猪传染性胸膜肺炎诊断与防控技术

猪传染性胸膜肺炎的诊断与防控技术传染性胸膜肺炎(Actinobacillus pleuropneumoniae ,APP)是由 胸膜肺炎放线杆菌感染所致的一种纤维素性、出血性、坏死性肺炎。 Shope 最早于 1964 提出本病相关的报告之后，本病例一直广布于全 世界，对全球养猪业造成了巨大经济损失1。是猪只重要呼吸道疾 病，所有年龄阶段均可感染，但以肥育猪较常见。美国很多猪群已基 本净化了本病，但APP目前在我国比较普遍(几乎无阴性场)，临床症 状与其它呼吸道疾病相似，在临床上易造成误诊，故笔者将自己对 APP 的诊断与防控措施的体会作如下总结，以期与同行分享。1. 流行病学及致病机理MacInnes 等(1988)指出：猪是胸膜肺炎放线杆菌自然状况下唯 一易感动物，受感染而耐过急性期的猪常呈慢性病变肺溃疡及肋膜粘 连不易剥离。本病主要通过空气传播，慢性感染的猪只常扮演病原携 带者角色，本病菌常存在于鼻腔与扁桃腺，这是本菌污染场不易清除 的主因。本病的发生常和饲养密度大、空气流通不良、气候突然剧烈 改变等环境应激及其它生物性病原感染引发免疫抑制相关。目前研究显示，胸膜肺炎放线杆菌的致病因子包括：旨多糖(LPS)、 Apx毒素、荚膜多糖、菌毛、外膜蛋白等，其中Apx毒素为目前研究 最详尽并已知具有杀灭细胞、溶解红细胞的重要毒力因子。Sebunya 等(1983)认为：胸膜肺炎放线杆菌具有荚膜而不易被吞噬，使本菌能 在肺脏內存活及增殖;此外，细菌死亡后內毒素释出，会对血管內皮 细胞造成伤害，而引致血管內纤维素性血栓及肺小叶水肿，导致呼吸 困难、休克，同时本菌所分泌的外毒素Apx毒素可抑制肺脏吞噬细胞 的作用，帮助本菌深入肺部。Apx毒素共有四大类型，其中Apx I对 肺脏巨噬细胞与淋巴细胞具有杀灭作用。2. 临床症状该病多发于春秋交替、气候多变的季节（我国大部分地区为 10 月4月间），生长育肥猪多发。因易感猪群年龄、群体免疫力、病 原感染压力不同，可表现为最急性型、急性型与慢性型。最急性型病 例，患猪体温突然升高（4142C）,呼吸困难，精神沉郁，鼻子、耳 朵、四肢等末梢部位甚至全身发绀，有时鼻腔有血色泡沫。急性型患 猪体温升高（4041C）,厌食，饮水减少，呼吸困难，咳嗽。若治疗 及时可转变成慢性型。慢性型患猪常无明显临床症状，体温常不升高， 间歇性咳嗽，食欲不佳，生长缓慢，饲料转换率差，影响猪群经济效 益，此外慢性型患猪还是猪群APP的潜在感染源。在临床上，应注意最急性型及急性型传染性胸膜肺炎与败血型巴 氏菌、败血型链球菌、败血型沙门氏菌及急性猪丹毒、高致病性蓝耳 病、弓型体、猪瘟进行鉴别诊断。3. 常用诊断方法 传染性胸膜肺炎的常用诊断方法包括临床诊断、病理诊断、细菌 分离、PCR检测、血清学检测及屠宰场病变评估分析等。各种检测方 法均有其优势及不足之处，常需相互补充，简述如下。3.1病理诊断本病的特征性病变主要在于胸腔，其它部位可见相关病灶。最急 性病例，鼻腔流出血色鼻液，气管与支气管內充满泡沫样血色黏液（图 1），镜下可见肺组织局部出血，有水肿液聚集，支气管周围及肺泡腔 內均有大量嗜中性粒细胞侵润（图2），脏充血、出血，应注意与猪瘟、 猪丹毒及猪链球菌肺炎间的鉴别诊断。