还原糖含量的测定—直接滴定法

实验六 乳粉中还原糖含量的测定直接滴定法（GB/T5009.72003 第一法）教学目的要求：基本知识点1、掌握直接滴定测定还原糖的原理、基本过程和操作关键 2、熟练称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。重点：1、熟练称量、过滤、定容、滴定等基本操技术 2、直接滴定测定还原糖的原理、基本过程和操作关键。直接滴定测定还原糖的原理和控制要点课时教学方案：复习与提问： 1、检查实验准备情况， （1）实验内容；（2）实验仪器与试剂有哪些？（3）直接滴定测定还原糖的步骤。 2、直接滴定测定还原糖的注意事项和控制要点【引入新课】孚L糖是半乳糖经P-1,4糖苷键与葡萄糖结合的还原性二糖，称为4-O-P -d吡喃半乳糖-d-吡喃葡萄糖，还原基在葡萄糖单位上。乳糖有两种异构体， 即a-乳糖和0-乳糖。乳糖 是唯一没有在植物中发现的糖，因首次在牛乳中发现，故称为乳糖。 乳糖是哺乳动物乳汁的主要成分，如人乳中约含6%7%,牛乳中约含5%。 乳糖是婴儿主要食用的糖类物质。初生婴儿仅能消化乳糖、蔗糖、葡萄糖、果 糖，对淀粉不易消化，故米、面淀粉食物应在34个月后才开始添加。乳糖 对婴儿的重要意义还在于它能够保持肠道中最合适的肠菌种数，并能促进钙的 吸收。随着年龄的增大，肠道中将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖的乳糖酶活性急 剧下降，甚至在某些个体中几乎降到0 ，因而成年人食用大量的乳糖，不易消 化，食物中乳糖含量高于15%时可导致渗透性腹泻。一、目的要求1、理解直接滴定法测定还原糖的原理及操作要点；2、熟练称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。二、实验原理 试样经除去蛋白质后，在加热条件下，以次甲基蓝作指示剂，滴定标定过 的碱性酒石酸铜溶液（用还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液），还原糖将 溶液中的二价铜还原成氧化亚铜。以后稍过量的还原糖使次甲蓝指示剂褪色， 表示终点到达。根据试样溶液消耗体积，计算还原糖量。反应方程式如下：CuSO4+2NaOH=Cu（OH）2 I +Na2SO4COON4aCO2ONa 2 4CHOHCHO1+Cu(OH)2= 1Cu +2H2OCHOHCHO/COOKCOOKCOONaCOONa1CHO1CHOHCHO1CHOH12 1Cu +(CHOH)4 +2H2O=2 1+(CHOH)4+Cu2OI42CHO/1CHOH1CH2HO1CH2OHCOOKCOOK亚甲蓝氧化型+还原糖亚甲蓝还原型（蓝色）（无色）三、实验试剂（GB/T5009.7-2003食品中还原糖的测定）1、盐酸。2、碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜（CuSO5H0）及0. 05g次甲基42蓝，溶入水中并稀释至1000mL。3、碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中， 再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000mL，贮存于橡胶塞玻璃 瓶内。4、乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌口 3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至 100mL。5、亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100mL。6、葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g经过96C2C干燥2h的纯葡萄 糖，加水溶解后加入5mL盐酸，并以水稀释至lOOOmL。此溶液每mL相当于 1.0mg 葡萄糖。提示：（1）此法所用的氧化剂碱性酒石酸铜的氧化能力较强，醛糖和酮糖都能 被氧化，所测得是总还原糖含量。