《分子杂交》PPT课件.ppt

核 酸 分 子 杂 交Nucleic Acid Hybridization 1 分 子 杂 交 概 念 及 应 用分 子 杂 交 ： 在 分 子 克 隆 中 的 一 类 核 酸 和 蛋 白 质 分 析方 法 ， 用 于 检 测 混 合 样 品 中 特 定 核 酸 分 子或 蛋 白 质 分 子 是 否 存 在 ， 以 及 其 相 对 分 子质 量 的 大 小 。 分 子 杂 交 实 质 上 是 DNA或 RNA单 链 之 间 退火 形 成 DNA/RNA或 DNA/DNA杂 合 分 子 。 应 用 范 围 ： 重 组 子 鉴 别 基 因 分 离 DNA片 段 分 析 基 因 表 达 研 究 。 。 。 。 。 。 当 用 一 个 标 记 核 酸 分 子 与 核 酸 样 品 杂 交 ， 便 可以 查 明 该 样 品 中 是 否 存 在 与 该 标 记 核 酸 分 子 具 有 同源 性 的 分 子 。 2 探 针 的 概 念 及 其 标 记 技 术2.1 探 针 (probe): 用 于 检 测 特 定 基 因 或 转 录 产 物 存 在 或 表 达的 DNA、 RNA或 寡 核 苷 酸 。 2.2 探 针 的 标 记 技 术 2.2.1 均 匀 标 记 2.2.2 末 端 标 记 2.2.1 均 匀 标 记 切 口 平 移 法 标 记 DNaseI H O P 5 35 35 3DNaseI与Pol I 的切 口 移 位 Pol I 随 机 引 物 标 记 PCR扩 增 标 记 要 求 ： a-32PdNTP 53 535 55 55 5333 33 35 55-5 2.2.2 末 端 标 记 DNA片 段 的 末 端 标 记 Klenow酶 3-末 端 补 平 (3-末 端 标 记 ) 5-ACGTTGCAAACTG-3 3-TGCAACGTTTGAC-5 四 种 不 同 的 补 平 反 应5-G G ATCC-3 Bam H I 5-G G ATCC-33-CCTAG G -5 3-CCTAG G -5 dNTP dG TP dG TP/dATP dG TP/dATP/dTTP5-G G ATC 5-G G 5-G G A 5-G G AT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG G ATCC-3 G ATCC-3 G ATCC-3 G ATCC-3 CTAG G -5 G G -5 AG G -5 TAG G -5 I S1 S1 S1 5-G G CC-3 5-G G A TCC-3 5-G G AT ATCC-3 3-CC G G -5 3-CCT AG G -5 3-CCTA TAG G -5 II III T4 DNA polymerase T7 DNA polymerase T4 多 核 苷 酸 激 酶 (T4 polynucleotide kinase) 末 端 脱 氧 核 苷 酸 转 移 酶 (TdT) 合 成 寡 核 苷 酸 的 标 记 T4 多 核 苷 酸 激 酶 (T4 polynucleotide kinase) 末 端 脱 氧 核 苷 酸 转 移 酶 (TdT) 3 分 子 杂 交 技 术根 据 检 测 对 象 的 不 同 ： Southern 杂 交 Northern杂 交 Western杂 交 斑 点 杂 交 狭 线 杂 交 菌 落 杂 交 1975年 ,Southern印 迹 杂 交 （ Southern blot） 由 英国 人 埃 德 温 迈 勒 萨 瑟 恩 （ Edwin Mellor Southern）创 建 。 3.1 Southern 杂 交 埃 德 温 迈 勒 萨 瑟 恩 Southern 杂 交 操 作 步 骤 ： 印 迹 转 移 (blotting) 将 DNA片 段 从 琼 脂 糖 凝 胶 转 移 到 滤 膜 的 方式 。 印 迹 转 移 方 式 (1) 毛 细 管 渗 吸 法 白 瓷 盘 玻璃板滤纸凝 胶 尼 龙 膜 滤 纸吸 水 纸 玻 璃 板 重 物毛 细 管 渗 吸 法 真 空 转 膜 槽 滤纸尼龙膜凝 胶盖 子印 迹 转 移 方 式 (2)真 空 转 膜 印 迹 转 移 方 式 (3) 电 转 移 分 子 杂 交 预 杂 交 目 的 ： 将 滤 膜 的 空 白 处 用 鱼 精 DNA或 牛 奶蛋 白 封 闭 起 来 ， 防 止 在 杂 交 过 程 中 滤 膜 本 身 对探 针 的 吸 附 。 