食品质量安全检测新技术

食 品 质 量 安 全 检 测 新 技 术讲 课 教 师 ： 谢 远 红 课 程 主 要 内 容一 .现 阶 段 存 在 的 食 品 质 量 安 全 问 题二 .食 品 质 量 安 全 问 题 中 检 测 技 术 一 . 现 阶 段 存 在 的 食 品 质 量 安 全 问 题1. 转 基 因 食 品 的 安 全 性2. 食 源 微 生 物 的 安 全 性3. 生 物 毒 素 的 安 全 性4. 食 品 原 料 中 农 药 、 兽 药 残 留 的 安 全 性5. 抗 生 素 、 激 素 与 有 害 物 质 残 留 转 基 因 食 品 的 安 全 性转 基 因 食 品 的 概 念“ 转 基 因 ” 是 指 利 用 分 子 生 物 学 手 段 将 外源 性 基 因 转 移 到 某 种 特 定 生 物 体 中 ， 使 其生 物 性 状 或 机 能 发 生 部 分 改 变 。 转 基 因 食 品 （ genetically modified foods, GM食 品 ） ： 就 是 以 转 基 因 生 物 体 直 接 作 为食 品 或 以 其 为 原 料 加 工 生 产 的 食 品 。 转 基 因 食 品 的 发 展 史n 转 基 因 食 品 的 发 展 历 史 实 际 上 就 是 基 因 工 程 、 转基 因 技 术 等 生 物 技 术 的 发 展 史 。 n 1982年 ， 将 大 鼠 生 长 激 素 重 组 基 因 导 入 小 鼠 受 精原 核 内 ， 获 得 了 人 类 历 史 上 第 一 个 转 基 因 动 物 转 基 因 “ 超 级 鼠 ” ， 比 一 般 的 小 白 鼠 大 一 倍 。 n 1983年 ， 世 界 上 第 一 例 转 基 因 植 物 （ 一 种 含 有 抗生 素 药 类 抗 体 的 烟 草 ） 在 美 国 成 功 培 植 。 n 1994年 ， 孟 山 都 (Monsanto)公 司 下 属 Calgene公 司研 制 的 延 熟 保 鲜 转 基 因 番 茄 在 美 国 批 准 上 市 ， 这是 发 达 国 家 批 准 商 业 化 的 第 一 个 转 基 因 作 物 。 转 基 因 棉 花 中 国 的 转 基 因 羊 日 本 研 发 的 转 基 因 大 豆 各 种 各 样 的 转 基 因 水 果 浙 江 省 种 植 的 转 基 因 油 菜 自 1996年 ， 转 基 因 农 作 物 获 得 批 准 进 入 田 间试 验 以 来 ， 全 球 转 基 因 作 物 研 发 和 产 业 迅 猛 发 展 ，创 造 了 巨 大 的 经 济 、 社 会 和 生 态 效 应 。 从 此 ， 世界 上 陆 续 有 国 家 批 准 转 基 因 作 物 的 种 植 ， 转 基 因作 物 的 种 植 面 积 、 种 类 以 及 商 业 效 应 更 是 逐 年 攀升 ， 这 就 是 转 基 因 作 物 的 商 业 化 种 植 。 自 1996年转 基 因 作 物 首 次 商 业 化 以 来 ， 转 基 因 作 物 面 积 累计 达 到 近 10亿 公 顷 ， 增 长 了 80倍 。 n 转 基 因 农 作 物 的 种 植 是 现 代 农 业 发 展 的 重 要 手 段 和 重 要 领域 。 2010年 国 际 农 业 生 物 技 术 应 用 组 织 服 务 （ ISAAA）在 北 京 发 表 2009年 度 全 球 生 物 技 术 /转 基 因 作 物 商 业 化 发展 态 势 报 告 ， 认 为 全 球 第 二 轮 生 物 技 术 发 展 浪 潮 已 经 开 始 。ISAAA报 告 认 为 ， 去 年 全 球 生 物 技 术 发 展 一 个 最 显 著 的 进步 是 中 国 一 项 里 程 式 的 决 策 转 基 因 抗 虫 水 稻 和 植 酸 玉米 获 得 生 物 安 全 发 展 证 书 。 水 稻 和 玉 米 分 别 是 世 界 上 最 重要 的 粮 食 作 物 和 饲 料 作 物 ， 因 此 ， 对 二 者 的 生 物 安 全 的 认证 对 未 来 转 基 因 作 物 在 中 国 、 亚 洲 乃 至 全 世 界 的 推 广 有 巨大 的 影 响 。 n ISAAA报 告 显 示 ， 去 年 25个 国 家 的 1400万 农 民 种 植 了 1.34亿 公 顷 转 基 因 作 物 ， 面积 较 上 一 年 增 长 了 7%， 其 中 90%来 自 发展 中 国 家 的 小 型 农 户 。 性 状 面 积 或 “ 实 际面 积 ” 达 到 1.8亿 公 顷 ， 比 2008年 增 长 了1400万 公 顷 。n 美 国 （ 6400万 公 顷 ） 、 巴 西 （ 2140万 公顷 ） 、 阿 根 廷 （ 2130万 公 顷 ） 分 列 转 基 因作 物 种 植 面 积 的 前 三 位 ， 中 国 （ 370万 公顷 ） 列 第 六 位 。 n 截 止 2008年 底 ， 我 国 已 经 批 准 22 种 国 外 转 基 因作 物 进 口 许 可 证 ， 分 别 是 转 基 因 大 豆 GTS-40-3-2， 转 基 因 玉 米 （ Mon810， Bt11， Bt176，Mon863， NK603， GA21， T25，MON59122， TC1507， MON88017） ， 转 基因 油 菜 （ Ms1Rf1、 Ms1Rf2、 Ms8Rf3、 GT73、T45、 Oxy235、 Tapos19/12） 和 转 基 因 棉 花（ Mon531、 Mon1445、 Mon15985、Mon88913） 。 n 20012008 年 ， 中 国 进 口 转 基 因 大 豆 累计 超 过 2 亿 吨 。 在 中 国 市 场 上 70%的 大 豆制 品 中 含 有 转 基 因 成 分 ， 像 大 豆 油 、 色 拉油 、 磷 脂 、 酱 油 、 膨 化 食 品 等 等 ， 进 入 中国 消 费 者 的 生 活 转 基 因 食 品 主 要 是 使 用 转基 因 大 豆 加 工 的 食 用 油 和 豆 制 品 。 