每 人 取 16支 试 管 ， 按 下 表 平 行 操 作 ：1 2 3 4 5 6 7 8标 准 蛋 白 质 溶 液 /mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 待 测 蛋 白 质 溶 液 /mL 0.03 0.05dH2O/mL 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.47 0.45甲 试 剂 /mL 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5混 匀 ， 于 室 温 放 置 10min 乙 试 剂 /mL 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25迅 速 混 匀 ， 室 温 放 置 30min后 ， 以 dH 2O为 空 白 ， 在 640nm处 比 色 A640nm(1) A640nm (2) A640nm 2021-5-2 * 标 准 蛋 白 质 溶 液 为 牛 血 清 清 蛋 白 ( 150g/mL )。* 侍 测 样 品 x为 POD酶 原 液 ， 轻 轻 倒 置 摇 匀 后用 注 射 器 加 50L(0.050 mL)， 去 离 子 水 加0.450 mL。 2021-5-2 2.注 意 事 项 ：* 定 量 测 定 要 求 各 种 试 剂 量 取 准 确 ， 正 确 规 范 使用 移 液 管 。* 乙 试 剂 在 酸 性 条 件 下 稳 定 ， 而 甲 试 剂 在 碱 性 条件 下 与 蛋 白 质 反 应 ， 生 成 碱 性 的 铜 -蛋 白 质 络合 物 溶 液 ， 所 以 在 加 入 乙 试 剂 后 ， 应 迅 速 摇 匀(用 振 荡 器 )， 使 还 原 反 应 发 生 在 磷 钼 酸 -磷 钨 酸试 剂 被 破 坏 之 前 。 加 一 管 摇 一 管 ， 直 接 取0.25mL吹 下 ， 二 人 可 合 作 ， 乙 试 剂 比 重 大 ， 一定 要 摇 起 来 。* 待 测 样 品 所 取 体 积 应 使 其 浓 度 在 标 准 曲 线 范 围内 。 2021-5-2 四四四 . 数 据 处 理数 据 处 理数 据 处 理1. 制 作 标 准 曲 线以 标 准 蛋 白 质 含 量 ( 15,30,45,60,75g )作 横 座 标 ， 每 管 减 空 白 的 光 吸 收 值(A640nm) 作 纵 座 标 ， 过 原 点 作 直 线 。 2021-5-2 2. 计 算 样 品 (POD)蛋 白 质 浓 度 根 据 7号 待 测 样 品 管 光 吸 收 值 从 曲 线 上 查 出对 应 的 蛋 白 质 含 量 代 入 下 式 ： 7号 样 品 对 应 蛋 白 质 含 量 ( g ) 103C POD ( mg/mL ) = 样 品 体 积 ( 0.050 mL ) 2021-5-2 3. 计 算 比 活 力 POD比 活 力 （ mol/min/mg蛋 白 质 ） 酶 活 力 单 位 = 酶 活 力 测 定 所 用 酶 蛋 白 量 酶 活 力 单 位 ( IU ) = C POD( mg/mL ) (0.020 0.200)mL 2021-5-2 注 意 ： 用 Folin酚 法 测 出 的 是 酶 原液 蛋 白 质 浓 度 （ mg/mL） ， 而 计算 比 活 力 时 所 用 酶 蛋 白 量 应 是 酶 原液 蛋 白 质 浓 度 （ mg/mL） 实 际测 定 时 用 的 该 酶 体(0.0200.200)mL