预 杂 交 液 实 际 上 就 是 不 含 探 针 的 杂 交 液 ，其 中 主 要 含 有 鱼 精 DNA、 牛 血 清 等 ， 这 些 大 分子 可 以 封 闭 膜 上 所 有 非 特 异 性 吸 附 位 点 。 杂 交 在 一 定 的 溶 液 和 温 度 下 ， 将 标 记 的 探 针 与滤 膜 混 合 ； 洗 涤 25 1 SSC/0.1%SDS 杂 交 温 度 0.25 SSC/0.1%SDS 放 射 性 自 显 影 或 生 化 检 测 。 带 有 DNA片 段 的 凝 胶DNA分 子 酶 切 片 段 限 制 性 酶 切 琼 脂 糖 电 泳 通 过 毛 细 管 渗 吸 或 电 转移 或 真 空 转 移 方 式80 或 紫 外 线 处 理 将 DNA固定 在 滤 膜 上杂 交 、 显 影凝 胶滤 膜0.4MNaOH溶 液 中 DNA变 性在 1.5MNacl+1MTris中 和 ，保 存 单 链 状 态 。吸 附 有 ssDNA的 膜 Southern 印 迹 杂 交 的 技 术 流 程 Southern杂 交Edward Southern（ 1） 提 取 总 DNA（ 2） 酶 解（ 3） 电 泳（ 4） 转 移 到 滤 膜（ 5） 变 性 解 链（ 6） DNA探 针 及 杂 交（ 7） 洗 脱（ 8） 放 射 自 显 影（ 9） 比 较 分 析 Southern杂 交 的 主 要 应 用 ： 判 断 某 一 生 物 样 品 中 是 否 存 在 某 一 基 因 ，以 及 该 基 因 所 在 的 限 制 性 酶 切 片 段 的 大 小 。 3.2 Northern杂 交 印 迹 转 移 的 是 总 RNA或 mRNA。 应 用 ： 在 转 录 水 平 上 某 基 因 是 否 表 达 ，在 有 合 适 对 照 的 情 况 下 ， 通 过 杂 交 信 号 的强 弱 可 比 较 基 因 表 达 的 强 弱 。 3.3 Western杂 交 印 迹 转 移 的 是 蛋 白 质 。 将 待 检 测 蛋 白 质 （ 或 酶 ） 经 PAGE电 泳 并 染色 后 ， 转 移 到 滤 膜 上 固 定 ， 再 用 “ 抗 体 -抗 原 ”免 疫 反 应 鉴 别 滤 膜 上 的 蛋 白 质 。 探 针 :针 对 某 一 蛋 白 质 制 备 的 特 异 性 抗 体 。 以 上 分 子 杂 交 可 以 获 得 精 确 的 结 果 ， 但操 作 繁 杂 。 当 样 品 量 比 较 大 时 ， 难 以 满 足 试 验 需 求 。 当 样 品 量 比 较 大 时 ， 可 以 采 用 简 化 的 方式 做 初 步 的 检 测 ， 然 后 再 对 阳 性 样 品 作 精确 的 检 测 。 3.4 菌 落 杂 交基 本 操 作 步 骤 ： 将 细 菌 菌 落 影 印 到 滤 膜 上 ； 对 滤 膜 上 的 菌 体 做 原 位 裂 解 使 DNA释 放 处来 ， 并 固 定 在 滤 膜 上 ； 分 子 杂 交 。 用 途 ： 从 质 粒 或 黏 粒 载 体 构 建 的 基 因 文库 中 寻 找 阳 性 克 隆 子 ， 然 后 Southern杂 交进 一 步 筛 选 。 3.5 噬 菌 斑 杂 交基 本 操 作 步 骤 ： 将 噬 菌 体 基 因 组 文 库 影 印 到 滤 膜 上 ， 使 噬菌 体 中 的 DNA释 放 并 固 定 在 滤 膜 上 。 分 子 杂 交 用 途 ： 从 噬 菌 体 载 体 构 建 的 基 因 文 库 中寻 找 阳 性 克 隆 子 ， 通 过 Southern杂 交 进 一步 验 证 。 3.6 斑 点 杂 交 直 接 将 DNA或 RNA以 斑 点 的 形 式 固 定 在滤 膜 上 ， 然 后 进 行 分 子 杂 交 。 当 核 酸 分 子 的 斑 点 面 积 变 得 更 小 时 ， 在单 位 面 积 滤 膜 上 处 理 的 样 品 的 数 量 更 多 。当 检 测 的 灵 敏 度 进 一 步 提 高 时 ， 就 发 展 为DNA芯 片 。 小 结 ： 本 节 主 要 讲 述 探 针 的 标 记 技 术 、 常 见 分 子杂 交 基 本 操 作 技 术 。 要 求 你 们 掌 握 这 些 技 术 。作 业 ： 1、 探 针 的 标 记 技 术 有 哪 些 ？ 2、 southern杂 交 技 术 基 本 操 作 步 骤 是 什 么 ？