自噬免疫荧光的检测方法及具体步骤

自噬免疫荧光的检测方法及具体步骤一、技术简介LC3是酵母自噬关键蛋白ATG8在哺乳动物中的同源蛋白。LC3 最初被分析鉴定为 microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3)。LC3 蛋白家族包括 LC3A、B、C 和 GABARAP 等亚 家族，其中对于LC3B的硏究最为广泛。到目前为止，LC3B被认为 是细胞自噬信号通路最为关键的标志性蛋白。LC3B是一个具有125 个氨基酸残基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了 C端 的22个氨基酸蛋白，从而暴露出C端的甘氨酸，人们把它命名为胞 质形式的LC3B I。在细胞自噬的过程中，其C端暴露的甘氨酸经过 一个类似泛素化的过程以ATG7为E1样激活酶(E1-like activating enzyme)以ATG3为E2样连接酶(E2-like conjugation enzyme), 以 Atg12-Atg5-Atg16复合物为 E3 样连接酶(E3-like ligase)，在 C 端甘氨酸上共价连接上磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)而成为LC3B-PE即LC3B II。与胞质定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬体(autophagosome)的内膜和外膜上。在自噬体与溶 酶体融合后，自噬体外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬体内 膜上的LC3B II则被溶酶体内的蛋白酶所降解。尽管LC3B II比LC3B I 的分子量要大，但由于其极强的疏水性，在 SDS-PAGE 电泳时， LC3B II比LC3B I迁移得更快其表观分子量分别为14kD和16kD。 自噬(Autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降 解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。自噬与多种生理功能有关， 在饥饿等不利的环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内 组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细 胞分化及对环境变化产生应答。自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神 经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。由于细胞自 噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域 的一个新的研究热点。GFP-LC3B 是重组慢病毒，感染后能够在靶细胞中有效表达绿色 荧光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈现明亮的绿色荧光，可以用 于细胞自噬的检测。RFP-GFP-LC3B 是研载生物研发的重组慢病毒，感染后能够在靶 细胞中有效表达红色荧光蛋白(RFP)、绿色荧光蛋白(GFP)和LC3B的 融合蛋白，呈现明亮的红色和绿色荧光，可以用于细胞自噬的检测。 自噬小体在与溶酶体融合过程中，溶酶体内的酸性环境会导致 GFP 荧光淬灭，这为追踪GFP-LC3B的细胞定位增加了难度。RFP 是- 种红色荧光蛋白，当其与GFP进行LC3B的共同标记时，在GFP被 溶酶体酸性环境所淬灭的情况下，可以发出红色荧光的 RFP 因为其 卓越的稳定性而被保留。因此，通过融合表达RFP-GFP-LC3B蛋白， 可以非常有效地追踪自噬过程。在用 RFP-GFP-LC3B 慢病毒感染细 胞后，在非自噬的情况下，荧光显微镜下 RFP-GFP-LC3B 以弥散的 黄色荧光(RFP和GFP的综合效果)形式存在于细胞质中而在自噬的 情况下，荧光显微镜下 RFP-GFP-LC3B 则聚集在自噬体膜上，以黄 色斑点的形式表现出来(LC3B dot or punctae)；当自噬体与溶酶体 融合后，因GFP荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来。二、实验流程1. 构建含有LC3B基因的重组载体。2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重 组质粒。3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染 293T 细胞，进行病毒 包装和生产，收集病毒液。4. 浓缩、纯化病毒液。5. 用高质量的病毒液感染宿主细胞或进行稳定转染细胞株的筛选(筛 选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性)；使用药物处理或者siRNA 沉默细胞。6. 免疫荧光标记。7. 先在荧光显微镜下观察确认标记成功，然后移至共聚焦显微镜下进行观测。