（2 ）本法是根据经过标定的一定量的碱性酒石酸铜溶液（Cu2+量一定） 消耗的试样溶液量来计算试样溶液中的还原糖的含量，反应体系中 Cu2+ 的含 量是定量的基础，所以在试样处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免试样溶液 中引入 Cu2+ ，得到错误的结果。（3）次甲基蓝本身也是一种氧化剂，其氧化型为蓝色，还原型为无色； 但在测定条件下，它的氧化能力比CU2+弱，故还原糖先与CU2+反应，CU2+ 完全反应后，稍微过量一点的还原糖将次甲基蓝指示剂还原，使之由蓝色变为 无色，指示滴定终点。（4）为消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰，在碱性酒石酸铜乙液 中加入少量亚铁氰化钾，使之与Cu2O生成可溶性的无色配合物，而不再析出 红色沉淀，其反应式如下：CU2O+K4Fe（CN）6+H2O=K2Cu2Fe（CN）6+2KOH（52）碱性4 酒石酸铜6 甲2液和乙2液应2 分别贮6存，用时才混合，不能事先混合 贮存。否则酒石酸钾钠铜配合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉 淀，使试剂有效浓度降低。结合实验想一想：（1）以上列举试剂全面吗？（2）碱性酒石酸铜甲液中加入次甲基蓝的目的是什么？（3）碱性酒石酸铜乙液中加入亚铁氰化钾的目的是什么？（4）碱性酒石酸铜甲液和乙液为什么不能提前混合？（5）直接滴定法和高锰酸钾法中碱性酒石酸铜溶液的配制方法一致吗？（6）葡萄糖标准溶液配制中加入盐酸的作用是什么？四、实验仪器1、分析天平；3、50mL小烧杯；5、lOOmL量筒，1个/2组；7、25mL酸式滴定管1支/组;9、10mL移液管1支/2组；11、小玻璃棒1根/组；13、可调电炉；2、牛角匙；4、250mL容量瓶；6、250mL锥形瓶3只；8、5mL移液管4支/2组；10、干燥滤纸3张，漏斗1个/组12、玻璃珠：9颗/组 ；结合实验想一想：以上列举仪器全面吗？各种仪器在实验中用于什么？五、操作步骤（一）试样处理称取约2.50g 5.00g试样，置于250mL容量瓶中，加50mL水，摇匀后慢 慢加入5mL乙酸锌溶液，混匀放置片刻，加入5mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻 度，混匀，沉淀、静置30min,用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，滤液备用。提示： 醋酸锌及亚铁氰化钾作为蛋白质沉淀剂，这两次种试剂混合形成白色的氰 亚铁酸锌沉淀，能使溶液中的蛋白质共同沉淀下来，主要用于乳制品及富含蛋 白质的浅色糖液，其澄清效果较好。建议:考虑到最后试样滴定与标定体积接近，称乳粉样为2.502.60g，最 后定容至500mL ,滴定体积约为10mL ,标定约10.30mL想一想：(1)试样用什么天平称量？(2 ) 50mL水、5mL乙酸锌溶液、5mL亚铁氰化钾溶液分别用什么量 取？(3 )为什么要静置30min ;用干燥滤纸过滤；弃去初滤液？(二) 标定碱性酒石酸铜溶液吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液及5.0mL乙液，置于150mL锥形瓶中，加 水10mL，加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加约9mL葡萄糖，控制在2min内加 热至沸，趁沸以每两秒 1 滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚 好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其 平均值，计算每10mL (甲、乙液各5mL)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖 的质量或其他还原糖的质量 ( mg)。