另 外 在市 场 上 发 现 转 基 因 米 粉 、 饼 干 、 咖 啡 等 ，中 国 正 在 接 受 更 多 的 国 外 转 基 因 食 品 。羞 羞 答 答 的 转 基 因 大 豆 油 转 基 因 植 物 的 构 建 策 略作 物 转 入 的 外 源 基 因 的 类 型 及 方 法n 类 型 ： 转 基 因 作 物 涉 及 的 遗 传 改 良 性 状 主 要 包 括 ： 抗 除 草剂 基 因 占 总 面 积 的 71%， 抗 虫 基 因 占 28%， 抗 病 毒 基 因 占1%。n 方 法 ： 农 杆 菌 介 导 法 ： 农 杆 菌 中 有 一 种 致 瘤 的 环 型 DNA，称 为 Ti质 粒 。 被 农 杆 菌 感 染 的 植 物 之 所 以 长 瘤 正 是 由 于TDNA插 入 了 植 物 染 色 体 。 从 此 ， 人 们 便 利 用 这 种 天 然的 转 化 体 系 向 植 物 转 基 因 。 基 因 枪 ： 把 所 要 转 入 的 基 因 包被 在 金 粉 或 钨 粉 上 之 后 ， 利 用 基 因 枪 将 其 打 入 培 养 细 胞 中来 完 成 转 基 因 过 程 。 转 基 因 大 豆转 基 因 大 豆 的 研 究 主 要 以 耐 除 草 剂 和 改 善 大 豆 品 质 为 主 ：n 耐 除 草 剂 ： 在 美 国 有 3个 转 基 因 大 豆 品 种 已 应 用 ， 最 多 的是 对 除 草 剂 草 丁 膦 和 草 甘 膦 具 有 耐 性 的 个 品 种 。 2002年种 植 面 积 占 美 国 大 豆 的 74%。 可 见 ， 目 前 美 国 的 大 豆 生 产已 经 基 本 上 普 及 了 耐 除 草 剂 的 转 基 因 品 种 。 n 改 善 大 豆 成 分 ： Mazur等 (1999) 获 得 了 种 子 油 酸 相 对 含 量高 达 85%的 大 豆 新 品 系 ， 而 且 农 艺 性 状 优 良 。 转 基 因 玉 米转 基 因 玉 米 的 研 究 主 要 集 中 于 提 高 抗 虫 性 和 耐 除 草 剂 方 面 。n 在 美 国 ， 转 基 因 玉 米 的 种 植 面 积 占 玉 米 总 种 植 面 积 的 比 例在 35%左 右 。n 其 中 抗 虫 Bt玉 米 的 种 植 面 积 发 展 最 快 ， 所 占 近 比 例 最 大 ，2002年 约 占 玉 米 种 植 总 面 积 的 24 ； 耐 除 草 剂 玉 米 占 7 10 之 间 ； 兼 具 抗 虫 和 耐 除 草 剂 特 性 的 转 基 因 玉 米 品种 种 植 规 模 仍 然 不 大 ， 近 年 来 仅 占 玉 米 种 植 总 面 积 的 1 -2 。 转 基 因 水 稻 转 基 因 水 稻 的 研 究 主 要 集 中 在 以 下 三 个 方 面 ：n 提 高 光 合 效 率 ： 将 C4作 物 玉 米 的 PEPC基 因 导 入 水 稻 的 基因 组 ， 从 而 改 良 了 水 稻 的 光 合 作 用 效 率 。n 提 高 营 养 品 质 ： Ye等 （ 2000） 成 功 地 将 来 自 其 他 物 种 的psy、 cntl和 lcy基 因 整 合 到 水 稻 基 因 组 中 ， 解 决 了 水 稻 胚 乳不 能 合 成 维 生 素 A的 难 题 。 n 增 加 抗 逆 性 ： 纽 约 康 乃 尔 大 学 的 加 戈 等 将 大 肠 杆 菌 中 两 种负 责 合 成 海 藻 糖 的 基 因 导 入 到 籼 稻 中 。 转 基 因 水 稻 在 恶 劣环 境 条 件 下 的 生 存 能 力 比 普 通 水 稻 更 强 。 n 到 底 我 国 目 前 有 多 少 转 基 因 食 品 ？ 已 经 超 过 2000万 吨 。n 目 前 我 国 极 少 生 产 粮 食 、 油 料 作 物 等 转 基 因 食 品 ，只 有 一 些 转 基 因 抗 虫 棉 ， 但 并 不 进 入 人 的 食 物 链 。我 国 的 转 基 因 食 品 基 本 上 都 是 进 口 的 。n 排 在 前 三 位 的 是 ： 大 豆 、 玉 米 、 油 菜 。 我 国 去 年进 口 大 豆 3500万 吨 。 目 前 我 国 进 口 大 豆 主 要 用 做加 工 原 料 ， 生 产 豆 油 、 豆 腐 、 豆 奶 等 制 品 。 转 基 因 食 品 的 主 要 功 能1.改 善 食 品 品 质 和 加 工 特 性2.提 高 农 作 物 的 抗 病 虫 害 性 能3.提 高 果 蔬 产 品 的 耐 储 存 性 和 保 鲜 期4.改 善 发 酵 食 品 品 质 和 风 味5.改 良 动 物 性 食 品 品 质 转 基 因 作 物 的 利 与 弊 n 转 基 因 作 物 的 带 来 的 效 益 ISAAA报 告 认 为 ， 转 基 因 作 物 已 经 在 以 下 几 个 重 要 方 面 做 出了 贡 献 ：（ 1） 保 证 粮 食 安 全 ， 保 证 粮 食 价 格 的 稳 定 ， 解 决 发 展 中 国家 人 民 的 饥 饿 问 题 。 世 界 人 口 数 量 ， 特 别 在 发 展 中 国 家 ，还 在 持 续 增 长 ， 它 带 来 的 粮 食 短 缺 问 题 ， 也 就 成 为 了 一 个全 世 界 关 注 的 重 要 问 题 。 因 此 ， 通 过 基 因 工 程 技 术 ， 特 别是 转 基 因 技 术 ， 以 获 得 高 产 的 优 良 农 作 物 品 种 ， 可 能 将 是解 决 21世 纪 不 断 增 加 人 口 对 粮 食 需 求 的 重 要 途 径 之 一 。 （ 2） 创 造 了 明 显 的 可 观 的 经 济 效 益 。 转 基 因 农 作 物 的 发 展能 够 带 来 明 显 的 经 济 效 益 ， 如 加 拿 大 ， 在 1996年 种 植 了1200万 hm 耐 除 草 剂 油 菜 后 ， 产 量 提 高 9 ， 经 济 效 益达 600万 美 元 ； 中 国 种 植 转 基 因 抗 虫 棉 花 ， 从 19972000年 的 4年 ， 总 的 经 济 效 益 达 3 37亿 美 元 。 