外源DNA和质粒载体的连接反应

外源DNA和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5磷酸和相邻的3羟基之间形成 的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DN A已去磷酸化，则吸能形成2个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有2个 单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键的形成可 在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DN A连接酶。实际上在有克隆用途中，T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉 反应条件下，它就能有效地将平端DNA片段连接起来。DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹 配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子（分子内连接）还是位于不同分子（分 子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种DNA，也就是用 可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA。在瓜作用的底物。如果反应中DNA浓 度低，则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大（因为DNA分子的一个末端找到同一分子 的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。这倦，在DNA浓度低时，质粒 DNA重新环化将卓有成效。如果连接反应中DNA浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以 前，某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA浓度 高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk等（1975;同时参见 Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第2、3期合刊）从理论上探讨了 DNA浓度对连接产 物性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。j是 DNA分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作 出的：沉吟液中的DNA呈随机卷曲。这样，j与DNA分子的长度成反比（因为DNA越长， 某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的DNA分子来说是一个常数， 与DNA深度无关。j=3/（3nlb0）3/2其中l是DNA长度，以cm计，b是随机卷曲的DN A区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响DNA的刚度。i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3 末端/ml这里No是阿佛伽德罗常数，M是DNA的摩尔浓度（单位：mol/L）。理论上，当j=i 时，给定DNA分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性 相等。因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而 当ji时，有利于重新环化；当ij，则有利于产生多联体。图1.9显示了 DNA区段的大小与 连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需DNA浓度之间关系（Dugaiczyk等， 1985）。现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源DN A片段。对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的 绝对浓度影响，而且还受质粒和外源DNA末端的相对浓度的影响。当i是j的2-3倍（即末 端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源DNA 末端浓度的2倍时，有效重组体的产量可达到最大。这些条什下，连接反应终产物的大约40%都 是由单体质粒与外源DNA所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹 配末端的外源DNA的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含：1）足量的载体DNA，以满足j:i1和j:i3。对一个职pUC18 一般大小的质粒，这意味着 连接反应中应含有载体DNA为20-60gg/mlo2）未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA，如外源DNA浓度比载体低得多，在 效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下，可考 虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹克 隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。（二）粘端连接1）用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用 碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA，然后用TE（pH7.6） 溶液使其浓度为100/mlo2）按如下所述设立连接反应混合物：a. 将0.川1载体DNA转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源DNAob. 加水至7.5 于45C加温5分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到0P。 加入：10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液1叫T4噬菌体NDA连接酶0.1Weiss单位5 mmol/L ATP 1g1于16C温育14小时10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液200mmol/L 同 Tris.Cl（pH7.6）50mmol/K MgCl250mmol/L二硫苏糖醇500gg/m1牛血清白蛋白（组分V.Sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于一20 Co另外，再设立两个对照反应，其中含有（1）只有质粒载体；（2）只有外源DNA片段。 如果外源DNA量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒DNA，并尽可能多加外源DN A，同时保持连接反应体积不超过10/。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA 连接酶的活性。大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，1 1968）对该酶进行标化。1个Weiss单位是指在37C下20分钏内催化1 mmol32P从焦磷酸 根置换到y,-32PATP所需酶时，1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定 义的单位（Modrich和Lehman,1970）或者60个粘端单位（如New England Biolabs公司所定 义）。因此，0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶在16C下30分钟内可使50%的入 噬菌体Hindlll片段（5gg ）得以连接。在本书中，T4噬菌体DNA连接酶一律用 Weiss 单位表示。par目前提供的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液（1-5单位幻1），可用 20mmol/L Tris.Cl （pH7.6 60mmol/L KCl、5mmol/L 二硫苏糖醇、500gg/m1 牛血清白蛋白、 50%甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA 连接酶于-20C保存3个月可保持稳定。3）每个样品各取1 2卜1转化大肠杆菌感受态细胞。（三）平端DNA连接T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶，它可以催化平端DNA片段的 连接(Sgaramella和 Khorana,1972; Sgaramella和 Ehrlich,1978),由于 DNA很容易成为平端， 所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何DNA分子彼此相连。然 而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下4个条件：1) 低浓度(0.5mmol/L)的 ATP(Ferretti 和 Sgaranekka,1981)。2) 不存在亚精胺一类的多胺。3) 极高浓度的连接酶(50Weiss单位.ml)。4) 高浓度的平端。1 .凝聚剂在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物 质，如聚乙二醇(Pheiffer 和 Zimmerman,1983; Zimmerman 和 Pheiffer,1983;ZimmermanT H arrison,1985)或氯化六氨全高钻(Rusche和Howard- Flanders,1985)，可以使如何取得适当浓 度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：1) 它们可使平端DNA的连接速率加大1 3个数量级，因此可使连接反应在酶DNA浓 度不高的条件下进行。2) 它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间 连接的产物。这样，即使在有利于自身环化(j：i=10 )的DNA浓度下，所有的DNA产物 也将是线状多聚体。par在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。(1) 聚乙二醇(PEG8000)1) 用去离子水配制的PEG8000贮存液(40% )分装成小份，冰冻保存，但加入连接反 应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15% PEG 8000的连接反应混合物中，对 连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和T4噬菌体DNA连接酶以外，其他所有连接混 合物的组分应于0C混合，然后加适当体积的PEG 8000 (处于室温)，混匀，加酶后于20C 进行温育。2) 连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著， 甚至ATP浓度略有增加或MgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度(Pheiffer和 Zimmerman,1983 )。3) 浓度为15%的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100 倍，反应的主产物是串联的多联体。4) PEG 8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六 氨合高钻有所不同。(2) 氯化六氨合高钻1) 氯化六氨合高钻可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20C，它对连接反应的刺激具有 高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0- 1.5Mmol/时，其刺激作用最大。氯 化六氨合高钻可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高 到原来的 5倍(Rusche 和 Howard-Flanders,1985)。2) 在单价阳离子(30mmol/L KCl)存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时 连接产物的分布有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状DNA将 点尽优势。3) 与PEG 8000不同，氯化六氨合高钻不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。 