急性病例时，肺部出现梅绀色且界限清晰的出血灶、坏死灶（图 3），胸腔积液，有纤维素性渗出物（图4）。镜下可见肺脏病灶区的 血管扩张并聚集大量红细胞，有些血管的管腔內有血栓样物质伴随严 重出血病变，周围的肺泡壁变厚呈现玻璃膜样病变。肺间质与肺泡腔 可见广泛的纤维素及水肿液聚集。慢性病例，肺脏有局灶性的坏死或溃疡（图5），镜下肺病变区呈 现液化坏死灶，而坏死周围伴随有细胞质泡沫样，细胞核偏于细胞角 落的变性单核细胞围绕，这些细胞常呈漩涡样排列（图6）。因纤维 素性渗出，导致肋膜炎、心包炎，肺脏与肋骨间常发生粘连不易剖离 （图7）。慢性病例应注意与巴氏杆菌、放线杆菌、链球菌等引发化脓 性肺炎或肺溃疡感染进行鉴别诊断。图1:最急性型：气管内有大量泡沫图2：最急性型：肺水肿出血并有单细胞团块区图3：急性型：肺脏出血、坏死、胸膜炎图4：急性型：胸腔积液，有大量的纤维性渗出物图5：慢性型：化脓样肉芽肿样结节图6：慢性型：液化坏死灶周围可见变性单核细胞围绕图7：肺脏与肋骨间常发生粘连不易剖离3.2实验室诊断目前已建立细菌分离、病原菌检测、抗体监测等多种胸膜肺炎放 线杆菌实验室诊断方法。但胸膜肺炎放线杆菌的血清型较多、各血清 型间毒力差异大，故在实验室诊断时应充分考虑血清型与毒力对于疾 病发生、发展过程的影响。3.2.1 血清型的多样性与毒力差异目前已知胸膜肺炎放线杆菌至少有2种生物型与15种血清型， 不同血清型之间及同一血清型不同菌株之间的毒力均存在差异，从而 导致该病的诊断非常困难2。影响胸膜肺炎放线杆菌毒力的因素很多，但是否存在毒力基 因.Apxl、ApxlI与ApxIII是影响该菌毒力的重要因素。这三种毒力 基因能够产生毒素，阻断中性粒细胞与巨噬细胞的吞噬功能，从而影 响猪只免疫防御功能。而毒力因子Apx IV 广泛存在于各种血清型的 胸膜肺炎放线杆菌内，且具有良好的种特异性，近年来所发展多种 APP诊断方法（PCR或ELISA）均以检测Apx毒力基因及其抗体为基础。为了判断胸膜肺炎放线杆菌在疫病发生过程中的作用，在本病诊 断与监测过程中，应选择适宜方法对该菌的血清型与毒力进行检测。 目前主要的血清分型方法包括补体结合实验、间接血凝实验、ELISA 等，同时也发展出多种PCR分型技术，通过检测细菌纯培养物的ApxI、 ApxII与ApxIII等毒力基因（表1）来确定病原菌的血清型与潜在毒 力。如赵耘等人建立了多重PCR方法可对18型的APP进行血清型 分型3;L. Zhou等人建立了多重PCR方法对具有免疫交叉反应的血 清型（3、6与8）进行了鉴别诊断4。表1：毒力基因APX与血清型的关系细菌分离与PCR检测是目前最常用的胸膜肺炎放线杆菌病原检 测方法。胸膜肺炎放线杆菌培养条件较苛刻，时间投入大，分离部位 （扁桃体、气管或肺等）常有杂菌污染，导致分离失败。可用5%的羊 血琼脂培养基从肺部、扁桃体及气管内分离病原菌，该菌与表皮葡萄 球菌或金黄色葡萄球菌共培养时可出现完全溶血现象。也可用病变肺 组织作抹片直接进行显微镜检查（革兰氏阴性杆菌）。从慢性胸膜肺炎 的患猪或已用药物治疗的肺组织中分离培养胸膜肺炎放线杆菌难度 更大，故依靠细菌分离确诊慢性型APP的难度较高。APP的毒力基因Apx IV具有种特异性，目前所开发的多种PCR 方法均以检测Apx IV为基础，检测对象常为细菌纯养物。