在 2000年 世 界 转 基 因 作 物 产 品 的 价 值 为 3O亿 美 元 ， 预 计 2010年时 价 值 可 达 800亿 美 元 。 由 此 可 见 ， 经 济 效 益 是 十 分 明 显的 。 转 基 因 食 品 的 安 全 性 1.未 进 行 较 长 时 间 的 安 全 性 试 验 ： 基 因 化 食 品 改 变 了 我 们 所食 用 食 品 的 自 然 属 性 ， 它 所 使 用 的 生 物 物 质 不 是 人 类 食 品安 全 提 供 的 部 份 ， 未 进 行 长 时 间 的 安 全 试 验 ， 无 法 确 定 这类 食 品 是 否 安 全 。 英 国 一 位 科 学 家 在 著 名 医 学 杂 志 柳 叶 刀 上 发 表 论 文 ， 宣 称 实 验 用的 大 鼠 在 食 用 转 基 因 马 铃 薯 以 后 ， 肝 脏 受 到 损 伤 ， 免 疫 系 统 受 到 削 弱 ， 由 此 掀 起 了 国 际 社 会 对 转 基 因 食 品 安 全 性 广 泛 争 论 的 序 幕 。对 人 类 健 康 产 生 的 安 全 性 问 题 2 产 生 毒 素 ： 基 因 化 食 品 能 产 生 不 可 预 见 的 生 物 突 变 ， 会 在食 品 中 产 生 较 高 水 平 和 新 的 毒 素 。 Losey,J.E.等 （ 1999）报 道 ， 在 一 种 植 物 马 利 筋 叶 片 上 撒 有 转 基 因 Bt玉 米 花 粉 后 ，普 累 克 西 普 斑 蝶 食 用 叶 片 就 少 ， 长 得 慢 ， 4天 的 幼 虫 的 死亡 率 44%。 而 对 照 组 （ 饲 喂 不 撒 Bt玉 米 花 粉 的 叶 片 ） 无 一死 亡 。 转 基 因 作 物 产 生 的 杀 虫 毒 素 可 由 根 部 渗 入 周 围 ， 但尚 不 清 楚 会 产 生 何 种 影 响 ， 是 否 会 对 人 类 的 健 康 产 生 影 响同 样 未 知 。 3 过 敏 或 变 态 反 应 ： 基 因 技 术 会 在 食 品 中 产 生 不 能 预 见的 和 未 知 的 变 态 反 应 原 。 据 报 告 ， 对 巴 西 坚 果 产 生 过敏 的 主 体 也 会 对 用 该 坚 果 基 因 工 程 化 而 得 到 的 大 豆 产生 过 敏 。 科 学 家 把 巴 西 胡 桃 的 特 性 移 植 到 黄 豆 上 去 ，结 果 却 使 一 些 对 胡 桃 过 敏 的 人 在 摄 取 黄 豆 时 有 过 敏 的可 能 。 植 物 凝 血 素 （ Lectin） 对 有 些 害 虫 来 说 是 有 毒 的 ，转 基 因 食 品 不 得 含 有 此 类 有 毒 物 质 。 4 减 少 食 品 的 营 养 价 值 或 降 解 食 品 中 重 要 的 成 份 ： 基 因 化 的目 的 是 去 除 或 灭 活 人 们 认 为 不 需 要 的 物 质 ， 这 些 物 质 可 能是 未 知 的 。 美 国 的 研 究 资 料 表 明 ， 在 具 有 抗 除 草 剂 基 因 的大 豆 中 ， 异 黄 酮 类 激 素 等 防 癌 的 成 份 减 少 了 。 具 有 芳 香 、有 光 泽 的 红 色 蕃 茄 能 贮 藏 几 周 ， 但 营 养 价 值 较 低 。 消 费 者在 购 买 水 果 或 蔬 菜 时 ， 仅 依 靠 外 观 和 质 地 ， 因 此 ， 不 能 准确 判 定 该 产 品 的 真 实 质 量 。 5 产 生 抗 菌 素 耐 药 性 细 菌 ： 基 因 技 术 采 用 耐 抗 菌 素 （ 如 抗 卡那 霉 素 、 氨 苄 青 霉 素 、 新 霉 素 、 链 霉 素 等 ） 基 因 来 标 识 转基 因 化 的 农 作 物 ， 这 就 意 味 着 农 作 物 带 有 耐 抗 菌 素 的 基 因 。荷 兰 科 学 家 发 表 在 新 科 学 家 杂 志 的 试 验 结 果 称 ， 设 计一 人 造 胃 ， 对 人 消 化 转 基 因 食 物 的 过 程 进 行 模 拟 ， 发 现DNA滞 留 在 肠 内 ， 同 时 一 些 转 基 因 细 菌 能 够 把 自 己 的 抗 生素 抗 性 基 因 转 移 给 人 造 胃 的 细 菌 。 6. 副 作 用 能 对 人 体 产 生 危 害 ： Mayeno,A.N.等 （ 1994） 报 告 ，发 生 一 种 新 的 ， 不 明 原 因 的 病 症 ， 主 要 表 现 为 嗜 酸 性 肌 痛 。临 床 表 现 有 麻 痹 、 神 经 问 题 、 痛 性 肿 胀 、 皮 肤 发 痒 、 心 脏出 现 问 题 ， 记 忆 缺 乏 、 头 痛 、 光 敏 、 消 瘦（ Brenneman,D.E.等 ， 1993； Love,L.A.等 ， 1993） 。 后查 明 系 日 本 一 公 司 生 的 基 因 化 工 程 细 菌 产 生 的 色 氨 酸 所 致 。食 用 者 在 3个 月 后 发 病 ， 导 致 37人 死 亡 ， 1500人 体 部 份 麻痹 ， 5000多 人 发 生 偶 尔 性 无 力 。 据 测 定 ， 含 量 为 0.1%便可 杀 死 人 体 。 1 除 草 剂 使 用 的 增 加 ： 科 学 家 估 计 ， 基 因 化 的 农 作 物 对 除 草剂 具 有 抵 抗 力 ， 实 际 应 药 量 高 于 正 常 的 3倍 。 农 民 知 道 其作 物 对 除 草 剂 有 抵 抗 力 ， 会 大 量 使 用 除 草 剂 。2 杀 虫 剂 使 用 的 增 加 ： 农 作 物 常 使 用 自 己 特 有 的 杀 虫 剂 ， 基因 化 的 农 作 物 对 杀 虫 剂 有 抵 抗 力 ， 这 就 意 味 着 比 以 前 有 更多 的 杀 虫 剂 进 入 我 们 的 食 品 和 田 野 。 有 报 导 ， 将 优 良 的 特定 的 基 因 （ 如 抗 杀 虫 剂 ） 植 入 作 物 ， 可 能 会 使 周 围 野 生 植物 一 并 获 得 改 良 ， 呈 现 出 抗 杀 虫 剂 的 特 征 。 对 环 境 产 生 的 安 全 性 问 题 3 基 因 污 染 ： 转 基 因 作 物 通 过 基 因 流 可 使 野 生 近 缘 种 变 为杂 草 ， 成 为 “ 超 级 杂 草 ” 。 