A = CV式中：A10mL (甲、乙液各5mL)碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖 的质量(mg)；C一葡萄糖标准溶液的浓度，mg/ mL；V标定时消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。提示：滴定时要保持沸腾状态，使上升蒸汽阻止空气侵入滴定反应体系中，一方 面，加热可加快还原糖与CU24的反应速度；另一方面，次甲基蓝的变色反应 是可逆的，还原型次甲基蓝遇到空气中的氧时又会被氧化为其氧化型，再变为 蓝色。此外，氧化亚铜也极不稳定，容易与空气中的氧结合而被氧化，从而增 加还原糖的消耗量。想一想：(1) 5.0mL碱性酒石酸铜甲液及5.0mL乙液怎样量取？(2) 在重复三次滴定中使用不同规格的锥形瓶对测定有影响吗？(3) 这一环节的操作关键是什么？(4) 为什么要在加热至沸腾状态下进行滴定？(5) 加入玻璃珠的作用是什么？(三) 试样溶液预测吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液及5.0mL乙液，置于150mL锥形瓶中，加水 10mL ，加入玻璃珠 2 粒，控制在 2min 内加热至沸，趁沸以先快后慢的速 度，从滴定管中滴加试样溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以 每两秒 1 滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。 当样液中还原糖浓度过高时应适当稀释，再进行正式测定，使每次滴定消耗样 液的体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时消耗的还原糖标准溶液的体积相 近，约在 10mL 左右。提示：1、当浓度过低时，则采取直接加入10mL试样液，免去加水10mL，再 用还原糖标准溶液滴定至终点，记录消耗还原糖标准溶液的体积。2、预测定的目的：对试样溶液中还原糖浓度有一定要要求（0.1%左右）， 测定时试样溶液的消耗体积应该与标定葡萄糖标液的消耗体积相近，通过测定 了解试样浓度是否合适，浓度过大或过小应该加以调整，使测定时消耗试样溶 液量在 10mL 左右；二是通过测定可知道此溶液的大概消耗量，以便在正式 的滴定时，预先加入比实际用量少1mL左右的样液，只留下1mL左右的样 液在续滴定时加入，以便保证在1min内完成续滴定工作，提交预测定的准确 度。想一想：为什么要进行预测？（四）试样溶液测定吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液及5.0mL乙液，置于150mL锥形瓶中，加 水10mL,加入玻璃珠2粒，从滴定管滴加比预测体积少1mL的试样溶液至锥 形瓶中，使在 2min 内加热至沸，趁沸继续以每两秒 1 滴的速度滴定，直至蓝 色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作三份，得出平均消耗体 积。注意观察：当滴定结束后，溶液放置一定时间，颜色发生的什么变化？2、为什么在整个滴定过程中要保持溶液一直呈沸腾状态？六、数据记录与计算（一）数据记录123平均值标定时匍萄糖用量，mL10mL碱性酒石酸铜相当于匍萄糖的量，mg测定时消耗试样溶液的量，mL称取试样质量，g二）结果计算试样中还原糖（以葡萄糖计）的含量为：X 二.X100m x V v x/vo式中：x试样中还原糖（以葡萄糖计）含量，g/100g；A10 mL碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各5 mL）相当于葡萄糖的质量, mg；m一试样质量，g；V测定时平均消耗试样溶液体积，mL；V。一试样液总体积，mL；注意：计算结果保留到小数点后一位想一想：1、公式中各种数字和符号的意义！2、试样中被测组分越多，V值越？（大小）要求：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。七、说明1、还原糖在碱性溶液中与硫酸铜的反应并不符合当量关系，还原糖在此 反应条件下将产生降解，形成多种活性降解物，反应教程极为复杂，并非如反 应中所反应的那么简单。