直接用PCR 检测新鲜肺中是否存在胸膜肺炎放线杆菌的方法已建立并商业化 （ADIAVET APP检测试剂盒），还建立了套氏PCR方法（灵敏度可高达 10个细菌）对经过甲醛固定处理并包埋在石蜡中的肺组织样品进行 APP检测5,还可用实时定量PCR直接扁桃体中病原菌（灵敏度：5 个细菌）6，但这种直接检测病料中病原菌的方法尚未普遍推广7。3.2.3抗体检测与监测酶联免疫吸附实验（ELISA）是检测或/和监测APP抗体的最常用 方法且已成功商品化。因胸膜肺炎放线杆菌的分离培养，特别是从慢 性型或亚临床型病例中的分离率较低，故血清型方法对于本病的诊断 与监测尤为重要8。APP抗体检测的主要方法包括：溶血素中和试 验(HNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及补体结合试验等。补体结合试 验因特异性差、操作繁琐等原因现已很少使用9。ELISA因特异性 与敏感性均较好，已成为最常用的APP抗体检测与监测手段，目前已 有多个商品化ELISA试剂盒，如IDEXX公司的Apx IV抗体检测试剂 盒、Biovet公司的细菌分型ELISA试剂盒等，但两者所检测抗体标 的物不同，IDEXX公司的试剂盒检测的是Apx IV抗体，因Apx IV毒 素仅在体内感染时才能表达，在细菌体外培养时不能分泌该毒素，故 检测Apx IV毒素抗体的试剂盒可用于区分自然感染与疫苗免疫，对 猪群的感染状态进行判断，但无法确定细菌的血清型与毒力。而 Biovet等公司的试剂盒检测荚膜脂多糖抗体，可对APP的某些血清 型与细菌毒力进行鉴别诊断，但无法区分自然感染与疫苗免疫且易出 现假阴性。3.2.4 实验室诊断结果解读因各种实验室检测方法均存在优势与不足，故在解读APP实验室 检测结果时，需格外谨慎。目前行业内所建立的多种APP检测方法多 以APX IV毒素或其抗体为基础(血清学或PCR)，但当猪群感染无毒 力或低毒力的APP菌株时，无临床症状且对猪群影响较小，但会影响 检测结果的解读，故当APX IV呈阳性时，仍需对细菌毒力、血清型 及对疫病的影响进行深入探究。目前所建立的血清学或PCR分型方法 均不完善，仅能对部分血清型进行鉴别或区分，易出现假阴性。虽可利用PCR方法直接从组织样品（如：扁桃体拭子）中检测Apx 毒素，但Apx毒素也可能存在于猪放线杆菌中，故Apx毒素基因检测 阳性时，最好对细菌进行纯培养，以确认病原菌种类。但对APP进行 纯培养并不容易，特别是利用扁桃体拭子时，因扁桃体上有很多共生 菌，而共生菌的生长速度常快于胸膜肺炎放线杆菌，而影响到分离培 养结果。故分离不到胸膜肺炎放线杆菌也不能说明猪群呈APP阴性。虽然实验室诊断尚存在一定的不足，但其是临床诊断与剖检诊断 的有力补充，特别是在对猪群进行APP流行病学调查时，有着独特优 势，故应综合临床症状、病理剖检、细菌分离与检测及血清学监测等 方法。3.3屠宰场病变评估 屠宰场肺部病变评分法是生长育肥猪慢性肺炎的一种重要的回 顾性诊断方法，已被广泛应用于胸膜炎（包括传染性胸膜肺炎）的感染 状况调查。 Vincent 等人10发展出屠宰场胸膜炎评估系统 （Slaughterhouse Pleurisy Evaluation System SEPS ）。