有 资 料 证 明 ， 把 转 基 因 油 菜 释放 后 ， 当 大 田 的 油 菜 附 近 有 近 缘 杂 草 时 ， 在 萌 发 的 后 代 种子 中 有 93%被 证 实 是 种 间 杂 草 。 4 对 非 目 标 生 物 有 伤 害 ， 对 生 物 多 样 性 形 成 威 胁 ：Birch,A.等 （ 1996/7） 的 实 验 结 果 表 明 ， 用 转 基 因 马 铃薯 饲 喂 蚜 虫 ， 雌 虫 的 产 卵 量 减 少 1/3， 用 喂 转 基 因 马 铃薯 长 大 的 雄 蚜 虫 与 对 照 组 蚜 虫 交 配 ， 所 得 的 未 受 精 卵数 量 多 4倍 ， 已 受 精 卵 在 未 孵 化 前 比 对 照 组 死 亡 率 高 近3倍 ， 以 转 基 因 马 铃 薯 蚜 虫 为 食 物 的 雌 飘 虫 的 存 活 时 间比 对 照 组 少 一 半 ， 如 果 大 规 模 的 种 植 转 基 因 作 物 ， 可能 会 减 少 有 益 昆 虫 的 种 群 。 转 基 因 食 品 的 检 测 技 术 转 基 因 植 物 产 品 的 安 全 性 评 估 极 为 重 要 ， 但 可 能 更 为 受到 人 们 关 注 的 是 转 基 因 产 品 的 检 测 技 术 。 目 前 要 测 试 植 物产 品 是 否 含 有 基 因 改 造 成 分 ， 或 植 物 产 品 是 否 经 过 基 因 改造 ， 主 要 有 两 种 方 法 ： 1 检 测 是 否 有 外 来 基 因 或 DNA；2 检 测 是 否 有 外 源 的 蛋 白 质 。 制 订 了 12项 转 基 因 产 品 检 测 行 业 标 准 和 7项 国 家 标 准 ；研 制 并 生 产 了 10种 转 基 因 产 品 检 测 试 剂 产 品 ； 建 立 了 转 基 因产 品 检 测 信 息 库 和 一 个 转 基 因 产 品 信 息 网 站 。n 大 豆 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 n 玉 米 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 n 油 菜 籽 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 n 烟 草 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 n 植 物 性 饲 料 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 n 马 铃 薯 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 n 棉 花 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 食 源 微 生 物 的 安 全 性时 间 微 生 物 名 称 食 品 源 感 染 人 数 国 家1984 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 沙 拉 酱 美 国1985 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 巴 氏 消 毒 奶 170 000 美 国 1989 金 黄 色 葡 萄 球 菌 蘑 菇 罐 头 美 国1991 甲 肝 病 毒 毛 蚶 300 000 中 国1994 肠 炎 沙 门 氏 菌 巴 氏 消 毒 液 态 冰 激 凌 224 000 美 国1996 大 肠 杆 菌 O157:H7 萝 卜 8 000 日 本 1997 肠 炎 沙 门 氏 菌 蛋 和 肉 制 品 2013 比 利 时2000 金 黄 色 葡 萄 球 菌 雪 印 牛 奶 日 本2001 单 增 李 斯 特 菌 法 国世 界 上 食 源 微 生 物 感 染 群 发 事 件 根 据 WHO估 计 ：发 达 国 家 食 源 性 疾 病 的 漏 报 率 在 90%以 上发 展 中 国 家 食 源 性 疾 病 的 漏 报 率 95%以 上“冰 山 一 角 ” 沙 门 氏 菌 （ 禽 、 畜 肉 ）副 溶 血 性 弧 菌 （ 水 产 品 ）蜡 样 芽 孢 杆 菌 和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （ 剩 饭 ）肉 毒 梭 菌 （ 发 酵 制 品 、 肉 制 品 ）单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 菌 （ 乳 制 品 、 冷 藏 食 品 ）大 肠 杆 菌 O157:H7（ 肉 制 品 ） 等 。微 生 物 性 食 物 中 毒 常 见 的 致 病 菌 和 食 物 ： 方 法 修 订 征 求 意 见 文 本n GB4789.2 菌 落 总 数 测 定n GB4789.3.1 大 肠 菌 群 测 定 n GB4789.3.2 粪 大 肠 菌 群 测 定 n GB4789.3.4 大 肠 杆 菌 检 验 n GB4789.10.1 金 黄 色 葡 萄 球 菌 定 性 检 验 n GB4789.10.2 金 黄 色 葡 萄 球 菌 定 量 检 验 生 物 毒 素 的 安 全 性也 称 作 真 菌 毒 素 （ Mycotoxins）Mykes: Greek for fungus/mold希 腊 语 “ 霉 菌 ”Toxicum: Latin for poison/toxin拉 丁 文 “ 毒 素 ” 真 菌 毒 素 （ Mycotoxin） ， 有 时 也 俗 称 霉 菌 毒 素 ， 是 某 些真 菌 产 生 的 代 谢 产 物 ， 目 前 已 发 现 的 真 菌 毒 素 有 十 多 种 ，它 们 包 括 黄 曲 霉 毒 素 、 赭 曲 霉 毒 素 、 伏 马 霉 素 、 脱 氧 雪 腐镰 刀 菌 烯 酮 （ 也 称 为 呕 吐 毒 素 ） 、 玉 米 赤 霉 烯 酮 、 T-2毒素 、 麦 角 碱 、 杂 色 曲 霉 素 、 黄 米 毒 素 、 岛 青 霉 毒 素 、 展 青霉 毒 素 （ 棒 曲 霉 毒 素 ） 、 橘 青 霉 素 、 皱 褶 青 霉 素 、 黄 绿 青霉 素 、 红 矢 精 、 黄 绿 素 、 圆 弧 青 霉 偶 氮 酸 和 F-2毒 素 等 。 