在碱性及加热条件下，还原糖将形成某些差向异构体 的平衡体系。如D-葡聚糖向D-甘露糖、D-果糖转化，构成三种物质的平衡混 合物，及一些烯醇式中间体，如1， 2-烯二醇， 2， 3-烯二醇， 3， 4-烯二醇等。 这些中间体可进一步促进葡萄糖的异构化，同时可进一步降解形成活性降解 物，从而构成了整个反应的平衡体系。其构成的组分及含量，与实验条件有关， 如碱度、加热程度等。但实践证明，只要严格遵守实验条件，分析结果的准确 度及精密度是可以满足分析要求的。2、此实验影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、 热源强度， 煮沸 时间和滴定速度，一般煮沸时间短消耗糖多，反之，消耗糖液少；滴定速度过 快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。另外溶液碱度愈高，二价铜的还原愈快， 因此必须严格控制反应的体积，使反应体系碱度一致。（1）热源一般采用 800W 电炉，反应液在 2秒内沸腾。（2）控制锥形瓶内液体在 2min 内加热至沸腾。（3）1min 内滴定结束；（4）整个滴定过程一直保持沸腾状态；（5）平行实验误差不超过 0.1mL。（6）加热沸腾后，要始终保持在微沸状态下滴定。继续滴定至终点的体 积（mL），应控制在0.5至1 mL以内。3、平行试验试样溶液的消耗量相差不应超过O.lmL。滴定时，先将所需 体积的绝大部分先加入至碱性酒石酸铜试剂中，使其充分反应，仅留1 mL左 右用滴定方式加入，而不是全部由滴定方式加入，其目的是使绝大多数试样溶 液与碱性酒石酸铜在完全相同的条件下反应，减少因滴定操作带来的误差，提 高测定精度。4、试样液中还原糖的浓度不宜过高或过低，根据预测试验结果，调节试 样中还原糖的含量在 1mg/mL。5、滴定终点蓝色褪去后，溶液呈现黄色，此后又重新变为蓝色，不应再 进行滴定。因为亚甲蓝指示剂被糖还原后蓝色消失，当接触空气中的氧气后， 被氧化重现蓝色。6、还原糖与碱性酒石酸铜试剂反应速度较慢，必须在加热至沸的情况下 进行滴定。为防止烧伤及便于滴定工作，可于管尖部加接一弯形尖管，规格及 安装如图所示，并戴上手套操作。7、碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别配制，分别贮存，不能事先混合贮存。 否则酒石酸钾钠铜配合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使 试剂有效浓度降低。八、实验结果与分析讨论（一）检测结果及质量评价 说明检测结果，根据检测结果和产品质量标准，对试样质量作出评价。（二）分析讨论试分析实验中可能导致误差的因素及应对措施？九、思考题（一）判断（下列说法正确的打“V”，错误的打“X” ）1、直接滴定法测定还原糖的结果代表试样中的总还原糖含量。（ ）2、直接滴定法测定还原糖是根据经过标定的一定量的碱性酒石酸铜溶液 （Cu2+量一定）消耗的试样溶液量来计算试样溶液中的还原糖的含量，反应体系中CU2+的含量是定量的基础，所以在试样处理时，不能用铜盐作为澄清剂， 以免试样溶液中引入CU2+，得到错误的结果。（）3、直接滴定法测定还原糖在碱性酒石酸铜乙液中加入少量亚铁氰化钾的 目的是为消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰，使之与Cu2O生成可溶性 的无色配合物，而不再析出红色沉淀。（ ）4、碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，不能事先混合贮存。否则酒石 酸钾钠铜配合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效 浓度降低。（ ）（二）填空1、直接滴定法测定还原糖滴定时要保持沸腾状态，目的有三，一是：加 热可加快还原糖与CU2+的反应速度；二是：上升蒸汽阻止空气侵入滴定反应体 系中，防止还原型次甲基蓝遇到空气中的氧时又会被氧化为其氧化型，再变为 蓝色;三是：防止氧化亚铜与空气中的氧结合而被氧化，从而增加还原糖的消 耗量。