该法依 据胸膜炎粘连是否存在，存在的位置、范围及严重程度对其评分，分 为04个等级（表2）。表2：胸膜炎的病变等级判定胸膜炎枯连发生位置、翹n员严重堤度门病变等鬆50变门3尖叶与心叶间发生粘生或肺膈叶的腹侧喙发生粘连门IP单侧肺掃叶呈现轻微的局灶性枯连欣侧肺狷叶均有轻微的局灶性枯连或单侧肺膈叶呈现严堇的飓侧肺呈现产重的粘连（两侧的肺膈叶厂出发生枯连）口www. Ehujiig*. com. erL I但是引致胸膜炎的因素依据发生部位与形态的不同有所不同 10, 般认为，尖叶与心叶间的粘连较轻微，多由肺炎支原体与巴 氏杆菌等感染所致，对肺脏呼吸功能影响较轻微，而膈叶的胸膜炎多 因传染性胸膜肺炎感染引致，偶尔也由副猪嗜血杆菌、链球菌等感染 引致，对肺的呼吸功能影响也较严重10。据Pichai等人11的屠 宰场肺部评估发现：45%的肺具有胸膜炎病变（评估968只肺，435 只有胸膜炎），其中22例肺分离出胸膜肺炎放线杆菌，而55例肺分 离出巴氏杆菌，未能确定导致胸膜炎的主导病原菌。虽然屠宰场肺部病变评估（胸膜炎）不能确定是否由APP所致，但 作为评价猪群肺部健康状况与呼吸道疾病防控措施有效性的方法，其 应用越来越广泛。当猪群胸膜炎比例升高时，再结合病原分离与血清 学监测进行综合诊断，可提高监测效率与降低诊断成本。4.防控措施饲养管理：改善饲养环境，严格执行全进全出，避免猪舍温度波 动与饲养密度过大。防止低温、低湿的猪舍环境。在低温与低湿环境 下，环境中易形成大量悬浮颗粒与粉尘（直径0.53m）而携带病原 菌进入肺脏。提高饲养水平和促进群体健康状态，能大大的降低猪只的易感性和发病率;疫苗免疫：目前已商品化的APP疫苗包括全菌灭活苗与毒素亚单 位疫苗两种。疫苗免疫能够有效降低APP的发病率，但不能改变猪群 对APP的感染状态。因APP的血清型较多，世界各地所流行的菌型有 所不同，如北美以1、5、7 三个血清型为主，而欧洲多以2 型为主， 我国以 1、3、4、5、7 型为主12。且各血清型间的交叉保护力有限， 故有时免疫效果不佳，目前我国规模化猪场对 APP 免疫的比例不高。 此外，疫苗免疫对不可以区分APP感染动物和疫苗免疫动物的血清学 监测结果解读会产生影响（基于荚膜脂多糖）。美国 IDEXX 公司已开发 出 APP ApxIV 新型 ELISA 抗体试剂盒，未感染的免疫动物抗体检测结 果为阴性，所有血清型APP（包括低致病力菌株）感染动物检测为抗体 阳性，通过S/P值的水平、S/P值的分布/变化，可针对性分析猪群 APP 的感染风险、评估临床稳定状况、疫苗免疫评估和预警。药物防控：种猪是最重要的APP病原携带者，策略性、阶段性有 效的药物可以大大减低阳性猪病原的排出，减少临床感染;急性型APP 可能会影响患猪的饮欲与食欲，故对患猪进行早期诊断并使用注射剂 治疗尤为重要，如头孢噻呋、恩诺沙星等，但注射给药对患猪应激较 大，是双刃剑，可能会导致患猪死亡率增加。若能及时判断猪群发病 阶段，识别环境中的致病因素，在饲料中进行策略性给药将能有效防 控本病，常用药物包括：替米考星200400克/吨饲料;氨苄西林 200400克/吨饲料等。因本病发病非常快，且会影响患猪食欲，常 认为饲料中给药防控会效果不佳，但国内外的临床实践证明，每吨饲 料中添加200400克替米考星可有效防控本病。