能 够 产 生 真 菌 毒 素 的 霉 菌1） 曲 霉 属 （ Aspergillus Link） ： 黄 曲 霉 （ A. flavus） 、寄 生 曲 霉 （ A. parasiticus） 、 赭 曲 霉 （ A. ochraceus） 、杂 色 曲 霉 （ A. flavus） 、 烟 曲 霉 （ A. flumigatus） 、 构巢 曲 霉 （ A. nidulans） 和 棒 曲 霉 （ A. clavus） 等 。2） 青 霉 属 （ Penicillium Link ex Fr） ： 岛 青 霉 （ P. islandicum） 、 橘 青 霉 （ P. citrinum） 、 红 色 青 霉 （ P. rubrum） 、 展 青 霉 （ P. patulum） 和 黄 绿 青 霉 （ P. citreo-vinide） 等 。3） 镰 刀 菌 属 （ Fusarium Link ex Fr） ： 禾 谷 镰 刀 菌 （ F. graminearun） 、 串 珠 镰 刀 菌 （ F. moniliforme） 、 木贼 镰 刀 菌 （ F. equiseti） 、 茄 病 镰 刀 菌 （ F. solani） 、三 线 镰 刀 菌 （ F. tritinctum） 和 镳 草 镰 刀 菌 （ F. sporotrichioides） 等 。 玉 米 上 的 曲 霉 属 （ Aspergillus) 玉米上的镰刀菌属（Fusarium) 玉米上的赤霉素（Gibberella) Aflatoxin 黄 曲 霉 毒 素n Produced by Aspergillus flavus and A. parasiticus 由 黄 曲霉 和 寄 生 曲 霉 产 生n Five key aflatoxins (五 种 黄 曲 霉 毒 素 ): B1, B2, G1, G2 and M1 n Found in corn, grains, cottonseed, peanuts, tree nuts, spices, milk 玉 米 、 谷 物 、 棉 籽 、 花 生 、 坚 果 、 调 味 品 、 牛奶 中 均 已 发 现 n Liver damage 对 肝 有 损 害n IARC- class 1 human carcinogen 国 际 肿 瘤 研 究 机 构 定 为一 级 致 癌 物 黄 曲 霉 毒 素 的 化 学 性 质 黄 曲 霉 毒 素 的 基 本 结 构 为 二 呋 喃 环 和 香 豆 素 ， 在紫 外 线 下 ， 黄 曲 霉 毒 素 B1、 B2发 兰 色 荧 光 ， 黄 曲 霉 毒素 G1、 G2发 绿 色 荧 光 。 黄 曲 霉 毒 素 M1是 黄 曲 霉 毒 素 B1在体 内 经 过 羟 化 而 衍 生 成 的 代 谢 产 物 。 黄 曲 霉 毒 素 的 分子 量 为 312-346。 难 溶 于 水 ， 易 溶 于 油 、 甲 醇 、 丙 酮 和氯 仿 等 有 机 溶 剂 ， 但 不 溶 于 石 油 醚 、 己 烷 和 乙 醚 中 。一 般 在 中 性 及 酸 性 溶 液 中 较 稳 定 ， 但 在 强 酸 性 溶 液 中稍 有 分 解 ， 在 pH 9-10的 强 碱 溶 液 中 分 解 迅 速 。 其 纯 品为 无 色 结 晶 ， 耐 高 温 ， 黄 曲 霉 毒 素 B 1的 分 解 温 度 为 268 oC， 紫 外 线 对 低 浓 度 黄 曲 霉 毒 素 有 一 定 的 破 坏 性 。 黄 曲 霉 毒 素 在 各 国 商 品 中 的 存 在 情 况 (1)商 品 国 家 文 献 发表 年 份 被 分 析 的样 品 数 出 现 率（ %） 含 量 范 围( g/kg)玉 米 印 度 1997 2074 47 5-666玉 米 阿 根 廷 1996 2271 20 5-560花 生 印 度 1996 2062 45 5-833花 生 粉 印 度 1995 380 97 8-6280棉 籽 粉 英 国 1997 21 71 5-25干 椰 子 粉 菲 律 宾 1995 9 100 23-186巴 西 果 美 国 1993 176 17 0-619 Pistachio果 芬 兰 1996 29 59 2-165 黄 曲 霉 毒 素 在 各 国 商 品 中 的 存 在 情 况 (2)商 品 国 家 文 献 发表 年 份 被 分 析 的 样品 数 出 现 率（ %） 含 量 范 围（ g/kg）杏 仁 美 国 1993 44 1 0-372大 豆 阿 根 廷 1991 94 10 1-36大 米 厄 瓜 多尔 1997 99 9 7-40小 麦 乌 拉 圭 1996 123 20 2-20干 无 花果 奥 地 利 1993 136 13 1-350 肉 豆 蔻 日 本 1993 67 43 0-17Chillies果 巴 基 斯坦 1995 176 66 1-80 Aspergillus flavus黄 曲 霉n 五 颗 表 面 消 毒 的 花 生置 于 营 养 培 养 基 中 ，其 中 两 颗 有 长 出 黄 曲霉 （ 黄 绿 色 霉 菌 ） 黄 曲 霉 毒 素 的 毒 害 作 用黄 曲 霉 毒 素 对 天 竺 鼠 肝 脏 的 影 响 ， 从 上 排 的 最 左 边 到 下 排 的 最右 边 ， 同 一 时 间 内 摄 入 的 黄 曲 霉 毒 素 量 逐 步 增 加 。 请 注 意 ： 摄入 的 黄 曲 霉 毒 素 量 越 大 ， 天 竺 鼠 肝 脏 越 苍 白 。 黄 曲 霉 毒 素 的 毒 性1.一 级 致 癌 物 质 。2.是 氰 化 钾 的 10-20倍 。3.是 砒 霜 的 68倍 。