2、预测定的目的有二，一是本法对试样溶液中还原糖浓度有一定要要求（0.1%左右），测定时试样溶液的消耗体积应该与标定葡萄糖标液的消耗体积 相近，通过测定了解试样浓度是否合适，浓度过大或过小应该加以调整，使测 定时消耗试样溶液量在10mL左右；二是通过测定可知道此溶液的大概消耗量， 以便在正式的滴定时，预先加入比实际用量少1mL左右的试样溶液，只留下 1mL左右的试样溶液在续滴定时滴入，以便保证在1min内完成续滴定工作， 提高预测定的准确度。（三）简答题：影响直接滴定法测定还原糖测定结果准确度的因素有哪 些？此法中影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度，煮沸时间 和滴定速度。 反应的碱度直接影响Cu2+与还原糖反应的速度、反应进行的程度及测定 结果。在一定范围内，溶液碱度越高，Cu2+的还原越快。因此，必须严格控制 反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。 锥形瓶壁厚和热源的稳定程等，对测定精密度影响很大，因此，在标定、 预测、测定过程中，其实验条件都应力求一致。热源温度应控制在使溶液在2min内加热达到沸腾状态，且所有测定均应 保持一致。否则加热至沸腾所需时间不同，引起蒸发量不同，使反应碱度发生 变化，从而引入误差。 沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗还原糖 液多，反之，消耗还原糖液少；滴定速度过快，消耗还原糖时多，反之，消耗 还原糖量少。1min内滴定结束； 整个滴定过程一直保持沸腾状态；继续滴定至终点的体积（mL），应控 制在0.5至1 mL以内。高锰酸钾滴定法（一）原理 试样经除去蛋白质后，其中还原糖把铜盐还原为氧化亚铜，加硫酸铁后， 氧化亚铜被氧化为铜盐，以高锰酸钾溶液滴定氧化作用后生成的亚铁盐，根据 高锰酸钾消耗量，计算氧化亚铜的含量，再查表得还原糖量。（1）将一定量的试样溶液与过量的碱性酒石酸铜溶液反应，还原糖将CU2+ 还原为氧化亚铜，过滤后，得到氧化亚铜沉淀；CuSO +2NaOH二Cu(OH) I +Na SOCTOONa4 2 2 4TONaCHOHTCHOHTCOOK+Cu(OH)=2CHOT Cu +2HOCHO/ 2COOKCHO1(CHOH)+CuOII 4 2CHOH2COONaCOONaICHO|CHOICHOHICu + (CHOH) +2HO=2 I+42CHO/ICHOHICHHOICOOK2COOK2)向氧化亚铜沉淀中加入过量的酸性硫酸铁溶液，氧化亚铜被氧化溶解，而三价铁则被还原为亚铁盐；Cu O+Fe (SO ) +H SO -2CuSO +2FeSO +H O(32)再用2高锰4 酸3 钾2 标4准溶液滴4 定所生4成2的亚铁盐，根据高锰酸钾溶液消耗 量可计算出氧化亚铜的量。再从检索表中查出与氧化亚铜量相当的还原糖量， 即可计算出试样中还原糖含量。lOFeSO +2KMnO +8H SO 5Fe (SO ) +2MnSO +K SO +8H O4 4 2 4 2 4 3 4 2 4 2由反应式可见：5molCU O相当于2mol的KMnO，则氧化亚铜的g当量为:245X 143.08:2X 158.03=X:158.03/5X=7l.54式中：158.O3KMnO摩尔质量；143.08Cu O 的摩尔质量；2158.03/5KMnO 的 mg 当量.4即:1mL高锰酸钾标准溶液c(1/5KMnO4)=1.000mol/L相当于71.54 mg氧 化亚铜。故，已知高锰酸钾滴定量就可折算成氧化亚铜量，再由氧化亚铜相当还原 糖量检索表查出相当于还原糖量。(二)说明1、此法以高锰酸钾滴定反应过程中产生的定量的硫酸亚铁为结果计算的 依据，因此，在试样处理时，不能用乙酸锌和亚铁氰化钾作为糖液的澄清剂， 以免引入Fe2+，造成误差。2、测定时必须严格按规定的操作条件进行，必须使加热至沸腾时间及保 持沸腾时间严格保持一致。即必须控制好热源强度，保证在加入碱性酒石酸铜 甲、乙液后，在4min内加热至沸，并使每次测定的沸腾时间保持一致，否则 误差较大。