第一节概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(V10kb)且结构简 单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限 制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒 转化细菌，即可完成。但在实际工作中，如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自 身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度 比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下，也可以进一步采取一些特殊的克隆策略, 如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化还可以利用遗传学手段如a互补现象 等来鉴别重组子和非重组子。外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补 的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限 制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶 切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段 两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体 也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质 粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，而且正反两种连接方向都可 能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度，以便使正确的连接产物的数量达 到最高水平。还可将载体DNA的5磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，最大限度地抑制质粒 DNA的自身环化。带5端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连，产生 一个带有两个缺口的开环分子，在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所 致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度 和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以 促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体 末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配，也可以有控 制的使用E. coli DNA聚合酶I的klenow大片段部分填平3凹端，使不相匹配的末端转变为 互补末端或转为平末端后再进行连接。本实验所使用的载体质粒DNA为pBS，转化受体菌为E. coli DH5a菌株。由于pBS上带 有Ampr和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与a-互补现象筛选相结合的方法。因pBS带有Ampr基因而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有pBS DNA 的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则 不能存活。此为初步的抗性筛选。pBS上带有。-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和。-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编 码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常 功能。E. coli DH5a菌株带有。-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况 下,pBS和DH5a编码的。-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5a融为一体时 可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的 近操纵基因区段的P-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫a-互补。由a-互补产生 的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X- gal(5-漠-4氯-3引哚书-D-半乳糖苷)下存在下被 IPTG(异丙基硫代书-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆 位点上后会导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去a-互补能力，因此在 同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基 上，a-互补产生的Lac+细菌由于含。-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳 酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去a-互补能力，因而不产生P-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载 体DNA分开。此为a-互补现象筛选。第二节材料、设备及试剂一、材料外源DNA片段：自行制备的带限制性末端的DNA溶液，浓度已知；载体DNA: pBS质 粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化，浓度已知；宿主菌:E. coli DH5a，或JM系列等具有a-互补能力 的菌株。二、设备恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱， 电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。三、试剂1、连接反应缓冲液(10x)： 0.5mol/L Tris-Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫 苏糖醇(DTT)(过滤灭菌)，500gg/ml牛血清清蛋白(组分V.Sigma产品)(可用可不用)， 10mol/L ATP (过滤灭菌)。2、T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。3、X-gal储液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液，包以铝箔 或黑纸以防止受光照被破坏，储存于-20C。4、IPTG储液(200mg/ml):在800gl蒸馏水中溶解200mg IPTG后，用蒸馏水定容至1ml, 用0.22pm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20C。5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮 沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60C左右加入Amp储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇 匀后涂板。6、含X-gal和IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50pg/ml Amp的LB平板表面加 40ml X-gal储液和4plIPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37 C下放置3-4小时，使培养基 表面的液体完全被吸收。7、感受态细胞制备试剂：见第三章。8、煮沸法快速分离质粒试剂：见第一章。9、质粒酶及电泳试剂：见第二章。第三节操作步骤一、连接反应1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf管，编号。2、将0.1pg载体DNA转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA片段。3、加蒸馏水至体积为8pl,于45C保温5分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却 至0C。4、加入 10xT4 DNA ligase buffer 1pl, T4 DNA ligase 0.5pl,混匀后用微量离心机将液体 全部甩到管底，于16C保温8-24小时。同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA ；对照组二只有外源 DNA片段没有质粒载体。二、E. coli DH5a感受态细胞的制备及转化每组连接反应混和物各取2pl转化E. coli DH5a感受态细胞。具体方法见第三章。三、重组质粒的筛选1、每组连接反应转化原液取100pl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上，37C下培养半 小时以上，直至液体被完全吸收。2、倒置平板于37C继续培养12-16小时，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平 板。3、放于4C数小时，使显色完全(此步麦康凯培养基不做)。不带有pBS质粒DNA的细胞，由于无Amp抗性，不能在含有Amp的筛选培养基上成活。 带有pBS载体的转化子由于具有。-半乳糖苷酶活性，在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌 落。在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了。-半乳糖苷酶 活性，在麦康凯选择性培养基和x -gal和ITPG培养基上均为白色菌落。四、酶切鉴定重组质粒用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50gg/ml的5ml LB液体培养基中,37C下振 荡培养12小时。使用煮沸法快速分离质粒DNA直接电泳，同时以煮沸法抽提的pBS质粒 做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS慢。再用与连接未端相对应的限制性 内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。注意1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量， 一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末 端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。3、连接反应后，反应液在0C储存数天，-80C储存2个月，但是在-20C冰冻保存将会 降低转化效率。4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度 为37C，在连接粘性末端时，反应温度以10-16C为好，平齐末端则以15-20C为好。5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段 (2-5倍)，这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。6、麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为 淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛 选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色， 影响挑选。7、X-gal 是 5-漠-4-氯-3引哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D- galactoside) 以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解后生成的引哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖 苷(Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。8、在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携 带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37C培养后放于冰箱3-4小时可使显 色反应充分，蓝色菌落明显。