4.是 农 药 1605、 1059的 28-33倍 。5. 是 3， 4-苯 并 芘 的 4000倍 。6.是 二 甲 基 亚 硝 胺 的 75倍 。 黄 曲 霉 毒 素 引 起 的 家 禽 和 家 畜 中 毒 症 （ 一 ）动 物 年 龄 黄 曲 霉 毒 素 (mg/kg.bw) 喂 饲时 间 毒 性 作 用小 牛 断 乳 0.22-2.2 16周 发 育 迟 缓 、 死 亡 、 肝损 伤小 公 牛 2岁 0.22-0.66 20周 肝 损 伤奶 牛 2岁 2.4 7个 月 肝 损 伤鸭 0.234 6周 肝 损 伤 、 死 亡 黄 曲 霉 毒 素 引 起 的 家 禽 和 家 畜 中 毒 症 （ 二 ）动 物 年 龄 黄 曲 霉 毒 素 (mg/kg.bw) 喂 饲时 间 毒 性 作 用猪 新 生 0.234 4天 发 育 迟 缓猪 2周 0.17 23周 厌 食 、 黄 疸 、 腹 水 、 发育 迟 缓猪 4-6周 0.41-0.69 3-6个 月 发 育 迟 缓 、 肝 损 伤鸡 1周 0.84 10周 发 育 迟 缓 、 肝 损 伤鸡 2天 0.2 40天 长 瘤 Ochratoxin赭 曲 霉 毒 素n Produced by Aspergillus ochraceus and Penicillium viridicatum 由 赭 色 曲 霉 菌 和 青 霉 菌 产 生n Found in cereal grains, coffee, pig products, dried vine fruit, wine可 在 谷 物 、 咖 啡 、 猪 肉 产 品 、 葡 萄 干 和酒 中 发 现 n Nephrotoxin (kidney toxin)肾 毒 素n Linked to Balkan endemic nephropathy与 巴 尔 干 肾 病 有 关n IARCpossible human carcinogen 国 际 肿 瘤 研 究 机 构 认 定为 2B类 致 癌 物 赭 曲 霉 毒 素 的 化 学 性 质 包 括 7种 结 构 类 似 的 化 合 物 。 其 中 赭 曲 霉 毒 素 A(R1=C1， R2=H)毒 性最 大 ， 在 霉 变 谷 物 、 饲 料 等 最 常 见 。 赭 曲 霉 毒 素 A是 一 种 无 色 结 晶 化 合 物 。 可 溶 于 极 性 有 机 溶 剂 和 稀 碳 酸氢 钠 溶 液 。 微 溶 于 水 。 其 苯 溶 剂 化 物 熔 点 94 96 ， 二 甲 苯 中 结 晶 熔 点169 。 有 很 高 的 化 学 稳 定 性 和 热 稳 定 性 。 赭 曲 霉 毒 素 A是 由 多 种 生 长 在粮 食 （ 小 麦 、 玉 米 、 大 麦 、 燕 麦 、 黑 麦 、 大 米 和 黍 类 等 ） 、 花 生 、 蔬 菜（ 豆 类 ） 等 农 作 物 上 的 曲 霉 和 青 霉 产 生 的 。 动 物 摄 入 了 霉 变 的 饲 料 后 ， 这种 毒 素 也 可 能 出 现 在 猪 和 母 鸡 等 的 肉 中 。 赭 曲 霉 毒 素 主 要 侵 害 动 物 肝 脏 与肾 脏 。 这 种 毒 素 主 要 是 引 起 肾 脏 损 伤 ， 大 量 的 毒 素 也 可 能 引 起 动 物 的 肠 黏 膜 炎 症 和 坏 死 。 还 在 动 物 试 验 中 观 察 到 它 的 致 畸 作 用 。 赭 曲 毒 素 A在 各 种 商 品 中 的 存 在 情 况 （ 1）商 品 国 家 文 献 发 表年 份 被 分 析 的样 品 数 出 现 率（ %） 含 量 范 围( g/kg)大 麦 德 国 1998 67 97 25-27000小 麦 丹 麦 1997 50 80 50-4550黑 麦 丹 麦 1997 266 29 10-2124燕 麦 丹 麦 1997 121 20 42-350小 麦 瑞 士 1997 153 34 73-2395大 麦 /小 麦 英 国 1997 240 56 50-34868绿 咖 啡 日 本 1997 35 74 100-1740 赭 曲 毒 素 A在 各 种 商 品 中 的 存 在 情 况 （ 2）商 品 国 家 文 献 发表 年 份 被 分 析 的样 品 数 出 现 率（ %） 含 量 范 围( g/kg)绿 咖 啡 英 国 1997 22 50 50-5787可 可 粉 英 国 1996 50 100 225-37000干 果 英 国 1996 48 98 600-37650酒 德 国 1996 64 89 550-6320调 味 品/本 草植 物 德 国 1996 317 27 6-7132 二 .食 品 质 量 安 全 问 题 中 检 测 技 术n分 子 生 物 学 检 测 技 术 基 因 检 测 免 疫 学 检 测n化 学 检 测 技 术 n 基 因 检 测 技 术 ：1. PCR法2. 分 子 杂 交 法3. 基 因 芯 片 法 PCR的 概 念 PCR技 术 的 创 建PCR的 原 理PCR的 反 应 体 系 和 方 法PCR的 类 型 和 应 用 PCR技 术 诞 生 所 依 赖 的 社 会 需 求 和 研 究 需 要 引 物 引 物1983年 XX ( )40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20 复温 PCR管 加 热 使 模 板 变 性 , 退 火 使 引 物 与 模 板 DNA互补 ,延 伸 需 将 反 应 温 度 升 至 中 温 ( 72 ),在 Tap多聚 酶 的 作 用 下 ,以 dNTP为 原 料 ,以 引 物 为 复 制 的 起点 ,合 成 新 链 。 如 此 重 复 改 变 反 应 温 度 ,即 高 温 变 性 、 低 温 退 火和 中 温 延 伸 三 个 阶 段 为 一 个 循 环 ,每 一 次 循 环 使 特异 区 段 的 基 因 拷 贝 数 放 大 一 倍 ,一 般 样 品 是 经 过 30次 循 环 ,最 终 使 基 因 放 大 了 数 百 万 倍 ; 将 扩 增 产 物进 行 电 泳 ,经 溴 化 乙 锭 染 色 ,在 紫 外 灯 照 射 下 肉 眼能 见 到 扩 增 特 异 区 段 的 DNA带 。 经 典 循 环 参 数 （ 500bp以 内 ） 30次 1234 1234 逆 转 录 酶 聚 合 酶 mRNAcDNA杂 化 双 链PCR扩 增 全新4通道实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪 + 5 5 A 正 常 人A 病 人 A PCR技 术 在 食 品 安 全 检 测 中 的 应 用方 法 步 骤 ：1、 运 用 化 学 手 段 对 DNA提 取 ；2、 设 计 并 合 成 引 物 ；3、 进 行 PCR扩 增 ；4、 克 隆 并 筛 选 鉴 定 PCR产 物 ；5、 DNA序 列 分 析 。 转 基 因 食 品 的 检 测 大 豆 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 玉 米 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 油 菜 籽 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 烟 草 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 植 物 性 饲 料 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 马 铃 薯 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 棉 花 中 转 基 因 成 份 定 性 PCR检 测 方 法 原 理 ：标 记 基 因 的 PCR检 测1.报 告 基 因GUS 基 因荧 光 素 酶 (LUC)基 因胭 脂 碱 合 成 酶 (NOS)基 因GFP基 因2. 抗 性 基 因 PCR技 术 在 微 生 物 学 中 的 应 用一 . 微 生 物 检 测1.常 规 PCR检 测 在 1992年 Rahn 等 利 用 沙 门 氏 菌 的 invA基 因 设 计 了 一 对 引 物 ,第 一 次 用 PCR的 方 法 对 沙 门 氏 菌 进 行 了 检 测 试 验 。 共 检 测 了 630株 沙 门 氏 菌 ,约 100多 种 血 清 型 和 21个 菌 属 的 142株 非 沙 门 氏 菌 。结 果 显 示 ,有 两 株 没 有 检 测 出 ,检 出 率 为 99.14%。 2.多 重 PCR Cortez等 （ 2006） 用 多 重 PCR检 测 了 家 鸡 屠 宰 场 不 同 来 源 样品 中 的 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 、 肠 炎 沙 门 氏 菌 和 其 他 血 清 型 的 沙 门 氏 菌 。其 使 用 了 3对 引 物 ,分 别 来 自 沙 门 氏 菌 的 invA, pefA和 sefA 基 因 。在 检 测 的 288 份 样 品 中 ,鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 和 肠 炎 沙 门 氏 菌 的 检 出率 为 62%,其 他 血 清 型 的 沙 门 氏 菌 为 10%。 3.巢 式 PCR 巢 式 PCR ( nesting PCR)是 指 先 后 用 两 套 引 物 进 行 扩 增 的PCR 技 术 ,用 内 外 两 对 引 物 先 后 扩 增 靶 基 因 片 段 。 通 常 是 先 用 第一 套 引 物 扩 增 15 - 30个 循 环 ,再 用 已 扩 增 的 DNA片 段 内 设 定 的 第二 套 引 物 扩 增 15 - 30个 循 环 。 由 于 第 二 套 引 物 设 计 片 段 位 于 第一 套 引 物 扩 增 的 片 段 内 ,所 以 将 第 一 套 引 物 称 为 外 引 物 ,而 把 第 二套 引 物 叫 做 内 引 物 。 巢 式 PCR既 可 增 加 反 应 的 物 异 性 ,又 可 得 到 丰产 的 特 异 性 靶 序 列 ,增 加 敏 感 性 。 巢 式 PCR技 术 对 微 生 物 的 检 测 和单 拷 贝 基 因 靶 DNA的 扩 增 都 是 非 常 有 效 。 Hashimoto等 （ 1995） 基 于 编 码 Vi抗 体 的 基 因 序 列 改 进 了 巢式 PCR,所 有 的 伤 寒 菌 (包 括 丙 型 副 伤 寒 )都 能 检 出 , 灵 敏 度 可 以 达到 单 个 细 胞 水 平 。 Prakash（ 2005） 的 研 究 设 计 了 肠 沙 门 氏 菌Typhi血 清 型 菌 株 的 H12d特 异 引 物 对 进 行 巢 式 PCR,结 果 显 示 ,该巢 式 PCR能 够 代 替 Widal测 试 方 法 诊 断 伤 寒 症 。 4.荧 光 定 量 PCR Nam等 10 建 立 和 评 价 了 SYBR Green 1 实 时 PCR特 异检 测 沙 门 氏 菌 的 方 法 。 用 大 小 为 119 bp的 invA 基 因 作 为 检 测 靶点 ,对 124 株 沙 门 氏 菌 和 116株 非 沙 门 氏 菌 进 行 了 检 测 。 检 测 结果 显 示 ,所 有 的 沙 门 氏 菌 有 invA基 因 阳 性 条 带 ,而 非 沙 门 氏 菌 均 没有 扩 增 条 带 。 5. 热 起 动 PCR 热 起 动 PCR (Hot start PCR)指 的 是 使 Taq DNA聚 合 酶 只 在样 品 温 度 超 过 至 少 70 时 才 发 挥 作 用 的 PCR。 它 是 为 提 高 反 应 的特 异 性 设 计 的 。 如 所 周 知 道 , Taq DNA聚 合 酶 通 常 在 比 适 宜 温 度低 得 多 的 条 件 下 仍 有 较 强 的 活 性 ,会 导 致 非 靶 序 列 的 扩 增 ,影 响PCR反 应 的 特 异 性 。 热 起 动 可 减 少 非 靶 序 列 的 扩 增 ,从 而 提 高 反 应的 特 异 性 。 Yang等 （ 2006） 设 计 了 12对 引 物 进 行 多 重 PCR,并 使 用 了 热启 动 酶 ,检 测 腊 样 芽 孢 杆 菌 毒 素 基 因 。 该 体 系 成 功 的 检 测 出 了 与 食物 中 毒 及 与 食 品 相 关 的 162株 菌 中 潜 在 的 毒 素 。 二 .微 生 物 分 类 鉴 定 在 酿 造 工 业 中 ， 对 于 保 持 发 酵 持 久 度 的 一 致 性 和 全 体 产 品 质 量的 一 致 性 来 说 ， 从 非 酿 酒 酵 母 菌 株 中 纯 化 酿 酒 酵 母 菌 株 是 必 要 的 。传 统 的 基 于 形 态 、 生 理 生 化 的 检 测 和 分 类 鉴 定 方 法 常 常 比 较 耗 时且 结 论 也 不 确 定 和 完 全 ， 特 别 是 难 于 从 表 现 型 上 区 分Saccharomyces 属 的 S.cerevisiae， S.bayanus 和S.diastaticus， 因 为 这 些 酿 酒 酵 母 它 们 属 于 同 一 个 属 。Yamagishi等 应 用 标 定 FLO1 的 开 放 阅 读 框 架 的 PCR 法 来 区 分 酿酒 酵 母 和 非 酿 酒 酵 母 ， PCR 分 子 水 平 的 显 示 结 果 表 明 了 二 者 的 不同 展 望 PCR 技 术 和 以 PCR 技 术 为 基 础 的 分 子 生 物 学 技 术给 现 代 生 物 学 的 研 究 带 来 了 革 命 性 的 变 化 ， 微 生 物 学自 然 也 不 例 外 ， 它 们 给 微 生 物 学 的 研 究 开 辟 了 一 个 新的 天 地 ， 微 生 物 由 于 个 体 微 小 和 本 身 研 究 的 特 殊 性 ，相 对 与 其 他 学 科 来 说 更 需 要 PCR 技 术 和 以 PCR 技 术 为基 础 的 分 子 生 物 学 技 术 。 相 信 随 着 科 学 技 术 的 进 一 步发 展 及 其 在 微 生 物 学 应 用 领 域 的 扩 大 ， 它 们 必 将 发 挥出 更 大 的 作 用 。 核 酸 分 子 杂 交 技 术n SOUTHERNn NORTHERN 第 一 节 核 酸 分 子 杂 交 的 基 本 原 理 原 理 ： 碱 基 互 补 配 对 原 则 一 、 核 酸 分 子 杂 交 (nucleic acid hybridization ) 来 源 不 同 的 两 条 单 链 核 酸 分 子 通 过 碱 基 互补 形 成 异 源 双 螺 旋 分 子 ， 称 为 核 酸 分 子 杂 交 。 杂 交 可 分 成 ： DNA/DNA、 RNA/RNA、DNA/RNA之 间 的 杂 交 。 复 性RNA DNA n 待 测 核 酸 序 列n 探 针 (probe)： 已 知 核 酸 序 列 二 、 DNA的 变 性 (denaturation)n 定 义 ： 在 某 些 理 化 因 素 作 用 下 ， DNA双 链 解 开 成 两 条 单 链 的 过 程 。n 方 法 ： 过 量 酸 、 碱 、 加 热 、 变 性 试 剂 如 尿 素 、 甲 酰 胺 以 及 某 些 有 机 溶 剂 如 乙 醇 、 丙 酮 等 。 变 性 后 其 它 理 化 性 质 变 化 ： OD260增 高 粘 度 下 降 比 旋 度 下 降 浮 力 密 度 升 高 酸 碱 滴 定 曲 线 改 变 生 物 活 性 丧 失 DNA变 性 的 本 质 是 双 链 间 氢 键 的 断 裂 Tm： 变 性 是 在 一 个 相 当 窄 的 温 度 范 围 内 完 成 ， 在 这 一 范 围 内 ，双 链 DNA变 性 一 半 所 需 要 的 温 度 称 为 DNA的 解 链 温 度 ， 又 称 熔 解 温度 (melting temperature, Tm)。 其 大 小 与 G+C含 量 成 正 比 。 计 算 公 式n Tm=（ G+C） % 0.41+69.3 三 、 DNA的 复 性n DNA复 性 (renaturation)的 定 义 在 适 当 条 件 下 ， 变 性 DNA的 两 条 互 补 链 可恢 复 天 然 的 双 螺 旋 构 象 ， 这 一 现 象 称 为 复 性 。 热 变 性 的 DNA经 缓 慢 冷 却 后 即 可 复 性 ，这 一 过 程 称 为 退 火 (annealing) 。 n 减 色 效 应 DNA复 性 时 ， 其 溶 液 OD260降 低 。 DNA-DNA杂 交 双 链 分 子变 性 复 性 不 同 来 源 的DNA分 子 第 二 节 核 酸 分 子 杂 交 的 基 本 方 法 核 酸 分 子 杂 交 的 类 别 （ 一 ） DNA印 迹 技 术 (Southern blotting) 用 于 基 因 组 DNA的 定 性 定 量 分 析 、 酶 切 图 谱 分析 、 基 因 突 变 分 析 及 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 分 析（ RFLP） 等 。（ 二 ） RNA印 迹 技 术 (Northern blotting) 用 于 RNA的 定 性 定 量 分 析 。 蛋 白 质 的 印 迹 分 析 (Western blotting) 用 于 蛋 白 质 定 性 定 量 及 相 互 作 用 研 究 。 n 其 他n 斑 点 印 迹 (dot blotting) n 原 位 杂 交 (in situ hybridization) （ 一 ） Southern 印 迹 杂 交 n DNA 印 迹n E. Southern 1975 年 Southern blot步 骤（ 1） 待 测 核 酸 样 品 的 制 备 ： 提 取 基 因 组 DNA， 并 用适 当 的 限 制 性 内 切 酶 消 化 水 解 基 因 组 DNA， 成 大 小 不一 的 DNA片 段 。（ 2） 待 测 DNA样 品 的 电 泳 分 离